Biotine-gefunctionaliseerde, redox-gevoelige chitosannanodeeltjes gecoateerd met fycocyanine voor gerichte curcumine-afgifte

Samenvatting

In deze studie werden fycocyanine-gefunctionaliseerde en curcumine-geladen biotine-chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine (BCSC) nanodeeltjes, aangeduid als CUR-BCSC@PCs, ontworpen om de biologische compatibiliteit van curcumine (CUR) te verbeteren. De structuur van BCSC werd bevestigd met ¹H-NMR. De CUR-BCSC@PCs, met een gemiddelde hydrodynamische diameter van 160,3 ± 9,0 nm, vertoonden dankzij de biomimetische proteïnecorona een uitstekende stabiliteit en het potentieel om proteïneadsorptie in de bloedsomloop te voorkomen. In vitro-vrijkwaringsproeven toonden aan dat de redox-gevoelige schillen van CUR-BCSC@PCs gevoelig zijn voor hoge concentraties glutathion. Bovendien verhoogden CUR-BCSC@PCs de inhibitieve activiteit op de proliferatie van A549-cellen door de intracellulaire opname van CUR te verbeteren. Deze resultaten wijzen erop dat CUR-BCSC@PCs grote toepassingsmogelijkheden hebben in kankertherapie als effectieve medicijndragers.

Achtergrond

Chitosan-oligosaccharide (COS), met een structuur van β-(1-4)-gelinkte D-glucosaminen, is een depolymerisatieproduct dat hoofdzakelijk wordt verkregen door deacetylatie en enzymatische hydrolyse van chitosan of chitine, afkomstig van arthropodenextskeletten of celwanden van schimmels [1, 2]. Het is opvallend dat zware metalen en kleurstoffen kunnen worden verwijderd door chitosan en de gemodificeerde materialen daarvan, waarbij chitosan fungeert als adsorberend middel [3]. Verschillende studies hebben aangetoond dat COS over diverse biologische eigenschappen beschikt, zoals antikanker, anti-inflammatoir, antioxidatief en immunstimulerend [4]. COS wordt beschouwd als een niet-toxisch draagmateriaal voor geneesmiddelen vanwege de biocompatibiliteit, hoge wateroplosbaarheid en chemische modificeerbaarheid [5, 6].

Om de oplosbaarheid van hydrofobe antikankermiddelen te verbeteren en toxiciteit voor normale weefsels te verminderen, onderzoeken medische onderzoekers copolymeren die zich kunnen zelfassembleren tot micelles met een bepaalde deeltjesgrootte [7, 8]. Deze copolymeerassemblages kunnen het tumordof passief of actief bereiken en penetreren. Micelles bestaan uit twee functionele secties: de kern, waarin hydrofobe geneesmiddelen geencapsuleerd zitten, en de buitenste schil of corona, die de farmacokinetische eigenschappen in vivo reguleert [8]. Wang et al. [9] hechtten deoxycholzuur aan COS-ketens via chemische modificatie om amphiele blokcopolymeren te vormen, die zich in goedkope anorganische oplosmiddelen kunnen zelfassembleren tot micelles. De hydrofobe kern van deze micelles bevatte quercetine, wat de wateroplosbaarheid van antikankermiddelen aanzienlijk verbeterde en daarmee de biobeschikbaarheid van quercetine verhoogde.

Curcumine (CUR) is een van de belangrijkste chemische bestanddelen van kurkuma [10]. In de laatste jaren hebben veel onderzoekers de antikankereigenschappen van CUR bestudeerd, en diverse studies bevestigen dat deze stof de groei van tumorkellen via verschillende signaleringspaden kan beïnvloeden en het immuunsysteem kan versterken [11]. Daarnaast is CUR een fotosensitizer met goede fotodynamische eigenschappen [12]. CUR is dus een veelbelovend middel voor kankertherapie. Echter, de slechte oplosbaarheid, stabiliteit en biobeschikbaarheid beperken de klinische toepassing [13]. Om deze nadelen te verminderen, hebben veel onderzoekers de biobeschikbaarheid van CUR verbeterd via medicijnafgiftesystemen. Bijvoorbeeld, Chen et al. [14] ontwierpen een nieuw type dubbel pH-gevoelige medicijndrager, die de wateroplosbaarheid van CUR verbeterde en de effectiviteit van de tumortreatment verbeterde.

