Synthese, karakterisering en evaluatie van redox-gevoelige chitosan-oligosaccharidenanodeeltjes gecoat met fycocyanine voor medicijnafgifte

Materialen en methoden

Materialen

CUR werd gekocht van Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China). COS werd verkregen van Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. PC werd verkregen van Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. 3.3-dithiodipropionzuur werd verkregen van Adamas Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Verkoold carbodiimidehydrochloride (EDCI), dimethylaminopyridine (DMAP), tetrahydrofuran (THF), oxalylchloride en biotine werden verkregen van Aladdin Chemistry Co., Ltd. L-Glutathione (GSH) en Hoechst 33342 werden verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai , China). Dialysezakken (MWCO 300 Da) werden verkregen van Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. Formamide werd bereid door Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. Gedeïoniseerd water werd zelfgemaakt in het laboratorium.

Een A549-cellijn (menselijke longcarcinoomcellen) (Bena Culture Collection (Beijing, China)) werd gekozen om de cytotoxiciteit van de nieuwe nanodrager te evalueren. A549-cellen werden gekweekt in DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd. (Shangdong, Yantai, China)). Foetaal runderserum (FBS) werd verkregen van Hyclone (Logan, UT, VS). Penicilline en streptomycine werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Shanghai, China). 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) werd ook verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Synthese van CUR-BCSC@pc's

De synthetische routes die worden gebruikt om CUR-BCSC@PC's te bereiden, worden getoond in Fig. 2. De gedetailleerde experimentele procedures worden hieronder beschreven.

Synthetische route van COS-S-S-CUR, BCSC en Biotin-COS

Synthese van COS-S-S-CUR

3.3-dithiodipropionzuur-gefunctionaliseerd COS werd gesynthetiseerd door verestering gekatalyseerd door zuurchloride via een tweestapsreactie.

Stap 1:3,3-dithiodipropionzuur (42,05 mg, 0,25 mmol) en droge THF (4 mL) werden geladen in een bruine rondbodemkolf, met een roerder om het zuur op te lossen. Vervolgens werd oxalylchloride (0,3 urn) verdund met THF toegevoegd aan een kolf die in een ijsbad werd geplaatst. De reactie werd op 35°C gehouden. Na 3 uur roeren werd het niet-gereageerde oxalylchloride verwijderd door roterende verdamping. Product 1 werd bereid door de bovenstaande stappen. CUR werd opgelost in 3 mL THF, dat 34  μL triethylamine bevat, dat druppelsgewijs werd toegevoegd aan de kolf met product 1 onder ijsbadomstandigheden en vervolgens gedurende 15 min werd geroerd. Vervolgens werd het mengsel gedurende 6 uur bij 50°C onder een stikstofatmosfeer geroerd. Het verkregen product werd onderworpen aan roterende destillatie om triethylamine en THF te verwijderen en werd vervolgens gezuiverd door kolomchromatografie om het zuivere product HOOC-S-S-CUR te verkrijgen.

Stap 2:Het zuivere product HOOC-S-S-CUR werd geactiveerd met EDCI (1,2 eq) en DMAP (1,2 eq) in formamide gedurende 2 h. Vervolgens werd COS opgelost in 4 mL formamide toegevoegd en 12 uur bij 55°C geroerd. Nadat de reactie was voltooid, werd de oplossing gedialyseerd met een dialysezak (MWCO 300 Da) en 12 h gevriesdroogd.

Synthese van BCSC en Biotine-COS

In het kort werden biotine, EDCI en DMAP opgelost in 3  ml formamide en overgebracht in een bruine rondbodemkolf. Na 2 uur roeren bij 30 °C werd COS-S-S-CUR opgelost in 3 ml formamide en druppelsgewijs toegevoegd aan de kolf. De reactie werd 2 dagen op 45°C gehouden. De eindproducten werden gedialyseerd (MWCO 300 Da) in gedeïoniseerd water en ondergingen centrifugatie en lyofilisatie om redox-gevoelige BCSC te verkrijgen. Bovendien werd de synthese van biotine-COS met dezelfde methode uitgevoerd om biotine aan de COS-ketens te koppelen.

¹ H-NMR van COS-S-S-CUR, BCSC en biotine-COS werden gemeten met een mengsel van DMSO-D₆ en D₂ O als het oplosmiddel.

