Groene synthese van metaal- en metaaloxidenanodeeltjes en hun effect op de eencellige alg Chlamydomonas reinhardtii

Methoden

Materialen

Commercieel GK, zilvernitraat (AgNO₃ ), waterstoftetrachloorauraat (HAuCl₄ ·3H₂ O), koperchloride (CuCl₂ ·2H₂ O), chloorplatinazuur (H₂ PtCl₆ ), kaliumtetrachloorpalladaat(II) (K₂ PdCl₄ ), waterstofchloride (HCl), natriumhydroxide (NaOH) en ammoniumhydroxide (NH₄ OH) werden allemaal gekocht bij Sigma-Aldrich, VS. Voor alle experimenten werd gedeïoniseerd (DI) water gebruikt. Alle chemicaliën en reagentia die in dit onderzoek werden gebruikt, waren van analytische kwaliteit.

De C. reinhardtii algencultuur (stam CPCC11) werd verkregen van het Canadian Phycological Culture Centre (CPCC, Department of Biology, University of Waterloo, Canada).

GK-verwerking

GK-poeder (1 g) werd in een glazen beker met 1 L DI-water gebracht en overnacht zachtjes geroerd op een magnetische roerder. De gomoplossing werd vervolgens 18 uur bij kamertemperatuur (20 ° C) gelaten om alle onopgeloste stoffen te scheiden. De gomoplossing werd vervolgens gefiltreerd door een trechter van gesinterd glas (10-16 μm poriegrootte) en de heldere oplossing werd gevriesdroogd en bewaard totdat ze nodig was.

Synthese van metaal- en metaaloxide-NP's met GK

In het kort, 100 μL aliquots van 10 mM AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ en K₂ PdCl₄ oplossingen werden toegevoegd aan 10 ml waterige GK-oplossing in afzonderlijke erlenmeyers van 50 ml. De pH van de colloïdale dispersie werd aangepast door 0,1 N HCl of 0,1 N NaOH toe te voegen om een ​​maximale opbrengst aan NP-vorming te bereiken. Om de Ag-, Au-, Pt- en Pd-NP's te synthetiseren, wordt de AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ , en K₂ PdCl₄ en GK-mengsels werden gedurende 1 uur geroerd in een Innova 43 orbitale schudder (New Brunswick Scientific, VS) bij 250 tpm bij temperaturen variërend van 45 tot 95 ° C. De oplossingen werden respectievelijk lichtgeel, wijnrood, intens zwart en gedempt zwart, wat wijst op de vorming van Ag-, Au-, Pt- en Pd-NP's. In het geval van Pt vonden reductie en NP-vorming plaats bij een pH van 8,0 en een temperatuur van 90 ° C, terwijl Pd NP's werden gevormd bij pH 8,5 en 95 ° C. Zie meer in Padil et al. [66, 67].

CuO NP's werden gesynthetiseerd met behulp van een colloïd thermisch syntheseproces [13]. In het kort, 100 μL aliquots van een 10 mM oplossing van dihydraat koperchloride (CuCl₂ ·2H₂ O) werd gemengd met 10 ml van de GK-oplossing (100 mg gedispergeerd in 10 ml DI-water) en NaOH in aparte erlenmeyers van 50 ml, met CuCl₂ ·2H₂ O en NaOH gehandhaafd op een molaire verhouding van 2:5. Het mengsel dat de CuCl₂ . bevat ·2H₂ O en GK werden 1 uur geroerd bij 250 rpm bij een temperatuur van 75 ° C in een rondschudapparaat. De kleur van het mengsel veranderde geleidelijk van blauwachtig naar zwart, wat wijst op de vorming van CuO NP's. Het resulterende precipitaat werd verkregen door centrifugeren en eerst gewassen met ethanol en vervolgens met DI-water.

Karakterisering van door groen gesynthetiseerde NP's

De metaalconcentratie in de vers gesynthetiseerde NP's werd gemeten met behulp van inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer).