Fycocyanine (PC), hoofdzakelijk verkregen uit cyanobacteriën, is bekend als een wateroplosbaar, lichtharvesterend pigment-eiwit dat een rol speelt bij het vangen en overbrengen van lichtenergie naar chemische energie tijdens de fotosynthese [15]. PC vertoont meerdere biologische eigenschappen, zoals antikanker [16], anti-inflammatoir en antioxidatief, wat veel aandacht trekt in de voedings- en farmaceutische sector [15, 17]. Hao et al. [16] ontdekten dat PC de groei van niet-kleincellige longkankercellen remt door Toll/interleukine-1-receptordomein-bevattend adaptereiwit (TIRAP) te downreguleren. Daarnaast wordt PC ook gebruikt in fotodynamische therapie (FDT) van tumoren als uitstekend middel zonder bijwerkingen [18, 19, 20]. Het gebruik van PC als fluorescente probes vereist conjugatie met specifieke herkenningselementen zoals biotine, antilichamen en streptavidine [21, 22]. Biotine, een wateroplosbaar vitamine, is een essentiële micronutriënt in het menselijk lichaam, met tumor-gerichte eigenschappen [23]. De biotine-specifieke receptor-eiwitten, zoals avidine, neutravidine en streptavidine, zijn hoog overgeëxprimeerd op het oppervlak van verschillende kankercellen in vergelijking met normale cellen [24, 25]. Daarom zijn gebiotineerde nanodeeltjes uitgebreid bestudeerd als medicijndragers via receptor-gemedieerde endocytose [24].

In de huidige studie werd een nieuw type PC-gefunctionaliseerde nanodrager geconstrueerd, en de bereiding van CUR-BCSC@PCs wordt weergegeven in Fig. 1. De disulfidebrug tussen COS en CUR bijdroeg aan de reductieve gevoeligheid van het amphiele dragermateriaal [26]. CUR bevond zich in de hydrofobe binnenkern, beschermd door de COS/PC-schil. De interactie tussen biotine en PC en de elektrostatische interactie, tussen positief geladen COS en negatief geladen PC, werden gebruikt om PC op het oppervlak van CUR-BCSCs te modificeren. CUR-BCSC@PCs worden verwacht tumordofen te bereiken dankzij verbeterde permeabiliteit, het verhoogde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR-effect) en het biotine-receptormediated targetting-effect [27]. In de tumormicro-omgeving, die een hogere glutathionconcentratie heeft dan normale cellen, disintegreerden CUR-BCSC@PCs via thiol-disulfide-uitwisselingsreacties, wat leidde tot een hoge medicijnconcentratie in de tumorcellen [23, 28, 29]. Het CUR-BCSC@PC nano-afgiftesysteem dat in dit artikel wordt beschreven, verbetert niet alleen de biobeschikbaarheid van CUR, maar heeft ook het potentieel om effectief te zijn in de klinische behandeling van tumoren.

Figuur 1. Ontwerp en schematische illustratie van CUR-BCSC@PCs

Materialen en Methodes

Materialen

CUR werd aangeschaft bij Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China). COS werd verkregen van Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. PC werd geleverd door Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. 3,3-Dithiodipropionzuur werd verkregen van Adamas Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Carbodiimide hydrochloride (EDCI), dimethylaminopyridine (DMAP), tetrahydrofuraan (THF), oxaalchloride en biotine werden aangeschaft bij Aladdin Chemistry Co., Ltd. L-Glutathion (GSH) en Hoechst 33342 werden verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Dialysezakjes (MWCO 300 Da) kwamen van Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. Formamide werd bereid door Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. Gedemineraliseerd water werd in het laboratorium zelf gemaakt.

Een A549-cellijnen (humane longcarcinoomcellen) (Bena Culture Collection (Peking, China)) werd gekozen om de cytotoxiciteit van de nieuwe nanodrager te evalueren. A549-cellen werden gekweekt in DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd. (Shandong, Yantai, China)). Foetaal kalverseerum (FKS) werd verkregen van Hyclone (Logan, UT, VS). Penicilline en streptomycine werden aangeschaft bij Sigma-Aldrich (Shanghai, China). 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) werd eveneens verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Synthese van CUR-BCSC@PCs

De synthetische routes voor de bereiding van CUR-BCSC@PCs worden weergegeven in Fig. 2. De gedetailleerde experimentele procedures worden hieronder beschreven.