Voorbereiding van CUR-geladen BCSC-micellen (CUR-BCSC's)

CUR-BCSC's werden bereid via de zelfassemblagemethode. Tien milligram BCSC werd opgelost in 4 mL formamide en vervolgens gemengd met 1  mL CUR-oplossing (1  mg / ml) die werd opgelost in formamide. De gemengde oplossing werd gedialyseerd met behulp van een dialysezak (MWCO 300 Da) in gedeïoniseerd water gedurende 24 u en het gedeïoniseerde water werd elke 2 u ververst. CUR-BCSC's werden gefiltreerd met millipore-membranen van 800 nm, 450 nm en 220 nm.

Voorbereiding van CUR-BCSC@pc's

De bereide CUR-BCSC's werden gemengd met een waterige oplossing van PC (1,0 mg/ml) en gedurende 30 min bij 4 °C geïncubeerd. Vervolgens werd PC verwijderd met behulp van een centrifugaalfilter van 100 kDa en driemaal gespoeld met water. Het eindproduct (CUR-BCSC@PC) werd voor verder onderzoek bij 4°C in het donker bewaard.

Karakteriseringen

Dynamische laserverstrooiing (DLS) metingen werden uitgevoerd op een Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) om de deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en polydispersiteitsindex (PI) te observeren. De morfologie van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's werd bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan) metingen.

Encapsulation Efficiency (EE) en Drug Loading Capacity (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) werd gebruikt om de EE en DL van nanodeeltjes te bepalen. Eerst werd 2 mL CUR-BCSC's of CUR-BCSC@PC's gemengd met 3 mL acetonitril en gedemulgeerd met ultrageluid, waarin acetonitril vervolgens werd toegevoegd tot 10  mL. Vóór de meting de kolomtemperatuur van de Phenomenex C18-kolom (250 mm × 4. 6 mm, 5 um) werd afgesteld op 25 °C, terwijl de stroomsnelheid van de mobiele fase werd ingesteld op 1,0 mL·min ^− 1 . De verhouding van 0,5% ijsazijn tot acetonitril was 40:60 (v/v). In het detectieproces, met een detectiegolflengte van 425 nm, werd 20 μL aan monsters geïnjecteerd [30]. De volgende formule is gebruikt om de EE en DL te berekenen:

In vitro stabiliteitstest

Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die GSH (0, 20 M, 10  mM) bevatte, werd bereid en gedurende 4 uur behandeld met CUR-BCSC@PC's om de veranderingen in deeltjesgrootte onder verschillende concentraties glutathion bij 37 °C waar te nemen. Bovendien werd de hydrodynamische diameter van CUR-BCSC@PC's onderzocht in PBS-oplossing met behulp van een Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) bij 37 ° C op verschillende tijdstippen (4, 8, 12 en 24 h).

In vitro CUR-afgifte van CUR-BCSC@pc's

Het in vitro CUR-afgiftegedrag van CUR-BCSC@PC's werd onderzocht met behulp van de dialysemethode. PBS-oplossingen die glutathion bevatten (GSH:20 mol/L, 1 mmol/L, 5 mmol/L, 10 mmol/L) werden bereid en 0,5% Tween 80 werd toegevoegd. PBS-buffer (45 mL), die verschillende concentraties GSH bevat, werd toegevoegd aan centrifugebuizen van 50 m; vervolgens werd in elke centrifugebuis een dialysezak met 1 l CUR-BCSC@PC's geplaatst, die bij 37 ° C werd geschud. Op verschillende tijdstippen (0,2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h) werd 2 ml afgiftemedium verzameld en werd vers afgiftemedium van hetzelfde type toegevoegd om het volume onveranderd te houden. HPLC werd gebruikt om de concentratie van CUR in het verzamelde afgiftemedium te bepalen.

Celcultuur

De humane longcarcinoom A549-cellen werden gekweekt in DMEM, dat 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bevatte, en bij 37°C geïncubeerd in 5% CO₂ sfeer [31, 32].

In vitro cellulaire proliferatieremming

De in vitro cytotoxiciteit van CUR, BCSC-micellen (BCSC's), CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's tegen de A549-cellijn werd geëvalueerd met behulp van een standaard MTT-assay [33]. De A549-cellen werden gedurende 24 uur in platen met 96 putjes (5000 cellen per putje) gezaaid om aan de wand te hechten. Het oorspronkelijke medium werd weggegooid en vervolgens werd 100 L vers medium met vrije CUR, BCSC's, CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's (0,1, 1, 5, 10, 15 en 20  μg/ml op basis van CUR) toegevoegd en 24 h gekweekt. Putjes zonder toediening werden gebruikt als blanco controles. De cellen werden onderworpen aan een MTT-test door het medium te verwijderen en 20 L MTT-oplossing (5  mg / ml) toe te voegen. Na incubatie gedurende nog eens 4 u bij 37 °C in 5% CO₂ atmosfeer werd de MTT-oplossing vervangen door 150  μL DMSO om het paarse MTT-formazan op te lossen. Vervolgens werd een microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) gebruikt om de absorptie van elk putje bij 570 nm te meten.