De vorming en stabiliteit van de metalen NP's werden beoordeeld met een Cintra 202 UV-Vis-spectrofotometer (GBC, Australië), waarbij de NP-stabiliteit na 6 maanden werd bepaald.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden van de Ag-, Au-, Pt-, Pd- en CuO-NP's werden verkregen met behulp van een Tecnai F 12-microscoop (FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, VS) die werkte bij een versnellingsspanning van 15 kV. Monsters werden voorbereid voor TEM-analyse door 10-20 μL GK-anorganische NP-dispersie op een koperen rooster te laten vallen en bij kamertemperatuur te drogen, na verwijdering van overtollige oplossing.

Algencultuurcondities

Chlamydomonas reinhardtii werd gekweekt in TAPx4-medium (aanvullend bestand 1:tabel S1, ondersteunende informatie) bij 20 ° C in een incubator (Infors, Zwitserland) uitgerust met een schudder die continu roteert met 100 tpm en een verlichtingsregime van 114,2 μmol phot m ^{− 2} s ⁻¹ . De algencellen werden exponentieel gekweekt om ongeveer 10 ⁶ . te verkrijgen cellen/ml.

Karakterisering van NP's in medium voor blootstelling aan algen

NP-grootteverdeling in de C. reinhardtii TAPx4-medium werd gemeten met behulp van de differentiële centrifugale sedimentatietechniek (DCS) op een DC24000UHR-schijfcentrifuge (CPS Instruments Inc., VS). Metingen werden gedaan bij een schijfrotatiesnelheid van 24.000 tpm en deeltjesbezinking werd uitgevoerd met een 8-24% (w /w ) sucrose dichtheidsgradiënt. Voorafgaand aan elke monstermeting werd het instrument gekalibreerd met behulp van PVC-nanosfeerstandaarden (470 nm). De NP's werden ook gekenmerkt door elektroforetische mobiliteit en de Smoluchowski-benadering die werd gebruikt om de zeta-potentiaal (ZP) te bepalen op een Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., VK). Elke meting werd uitgevoerd over 10 runs met autocorrelatiefuncties van 10 s, waarbij elk resultaat werd verkregen uit drievoudige metingen van hetzelfde monster.

De ultrafiltratiemethode werd gebruikt om de hoeveelheid ionmetaal in de algenmedia te bepalen (Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). Aliquots die met verschillende tijdsintervallen (2 en 24 uur) waren getrokken, werden gedurende 30 minuten bij 7500 tpm gecentrifugeerd om de deeltjes en aggregaten te scheiden. Het supernatant werd vervolgens gefiltreerd door Amicon Ultracel 3K ultrafiltratiefilters met een molecuulgewichtsgrens van 3 kDa (Millipore, VS) om ionen van de deeltjes te scheiden. NP's en aggregaten met een diameter groter dan 1,3 nm werden op het filter vastgehouden en het filtraat werd door ICP-MS geanalyseerd op opgeloste ionen [68].

Abiotische ROS-generatie met toenemende concentratie van NP's in algenmedium werd bepaald met behulp van fluorescerend dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (H₂ DCF-DA, Sigma-Aldrich, Zwitserland), zoals beschreven in eerdere onderzoeken [47, 69].

Effect van NP's op algengroei, membraanintegriteit en het genereren van oxidatieve stress