Figuur 2. Synthetische route van COS-S-S-CUR, BCSC en Biotine-COS

Synthese van COS-S-S-CUR

3,3-Dithiodipropionzuur-gefunctionaliseerd COS werd gesynthetiseerd door esterificatie gekatalyseerd door zuurchloride via een tweestapsreactie.

Stap 1: 3,3-Dithiodipropionzuur (42,05 mg, 0,25 mmol) en droog THF (4 mL) werden in een bruine rondbodematras met een roerstab gebracht om het zuur op te lossen. Vervolgens werd oxaalchloride (0,3 mmol) gedilueerd met THF aan de matras toegevoegd, geplaatst in een ijskelder. De reactie werd gehandhaafd bij 35 °C. Na 3 uur roeren werd het ongereageerde oxaalchloride verwijderd door rotatieverdamping. Product 1 werd verkregen via de bovenstaande stappen. CUR werd opgelost in 3 mL THF, met 34 μL triethylamine, dat druppelgewijs werd toegevoegd aan de matras met product 1 onder ijskelderomstandigheden en vervolgens 15 min gerord. Daarna werd het mengsel gerord bij 50 °C onder stikstofatmosfeer gedurende 6 uur. Het verkregen product werd onderworpen aan rotatiedestillatie om triethylamine en THF te verwijderen en vervolgens gezuiverd door kolomchromatografie om het zuivere product HOOC-S-S-CUR te verkrijgen.

Stap 2: Het zuivere product HOOC-S-S-CUR werd geactiveerd met EDCI (1,2 eq) en DMAP (1,2 eq) in formamide gedurende 2 uur. Vervolgens werd COS opgelost in 4 mL formamide toegevoegd en 12 uur gerord bij 55 °C. Na voltooiing van de reactie werd de oplossing gedialyseerd met een dialysezakje (MWCO 300 Da) en 12 uur vriesgedroogd.

Synthese van BCSC en Biotine-COS

Kortweg: biotine, EDCI en DMAP werden opgelost in 3 mL formamide en overgebracht naar een bruine rondbodematras. Na 2 uur roeren bij 30 °C werd COS-S-S-CUR opgelost in 3 mL formamide en druppelgewijs aan de matras toegevoegd. De reactie werd gehandhaafd bij 45 °C gedurende 2 dagen. De eindproducten werden gedialyseerd (MWCO 300 Da) in gedemineraliseerd water en ondergingen centrifugatie en lyofilisatie om redox-gevoelige BCSC te verkrijgen. Daarnaast werd de synthese van biotine-COS uitgevoerd volgens dezelfde methode om biotine aan de COS-ketens te koppelen.

¹H-NMR van COS-S-S-CUR, BCSC en biotine-COS werden gemeten met een mengsel van DMSO-D₆ en D₂O als oplosmiddel.

Bereiding van CUR-geladen BCSC-micellen (CUR-BCSCs)

CUR-BCSCs werden bereid via de zelfassemblage-methode. Tien milligram BCSC werd opgelost in 4 mL formamide en vervolgens gemengd met 1 mL CUR-oplossing (1 mg/mL) die in formamide was opgelost. De mengseloplossing werd gedialyseerd met een dialysezakje (MWCO 300 Da) in gedemineraliseerd water gedurende 24 uur, waarbij het gedemineraliseerde water elke 2 uur werd ververst. CUR-BCSCs werden gefiltreerd met millipore-membraan van 800 nm, 450 nm en 220 nm.

Bereiding van CUR-BCSC@PCs

De bereide CUR-BCSCs werden gemengd met een waterige oplossing van PC (1,0 mg/mL) en 30 min geïncubeerd bij 4 °C. Vervolgens werd PC verwijderd met een 100 kDa centrifugefilter en driemaal met water gespoeld. Het eindproduct (CUR-BCSC@PC) werd opgeslagen bij 4 °C in het donker voor verder onderzoek.

Karakterisaties

Dynamische laserspreiding (DLS) metingen werden uitgevoerd op een Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) om de deeltjesgrootte, zetapotentiaal en polydispersiteitsindex (PI) te observeren. De morfologie van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs werd bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japan) metingen.