In vitro celopname en lokalisatie

Het cellulaire opnamevermogen van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's werd onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Japan). A549-cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes bij 4 × 10 ⁴ cellen per putje en werden samen geïncubeerd met CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's (CUR-concentratie:20 μg/ml) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ voor 1, 2 en 4 h. De A549-cellen werden driemaal gewassen met PBS na het verwijderen van de kweekmedia die geneesmiddelen bevatten. Vervolgens werd PBS met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min toegevoegd en nog drie keer gewassen met PBS. De celkernen werden gekleurd door Hoechst 33342 gedurende 15 min en waargenomen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Statistische analyse

Alle experimenten werden ten minste drie keer uitgevoerd en uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Statistische tests werden geanalyseerd met behulp van de Student's t test. P < 0,05 was ingesteld als statistisch significant, en P < 0,01 werd als zeer significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Karakterisatie van COS, COS-S-S-CUR, Biotin-COS en BCSC

De belangrijkste karakteristieke resonanties van CUR en CH₂ -S-S-CH₂ verscheen op de ¹ H-NMR-spectrum van COS-S-S-CUR, wat de succesvolle conjugatie van CUR aan de COS-ketens aantoont. Vergeleken met de pieken van COS in figuur 3(A), werden de karakteristieke signalen van CUR gepresenteerd in figuur 3(B) waargenomen in het gebied tussen 6,7 en 7,5 ppm en bij 3,75 ppm (−OCH₃ ), terwijl de resonantie van CH₂ -S-S-CH₂ bij 2,5 ppm was onveranderd. Zoals weergegeven in (Fig. 3(C), a, b), de pieken van biotine op de ¹ Het H-NMR-spectrum van biotine-COS was 0,99 ppm (−CH₂ –) en 3,39 ppm (−CH–S–). ¹ H-NMR-spectrum van BCSC wordt getoond in figuur 3(D). De resonanties van CUR (Fig. 3(D), a, e) werden gezien in de corresponderende posities, en de karakteristieke piek van CH₂ -S-S-CH₂ (Fig. 3 (D), b) werd opnieuw waargenomen bij 2,5 ppm. Bovendien verifieerde het verschijnen van signalen bij piek 0, 09 ppm en 3,39 ppm (Fig. 3 (D), c, d) het bestaan ​​​​van biotine gekoppeld aan de COS-S-S-CUR-ketens. De karakteristieke resonanties van CUR, CH₂ -S-S-CH₂ , en biotine zoals getoond in Fig. 3(D) komen overeen met die in Fig. 3(B) en Fig. 3(C), wat aangeeft dat het amfifiele materiaal BCSC met succes is gesynthetiseerd.

De ¹ H-NMR-spectra van COS (A ), COS-S-S-CUR (B ), Biotine-COS (C ), en BCSC (D )

Karakterisering van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's

De morfologieën van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's werden bestudeerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Fig. 4(A, B)). CUR-BCSC's vertoonden een gladde bolvorm (Fig. 4(A), a) onder elektronenmicroscopie, terwijl CUR-BCSC@PC's een ongeveer bolvorm bezaten met de bloeiende laag rond de CUR-BCSC@PC's (Fig. 4(B) ), B). Dit gaf aan dat PC een eiwitcoronastructuur vormde door de oppervlakken van CUR-BCSC's te bedekken. Een duidelijk Tyndall-effect van CUR-BCSC@PC's werd waargenomen vanwege het bestaan ​​van royale nanodeeltjes (Fig. 4(C)). De deeltjesgrootte, PI, zeta-potentiaal, DL (%), en EE (%) van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's worden geïllustreerd in Tabel 1. In Fig. 5 is de gemiddelde grootte van CUR-BCSC's en CUR- BCSC@PC's waren respectievelijk 97,8 ± 4,2 nm en 160,3 ± 9.0 nm. Ondertussen waren de PI-waarden van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's respectievelijk 0,181 ± 0,014 en 0,114 ± 0,024, die kleiner zijn dan 0,2, wat wijst op de uniformiteit van hun afmetingen. De zeta-potentialen van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's waren respectievelijk 21,57 ± 0,53 en 12,90 ± 1,93 mV. Vanwege de elektronegatieve pc-coating was de zeta-potentiaal van CUR-BCSC's hoger dan die van CUR-BCSC@PC's. De EE van CUR-BCSC@PC's was hoger dan die van CUR-BCSC's.