Het effect van de metaal- en metaaloxide-NP's op algengroei, membraanintegriteit en het genereren van oxidatieve stress werd getest met behulp van flowcytometrie (FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, VS). Het experiment werd uitgevoerd in transparante flesjes (PS, 50 ml, Semadeni, Zwitserland) met 5 ml algensuspensie en NP's in concentraties van 1, 5, 10 en 20 mg/L. Controlemonsters zonder NP's werden parallel uitgevoerd. Algencellen werden gedurende 15 minuten in kokend water (100 ° C) verwarmd om een ​​positieve controle op beschadigde celmembranen te bieden. Algencellen werden ook 30 minuten in het donker behandeld met komijn (Sigma-Aldrich, VS), een oxidatieve soort, als een positieve controle van oxidatieve stress (ROS). Alle onbehandelde monsters en monsters die met NP's waren behandeld, werden geïncubeerd onder vergelijkbare omstandigheden als die voor het in stand houden van culturen. Submonsters werden genomen na 1, 3, 5 en 24 uur om het effect van NP's op de integriteit van het celmembraan en oxidatieve stress te beoordelen met behulp van FCM. Een aliquot van 250 L van elk monster werd overgebracht naar een Microtiter®-plaat met 96 putjes met vlakke bodem. Om de integriteit van het celmembraan te beoordelen, werden propidiumjodide (PI) fluorescerende sondes (P4170, Sigma-Aldrich, VS) aan het monster toegevoegd in een eindconcentratie van 7 M. Voor detectie van oxidatieve stress werd CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, VS) aan de monsters toegevoegd volgens de productinstructies. Kortom, PI bindt aan DNA en hecht zich aan RNA na intracellulaire penetratie door beschadigde celmembranen, maar het wordt uitgesloten van de gezonde cellen. CellROX® Green Reagent is een sonde voor het meten van oxidatieve stress in levende cellen. De celdoorlatende kleurstof is zwak fluorescerend in een gereduceerde toestand, maar vertoont heldergroene, fotostabiele fluorescentie na oxidatie door ROS en daaropvolgende binding aan DNA. Het signaal is dus voornamelijk gelokaliseerd op de kern en mitochondriën. De platen werden vóór FCM-meting 20 min (PI) en 30 min (ROS) in het donker geïncubeerd. De algensuspensies werden vervolgens door de FCM geleid met een blauwe 488-nm excitatielaser. CellROX Green werd gemeten in het FL1-kanaal 533/30 nm, PI rode fluorescentie in het FL2-kanaal 585/40 nm en de rode autofluorescentie van chlorofyl a (Chla ) in FL3-kanaal> 670 nm. Het experiment werd in tweevoud uitgevoerd en herhaald.

FCM-gegevens werden geanalyseerd met behulp van CFlow Plus-software (BD Biosciences, VS). De monsters werden gepoort op basis van voorwaartse verstrooiingseigenschappen en rode autofluorescentie van Chla , om signalen van NP's, puin en andere verontreinigingen te elimineren. Het aantal cellen, het percentage beschadigde celmembranen of oxidatief gestresste cellen en autofluorescentiegegevens werden opgehaald op basis van autofluorescentie van Chla (670 nm), PI-gelabelde cellen (585 nm) en ROS Green (533 nm) (Extra bestand 1:Afbeelding S1).

Efficiëntie van algenfotosysteem II

Aan dezelfde algencultuur werden metaal- en metaaloxide-NPs-suspensies toegevoegd (ongeveer 10 ⁶ cellen/ml) in glazen kolven van 15 ml om eindconcentraties van 1, 5, 10 en 20 mg/L te bereiken. Algenculturen zonder NP's werden bereid als negatieve controles. Alle monsters werden vervolgens overgebracht naar een incubator onder dezelfde omstandigheden die werden gebruikt voor de oorspronkelijke algenculturen. Aliquots (2,2 ml) van elk monster werden onmiddellijk en na 1, 3, 5 en 24 uur incubatie genomen om de kwantumopbrengst van fotosysteem II (QY) te detecteren met behulp van een AquaPen-C AP-C 100 fluorometer (PSI Ltd., Czech Republiek). Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd. QY vertegenwoordigt de verhouding van variabele fluorescentie (F _v = F _m − F ₀ ) tot maximale fluorescentie (F _m ), met QY = F _v :F _m gebruikt als een proxy voor fotochemische uitdovingsefficiëntie [70]. F _m werd verkregen door een paar seconden voor en aan het einde van de belichting bij 680 nm te belichten, met minimale fluorescentie (F ₀ ) zijnde de eerste meting op het minimale fluorescentieniveau in afwezigheid van fotosynthetisch licht.