Encapsulatie-efficiëntie (EE) en Medicijnladingscapaciteit (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) werd gebruikt om de EE en DL van de nanodeeltjes te bepalen. Eerst werd 2 mL CUR-BCSCs of CUR-BCSC@PCs gemengd met 3 mL acetonitrile en gedemulsificeerd door ultrasoon, waarna acetonitrile tot 10 mL werd aangevuld. Voor de meting werd de kolomtemperatuur van de Phenomenex C18-kolom (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ingesteld op 25 °C, terwijl de stroomsnelheid van de mobile fase werd ingesteld op 1,0 mL·min⁻¹. De verhouding van 0,5% azijnzuur tot acetonitrile was 40:60 (v/v). Tijdens de detectie, met een detectiegolflengte van 425 nm, werden 20 μL van de monsters geïnjecteerd [30]. De volgende formules werden gebruikt om de EE en DL te berekenen:

$$ \mathrm{EE}\%=\left(\mathrm{Gewicht}\ \mathrm{van}\ \mathrm{Cur}\ \mathrm{in}\ \mathrm{de}\ \mathrm{nanodeeltjes}/\mathrm{Gewicht}\ \mathrm{van}\ \mathrm{de}\ \mathrm{toegevoegde}\ \mathrm{Cur}\right)\times 100\% $$

$$ \mathrm{DL}\%=\left(\mathrm{Massa}\ \mathrm{van}\ \mathrm{Cur}\ \mathrm{in}\ \mathrm{de}\ \mathrm{nanodeeltjes}/\mathrm{Massa}\ \mathrm{van}\ \mathrm{de}\ \mathrm{nanodeeltjes}\right)\times 100\% $$

In vitro Stabiliteitstest

Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met GSH (0, 20 μM, 10 mM) werd bereid en behandeld met CUR-BCSC@PCs gedurende 4 uur om de veranderingen in deeltjesgrootte onder verschillende glutathionconcentraties te observeren bij 37 °C. Daarnaast werd de hydrodynamische diameter van CUR-BCSC@PCs in PBS-oplossing onderzocht met een Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) bij 37 °C op verschillende tijdstippen (4, 8, 12 en 24 uur).

In vitro CUR-vrijkwaringsgedrag van CUR-BCSC@PCs

De in vitro CUR-vrijkwaringsgedrag van CUR-BCSC@PCs werd onderzocht met de dialysemethode. PBS-oplossingen met glutathion (GSH: 20 μmol/L, 1 mmol/L, 5 mmol/L, 10 mmol/L) werden bereid, en 0,5% Tween 80 werd toegevoegd. PBS-buffer (45 mL), met verschillende GSH-concentraties, werd aan 50 mL centrifugebuizen toegevoegd; vervolgens werd een dialysezakje met 1 mL CUR-BCSC@PCs in elke centrifugebus geplaatst, die op 37 °C werd geschud. Op verschillende tijdstippen (0,2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 uur) werd 2 mL vrijkwaringsmedium verzameld, en vers vrijkwaringsmedium van hetzelfde type werd toegevoegd om het volume constant te houden. HPLC werd gebruikt om de CUR-concentratie in het verzamelde vrijkwaringsmedium te bepalen.

Celkweek

De humane longcarcinoom A549-cellen werden gekweekt in DMEM, met 10% FKS en 1% penicilline-streptomycine, en geïncubeerd bij 37 °C in een 5% CO₂-atmosfeer [31, 32].

In vitro Celproliferatie-inhibitie

De in vitro cytotoxiciteit van CUR, BCSC-micellen (BCSCs), CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs tegen de A549-cellijnen werd geëvalueerd met een standaard MTT-test [33]. De A549-cellen werden gezaaid in 96-putplaten (5000 cellen per put) gedurende 24 uur om te hechten. Het oorspronkelijke medium werd verwijderd, en vervolgens werd 100 μL vers medium met vrije CUR, BCSCs, CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs (0,1, 1, 5, 10, 15 en 20 μg/mL gebaseerd op CUR) toegevoegd en 24 uur gekweekt. Putten zonder toediening dienten als lege controles. De cellen werden onderworpen aan de MTT-test door het medium te verwijderen en 20 μL MTT-oplossing (5 mg/mL) toe te voegen. Na incubatie voor nog 4 uur bij 37 °C in 5% CO₂-atmosfeer werd de MTT-oplossing vervangen door 150 μL DMSO om het paarse MTT-formazan op te lossen. Vervolgens werd een microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) gebruikt om de absorbantie van elke put bij 570 nm te meten.