A De TEM-afbeeldingen van CUR-BCSC's en een enkele CUR-BCSC. B De TEM-afbeeldingen van CUR-BCSC@PC's en een enkele CUR-BCSC@PC. C Tyndall-effect en de foto van CUR-BCSC@PC's in water

een De grootteverdeling en het zeta-potentieel van CUR-BCSC's; b De grootteverdeling en het zeta-potentieel van CUR-BCSC@PC's

Stabiliteit van CUR-BCSC@pc's

Zoals getoond in Fig. 6a, werd de binding vanwege de reductieve aard van de disulfidebinding gesplitst in PBS met 10 M GSH, en CUR-BCSC@PC's werden gedesintegreerd in polymeerfragmenten, die agglomereerden om de deeltjesgrootte van de nanodeeltjes te vergroten . In PBS met 20 M GSH waren de veranderingen in deeltjesgrootte echter klein, wat een vergelijkbaar resultaat liet zien als PBS zonder GSH. Zoals geïllustreerd in Fig. 6b, werd de deeltjesgrootte op verschillende tijdstippen gemeten om de stabiliteit van CUR-BCSC@PC's in PBS te bestuderen, en de resultaten toonden aan dat de deeltjesgrootte van CUR-BCSC@PC's in de loop van de tijd langzaam toenam [14].

De stabiliteit van CUR-BCSC@PC's. een Grootteveranderingen van CUR-BCSC@PC's bij verschillende GSH-concentraties. b Grootteveranderingen van CUR-BCSC@PC's in PBS op verschillende tijdstippen

Reductiereactie van CUR-BCSC@pc's

Het is algemeen bekend dat disulfidebindingen onstabiel zijn in een tumor-reducerende omgeving. Onderzoekers hebben disulfidebindingen gebruikt om hydrofiele polymeren en hydrofobe geneesmiddelen te verbinden om amfifiele fragmenten te bereiden, die zichzelf in water kunnen assembleren om nano-micellen te vormen. Vervolgens, volgens verschillen in de fysiologische omgeving en de tumoromgeving, breken disulfidebindingen op de tumorplaats af om medicijnen vrij te maken [34]. In de huidige studie werd in vitro geneesmiddelafgifte uitgevoerd om te verifiëren of CUR-BCSC@PC's een verwachte afgifte-eigenschap konden vertonen. Het reductieresponsvermogen van CUR-BCSC@PC's die disulfidebindingen bevatten, werd onderzocht na de activering van GSH. Zoals getoond in Fig. 7, was de afgifte van CUR uit CUR-BCSC@PC's in het medium met 20 M GSH bij pH 7,4, die de extracellulaire omgeving simuleerde, extreem traag in vergelijking met een omgeving met 10  M GSH bij pH 7,4. Bovendien vertoonden de 1, 5 en 10 mM GSH, vergeleken met het 20 μM GSH-medium, significante verschillen in afgiftegedrag. Met de toename van de GSH-concentratie werd ook de afgifte van CUR uit CUR-BCSC@PC's bevorderd, wat aangeeft dat de geneesmiddelafgifte een reactie was op de GSH-concentratie.

Cumulatieve afgifte van CUR uit CUR-BCSC@PC's bij verschillende GSH-omstandigheden

In vitro cytotoxiciteit

MTT-assay werd uitgevoerd om de cytotoxische effecten van vrije CUR, BCSC's, CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's op A549-cellijnen [35] te onderzoeken. De gegevens over de levensvatbaarheid van de cellen zijn samengevat in Fig. 8. Alle CUR-preparaten vertoonden dosisafhankelijkheid in termen van remming van celproliferatie. Zoals getoond in Fig. 8, had vrij CUR iets minder vermogen om cellulaire proliferatie tegen alle A549-cellen te remmen in vergelijking met CUR-BCSC@PC's en CUR-BCSC's, na incubatie gedurende 24 uur. Voor A549-cellen was de antikankeractiviteit van CUR-BCSC@PC's beter dan die van BCSC's en CUR-BCSC's, wat waarschijnlijk te wijten was aan uitstekende celopname. Bovendien vertoonden CUR-BCSC@PC's een hogere cytotoxiciteitseigenschap dan CUR-BCSC's, wat aangeeft dat PC een mogelijk remmend effect heeft op de proliferatie van A549-cellen.