Statistische analyse

Het effect van metaal en metaaloxide NP's op C. reinhardtii werden getest met behulp van variantieanalyse ANOVA en Dunnett's test (GraphPad PRISM, VS). Significantieniveaus werden ingesteld op *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001.

Resultaten

Vorming en primaire karakterisering van NP's

TEM-afbeeldingen van Ag-, Au-, Pt-, Pd- en CuO-NP's gesynthetiseerd met behulp van GK tonen goed gescheiden, bolvormige NP's met diameters variërend van 2 tot 100 nm (figuur 1a-e). Waterige colloïdale NP's-oplossingen onderzocht onder UV-Vis-spectroscopie (figuur 1f) vertoonden duidelijke oppervlakteplasmonresonantie bij 412 en 525 nm, consistent met de vorming van Au- en Ag-NP's binnen het GK-netwerk. Er werden geen duidelijke oppervlakteplasmonresonanties waargenomen voor Pt-, Pd- of CuO-NP's. UV–Vis-metingen na 6 maanden bevestigden de stabiliteit van alle NP's, waarbij de spectra een enkele piek vertoonden met een vergelijkbare gemiddelde grootte als de vers gesynthetiseerde NP's (aanvullend bestand 1:figuur S2).

Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van a Au, b Pt, c Ag, d Pd en e CuO-nanodeeltjes gesynthetiseerd met behulp van gom karaya en hun overeenkomstige metaalzouten. een , b , c , d en e grafiek-inserts tonen de piekdeeltjesgrootteverdeling per nanodeeltjesgewicht in algenmedia, zoals bepaald door differentiële centrifugale sedimentatie. (F) UV–Vis-spectra voor de Au-, Ag-, Pt-, Pd- en CuO-nanodeeltjes

Karakterisering van NP's in medium voor blootstelling aan algen

De grootte van de NP's, gebaseerd op de gewichtsverdeling, varieerde als volgt van 180 tot 5 nm:CuO> Au> Pt> Ag> Pd. Alle NP's waren negatief geladen bij pH 7 (tabel 1 en aanvullend bestand 1:figuur S3). Pt, Ag en CuO NP's hadden de hoogste ionische metaalconcentraties (33-36 g/L), en Au en Pt NP's de laagste (6-7 μg/L) (Tabel 1). De ionische vormen van metalen werden gedetecteerd in algenmedium (tabel 1).

Effect op algengroei

Onaangetast C. reinhardtii cultuur had een groeisnelheid van 1 × 10 ⁶ cellen/uur. In aanwezigheid van 1 mg/L Ag, Pd en CuO NP's nam de groeisnelheid sterk af tot 2,2 × 10 ⁴ , 1,7 × 10 ⁴ en 0.2 × 10 ⁴ cellen/h, respectievelijk (P < 0,001). Naarmate de NP-concentratie verder toenam, werd de algengroei volledig geremd (figuur 2). Wanneer algen werden blootgesteld aan Au en Pt NP's, was de groeisnelheid ook significant verminderd in vergelijking met de controle (P < 0,001), maar toenemende concentraties versterkten het effect niet.

Groeisnelheid van Chlamydomonas reinhardtii blootgesteld aan Au, Pt, Pd, Ag en CuO metaal en metaaloxide nanodeeltjes (1, 5, 10 en 20 mg/L). De groeisnelheid voor de niet-blootgestelde controle (algencultuur) was 1 × 10 ⁶ cellen/uur na 24 uur. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van herhaalde experimenten met dubbele monsters