In vitro Celopname en Localisatie

De celopnamecapaciteit van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs werd onderzocht met een fluorescentiemicroscoop (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japan). A549-cellen werden gezaaid in 24-putplaten met 4 × 10⁴ cellen per put en geïncubeerd met CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs (CUR-concentratie: 20 μg/mL) bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO₂ gedurende 1, 2 en 4 uur. De A549-cellen werden driemaal met PBS gewassen na verwijdering van de kweekmedia met geneesmiddelen. Vervolgens werd PBS met 4% paraformaldehyde toegevoegd gedurende 20 min en opnieuw driemaal met PBS gewassen. De celkernen werden gekleurd met Hoechst 33342 gedurende 15 min en waargenomen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Statistische Analyse

Alle experimenten werden ten minste drie keer uitgevoerd en uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Statistische toetsen werden geanalyseerd met de Student's t-toets. P < 0,05 werd ingesteld als statistisch significant, en P < 0,01 werd beschouwd als hoogst significant.

Resultaten en Discussie

Karakterisering van COS, COS-S-S-CUR, Biotine-COS en BCSC

De belangrijkste karakteristieke resonanties van CUR en CH₂-S-S-CH₂ verschenen op het ¹H-NMR-spectrum van COS-S-S-CUR, wat de succesvolle conjugatie van CUR aan de COS-ketens bewijst. In vergelijking met de pieken van COS in Fig. 3(A), werden de karakteristieke signalen van CUR gepresenteerd in Fig. 3(B) waargenomen in het gebied tussen 6,7 en 7,5 ppm en bij 3,75 ppm (−OCH₃), terwijl de resonantie van CH₂-S-S-CH₂ bij 2,5 ppm onveranderd bleef. Zoals getoond in (Fig. 3(C), a, b), waren de pieken van biotine op het ¹H-NMR-spectrum van Biotine-COS 0,99 ppm (−CH₂–) en 3,39 ppm (−CH–S–). ¹H-NMR-spectrum van BCSC is weergegeven in Fig. 3(D). De resonanties van CUR (Fig. 3(D), a, e) werden op de overeenkomstige posities gezien, en de karakteristieke piek van CH₂-S-S-CH₂ (Fig. 3(D), b) werd opnieuw waargenomen bij 2,5 ppm. Daarnaast verifieerde het verschijnen van signalen bij piek 0,09 ppm en 3,39 ppm (Fig. 3(D), c, d) het bestaan van biotine gekoppeld aan de COS-S-S-CUR-ketens. De karakteristieke resonanties van CUR, CH₂-S-S-CH₂ en biotine zoals getoond in Fig. 3(D) zijn consistent met die in Fig. 3(B) en Fig. 3(C), wat aangeeft dat het amphiele materiaal BCSC succesvol werd gesynthetiseerd.

Figuur 3. De ¹H-NMR-spectra van COS (A), COS-S-S-CUR (B), Biotine-COS (C) en BCSC (D)

Karakterisering van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs

De morfologieën van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs werden bestudeerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Fig. 4(A, B)). CUR-BCSCs vertoonden een gladde sferische vorm (Fig. 4(A), a) onder elektronenmicroscopie, terwijl CUR-BCSC@PCs een ongeveer sferische vorm hadden met een bloeiende laag rondom de CUR-BCSC@PCs (Fig. 4(B), b). Dit geeft aan dat PC een proteïnecoronastructuur vormde door de oppervlakken van CUR-BCSCs te bedekken. Een duidelijke Tyndall-effect van CUR-BCSC@PCs werd waargenomen vanwege het bestaan van talloze nanodeeltjes (Fig. 4(C)). De deeltjesgrootte, PI, zetapotentiaal, DL (%), en EE (%) van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs zijn geïllustreerd in Tabel 1. In Fig. 5 was de gemiddelde grootte van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs respectievelijk 97,8 ± 4,2 nm en 160,3 ± 9,0 nm. Tegelijkertijd waren de PI-waarden van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs 0,181 ± 0,014 en 0,114 ± 0,024, respectievelijk, wat kleiner is dan 0,2, wat de uniformiteit van hun groottes aangeeft. De zetapotentialen van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs waren respectievelijk 21,57 ± 0,53 en 12,90 ± 1,93 mV. Vanwege de elektronegatieve PC-coating was het zetapotentiaal van CUR-BCSCs hoger dan dat van CUR-BCSC@PCs. De EE van CUR-BCSC@PCs was hoger dan die van CUR-BCSCs.