In vitro cytotoxiciteit van verschillende formuleringen bij 24 h in A549-cellen

In vitro onderzoek naar celopname

Zoals weergegeven in Fig. 8, werden de fluorescentiesignalen van CUR waargenomen in A549-cellen die waren behandeld met CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's (CUR:20 g/ml) bij 1, 2 en 4 h, met behulp van de omgekeerde fluorescentiemicroscoop . CUR, als een groene fluorescentieprobe, was ook een medicijn tegen kanker, dat vaak werd gebruikt als een hydrofoob modelgeneesmiddel om nieuwe en efficiënte medicijnafgiftesystemen te ontwikkelen. Zoals geïllustreerd in figuur 9a, werden zowel CUR-BCSC's als CUR-BCSC@PC's geabsorbeerd in A549-cellijnen en was de opname-efficiëntie tijdsafhankelijk. Vanwege de tot overexpressie gebrachte biotine-receptoren op het oppervlak van kankercellen, hadden biotine-beladen nano-micellen een affiniteit voor A549-cellen. De fluorescentiesignalen van CUR-BCSC@PC's waren hoog bij 4 h, wat wijst op een hoge celopnamesnelheid van CUR-BCSC@PC's. De fluorescentiesignalen van CUR-BCSC@PC's waren hoger bij 4 h dan die bij 1 h of 2 h; dit bewees dat de celopname tijdsafhankelijk was.

een Fluorescerende beeldvorming van de cellulaire opname van CUR-BCSC's en CUR-BCSC@PC's op verschillende tijdstippen. b De cellocatie van CUR-BCSC@PC's om 1 h en 4 h

De kernen van A549-cellen werden gekleurd door Hoechst 33342. Zoals weergegeven in Fig. 9b, werden groene fluorescentiesignalen gezien in het cytoplasma van de 1 h-groep van CUR-BCSC@PC's, en de fluorescentie trad geleidelijk op in de kernen van de 4 h groep CUR-BCSC@PC's, die cellulaire opname aantoonden door caveolae-gemedieerde endocytose.

Conclusies

In deze studie werd een type eiwit-gefunctionaliseerd COS-nanodeeltje bereid door condensatiereacties, zelfassemblerend gedrag en de interactie tussen pc en CUR-BCSC's. Na het vooronderzoek werden de amfifiele dragermaterialen (BCSC's) met redoxgevoeligheid met succes gesynthetiseerd en geverifieerd met behulp van ¹ H-NMR. De oppervlakken van CUR-BCSC's werden gemodificeerd met een laag phycocyanine-corona, die de efficiëntie van de celopname zou kunnen verbeteren en CUR-BCSC@PC's zou beschermen tegen plasma-eiwitadsorptie. De cellulaire cytotoxiciteits- en opnameanalyse gaf aan dat CUR-BCSC@PC's CUR in de A549-cellen kunnen transporteren en een uitstekende antiproliferatieve eigenschap hebben. Gezien het PDT-effect van PC en CUR, zullen we in de volgende fase van dit onderzoek de fotodynamische eigenschappen en antikankeractiviteit van CUR-BCSC@PC's onder fototherapie evalueren. Deze studie maakte de weg vrij voor de verbetering van de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen kanker en de introductie van een functionele eiwitcorona. Samenvattend heeft het biomateriaal voor nanomedicijndragers van CUR-BCSC@PC's op basis van COS met meerdere functies een nieuwe strategie voor tumorbehandeling opgeleverd en geweldige toepassingsvooruitzichten vertoond.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de gegevens die allemaal in dit artikel worden gepresenteerd en getoond.

Afkortingen

BCSC:

Biotine-chitosan-oligosacharide-dithiodipropionzuur-curcumine

COS:

Chitosan-oligosacharide

COS-S-S-CUR:

Chitosan-oligosacharide-dithiodipropionzuur-curcumine

CUR:

Curcumine

CUR-BCSC@PC's:

Met fycocyanine gefunctionaliseerde en met curcumine beladen biotine-chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine-micellen

CUR-BCSC's:

Met curcumine beladen biotine-chitosan-oligosacharide-dithiodipropionzuur-curcumine-micellen

EPR:

Verbeterde doorlaatbaarheid en retentie

PC:

Fycocyanine

PDT:

Fotodynamische therapie