Figuur 4. A TEM-beelden van CUR-BCSCs en een enkele CUR-BCSC. B TEM-beelden van CUR-BCSC@PCs en een enkele CUR-BCSC@PC. C Tyndall-effect en foto van CUR-BCSC@PCs in water

Figuur 5. a De grootteverdeling en het zetapotentiaal van CUR-BCSCs; b De grootteverdeling en het zetapotentiaal van CUR-BCSC@PCs

Stabiliteit van CUR-BCSC@PCs

Zoals getoond in Fig. 6a, werd de disulfidebrug als gevolg van de reductieve aard gekneusd in PBS met 10 mM GSH, en CUR-BCSC@PCs desintegreerden in polymere fragmenten, die agglomereren tot een toename van de deeltjesgrootte van de nanodeeltjes. In PBS met 20 μM GSH waren de veranderingen in deeltjesgrootte minimaal, wat een vergelijkbaar resultaat liet zien als PBS zonder GSH. Zoals geïllustreerd in Fig. 6b, werd de deeltjesgrootte gemeten op verschillende tijdstippen om de stabiliteit van CUR-BCSC@PCs in PBS te bestuderen, en de resultaten toonden aan dat de deeltjesgrootte van CUR-BCSC@PCs langzaam toenem in de loop van de tijd [14].

Figuur 6. De stabiliteit van CUR-BCSC@PCs. a Grootteveranderingen van CUR-BCSC@PCs bij verschillende GSH-concentraties. b Grootteveranderingen van CUR-BCSC@PCs in PBS op verschillende tijdstippen

Reductierespons van CUR-BCSC@PCs

Het is bekend dat disulfidebindingen onstabiel zijn in een tumor-reductieve omgeving. Onderzoekers hebben disulfidebindingen gebruikt om hydrofiele polymeren en hydrofobe geneesmiddelen te verbinden om amphiele fragmenten te bereiden, die zich in water kunnen zelfassembleren tot nano-micellen. Vervolgens, volgens verschillen in de fysiologische omgeving en de tumoromgeving, breken disulfidebindingen op de tumordof om geneesmiddelen vrij te maken [34]. In de huidige studie werd in vitro medicijnvrijkwaringsonderzoek uitgevoerd om te verifiëren of CUR-BCSC@PCs de verwachte vrijkwaringsgedrag konden vertonen. De reductierespons van CUR-BCSC@PCs met disulfide-koppelingen werd onderzocht na activatie door GSH. Zoals getoond in Fig. 7, was de vrijkwarings van CUR uit CUR-BCSC@PCs in het medium met 20 μM GSH bij pH 7,4, wat de extracellulaire omgeving simuleerde, extreem langzaam in vergelijking met een omgeving met 10 mM GSH bij pH 7,4. Verder, in vergelijking met het 20 μM GSH-medium, toonden de 1, 5 en 10 mM GSH significante verschillen in vrijkwaringsgedrag. Met de toename van de GSH-concentratie werd de vrijkwarings van CUR uit CUR-BCSC@PCs ook bevorderd, wat aangeeft dat de medicijnvrijkwarings in respons was op de GSH-concentratie.

Figuur 7. Cumulatieve vrijkwarings van CUR uit CUR-BCSC@PCs onder verschillende GSH-omstandigheden

In vitro Cytotoxiciteit

MTT-test werd uitgevoerd om de cytotoxische effecten van vrije CUR, BCSCs, CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs op A549-cellijnen te onderzoeken [35]. De cellevensvatbaarheidsgegevens zijn samengevat in Fig. 8. Alle CUR-preparaten vertoonden dosisafhankelijkheid in termen van celproliferatie-inhibitie. Zoals getoond in Fig. 8, had vrije CUR iets minder vermogen om celproliferatie te remmen tegen alle A549-cellen in vergelijking met CUR-BCSC@PCs en CUR-BCSCs, na incubatie gedurende 24 uur. Voor A549-cellen was de antikankeractiviteit van CUR-BCSC@PCs beter dan die van BCSCs en CUR-BCSCs, wat waarschijnlijk te wijten was aan de uitstekende celopname. Bovendien vertoonden CUR-BCSC@PCs een hogere cytotoxiciteit dan CUR-BCSCs, wat aangeeft dat PC een potentiële inhibitieve effect heeft op de proliferatie van A549-cellen.

Figuur 8. In vitro cytotoxiciteit van verschillende formuleringen na 24 uur in A549-cellen

In vitro Celopname-studie

Zoals getoond in Fig. 8, werden de fluorescentiesignalen van CUR waargenomen in A549-cellen behandeld met CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs (CUR: 20 μg/mL) na 1, 2 en 4 uur, met behulp van de omgekeerde fluorescentiemicroscoop. CUR, als een groene fluorescente probe, was ook een antikankermiddel, dat vaak als hydrofoob modelmiddel werd gebruikt om nieuwe en efficiënte medicijnafgiftesystemen te ontwikkelen. Zoals geïllustreerd in Fig. 9a, werden zowel CUR-BCSCs als CUR-BCSC@PCs opgenomen in A549-cellijnen, en de opname-efficiëntie was tijdsafhankelijk. Vanwege de overgeëxprimeerde biotine-receptoren op het oppervlak van kankercellen, hadden biotine-geladen nano-micellen een affiniteit voor A549-cellen. De fluorescentiesignalen van CUR-BCSC@PCs waren hoog na 4 uur, wat een hoge celopnamesnelheid van CUR-BCSC@PCs aangeeft. De fluorescentiesignalen van CUR-BCSC@PCs waren hoger na 4 uur dan na 1 of 2 uur; dit bewijst dat de celopname tijdsafhankelijk was.

Figuur 9. a Fluorescente beeldvorming van de celopname van CUR-BCSCs en CUR-BCSC@PCs op verschillende tijdstippen. b De cellocatie van CUR-BCSC@PCs na 1 uur en 4 uur

Conclusies

In deze studie werd een type eiwit-gefunctionaliseerd COS-nanodeeltje bereid via condensatiereacties, zelfassembleringsgedrag en de interactie tussen PC en CUR-BCSCs. Na voorlopig onderzoek werden de amphiele dragermaterialen (BCSCs) met redoxgevoeligheid succesvol gesynthetiseerd en geverifieerd met ¹H-NMR. De oppervlakken van CUR-BCSCs werden gemodificeerd met een laag fycocyanine-corona, die de celopname-efficiëntie kon verbeteren en CUR-BCSC@PCs kon beschermen tegen plasma-eiwitadsorptie. De celcytotoxiciteit en opname-analyse gaven aan dat CUR-BCSC@PCs CUR in de A549-cellen konden transporteren en een uitstekende antiproliferatieve eigenschap hadden. Rekening houdend met het FDT-effect van PC en CUR, zullen we in de volgende fase van dit onderzoek de fotodynamische eigenschappen en antikankeractiviteit van CUR-BCSC@PCs onder fototherapie evalueren. Deze studie baande de weg voor de verbetering van de effectiviteit van antikankermiddelen en de introductie van een functionele proteïnecorona. Samengevat, het nanomedicijn-dragerbiomateriaal van CUR-BCSC@PCs gebaseerd op COS met meerdere functies heeft een nieuwe strategie voor tumortreatment geboden en vertoont grote toepassingsmogelijkheden.

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de gegevens die allemaal in dit artikel worden gepresenteerd en getoond.

Afkortingen

BCSC:

Biotine-chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine

COS:

Chitosan-oligosaccharide

COS-S-S-CUR:

Chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine

CUR:

Curcumine

CUR-BCSC@PCs:

Fycocyanine-gefunctionaliseerde en curcumine-geladen biotine-chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine micellen

CUR-BCSCs:

Curcumine-geladen biotine-chitosan-oligosaccharide-dithiodipropionzuur-curcumine micellen

EPR:

Enhanced permeability and retention (verhoogde permeabiliteit en retentie)

PC:

Fycocyanine

PDT:

Fotodynamische therapie