Generatie van oxidatieve stress in cellen

Oxidatieve stress varieerde afhankelijk van het NP-type (Fig. 3). Het hoogste effect, met bijna 100% van de aangetaste cellen, werd veroorzaakt door 5-20 mg/L Ag en CuO NP's (Fig. 3d, e en Aanvullend bestand 1:Tabel S2). Wanneer algencellen werden blootgesteld aan Au NP's, was de oxidatieve stress veel lager, waarbij meestal <-10% van de cellen werd aangetast. De hoogste concentraties Au NP's (20 mg/l) troffen slechts 15% van de cellen (P < 0,001). Het percentage gestresste cellen nam in de loop van de tijd geleidelijk af, zonder dat er na 24 uur oxidatieve stress werd gedetecteerd voor alle geteste Au-concentraties (figuur 3a). Pt NP's veroorzaakten oxidatieve stress in minder dan 8% van de algencellen tijdens de eerste 5 uur van blootstelling (figuur 3b). Alleen bij concentraties van 10 en 20 mg/L werd stress gegenereerd in respectievelijk 10 en 19% van de cellen na 24 uur (P < 0,001; Aanvullend bestand 1:Tabel S2), zonder gedetecteerde stress bij lagere concentraties (P> 0.1) na 24 uur blootstelling (Fig. 3b). Blootstelling aan 1 mg/L Ag NP's induceerde geen oxidatieve stress in algencellen gedurende een periode van 24 uur (P> 0.9). Blootstelling aan 5 mg/L resulteerde echter in oxidatieve stress na 5 uur en blootstelling aan 10 en 20 mg/L resulteerde in oxidatieve stress na 3 uur. Na 24 uur blootstelling aan Ag NP's was 100% van de cellen gestrest (P < 0,001; Afb. 3c en Aanvullend bestand 1:Tabel S2). CuO NP's induceerden significante (P <-0,001) oxidatieve stress in algencellen sneller (3 uur) dan de andere metalen NP's getest bij 10 en 20 mg/L (Aanvullend bestand 1:Tabel S2), behalve Ag NP's. Oxidatieve stress was al significant bij 5 mg/L na 5 uur. Alle concentraties (>  5 mg/L) hadden een significant effect op celoxidatieve stress (Fig. 3d, e). Als aanvullende parameter hebben we ook de abiotische ROS bepaald die door de NP's wordt gegenereerd. In tegenstelling tot C. reinhardtii groeisnelheid en percentage van C. reinhardtii cellen die oxidatieve stress vertoonden, genereerden Au NP's slechts een lichte toename van abiotische ROS (P> 0,05; Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4).

Percentage Chlamydomonas reinhardtii cellen die oxidatieve stress vertonen na blootstelling aan toenemende concentraties (1, 5, 10 en 20 mg/l) van a Au, b Pt, c Pd, d Ag en e CuO-nanodeeltjes na 1, 3, 5 en 24 uur. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van herhaalde experimenten met dubbele monsters. Let op verschillende y -asschalen voor Au en Pt

Effect op de integriteit van algenmembraan

Au en Pt NP's veroorzaakten significante (P < 0,001) celmembraanbeschadiging bij alle concentraties van 1 tot 5 uur (Aanvullend bestand 1:Tabel S3); echter geen significant effect (P> -0,05) werd waargenomen na 24 uur (Fig. 4a, b). In het geval van Ag NP's was 100% van de cellen beschadigd (P < 0,001) na 1 uur blootstelling aan 1–20 mg/L (Fig. 4c, Extra bestand 1:Tabel S3, Ag). Het percentage celmembranen beschadigd na blootstelling aan 1 en 5 mg/L Pd NP's (Aanvullend bestand 1:Tabel S3, Pd) was vergelijkbaar met dat voor de controle gedurende 24 uur (P> 0.4). Aan de andere kant aanzienlijke schade (P <-0,001) werd waargenomen na 24 uur blootstelling aan 20 mg/L Pd NP's (Fig. 4d). Het effect van CuO nam toe met toenemende concentratie en tijd, en bereikte de grootste impact na 24 uur (Fig. 4e en aanvullend bestand 1:Tabel S3).

Percentage Chlamydomonas reinhardtii cellen met beschadigde membranen na blootstelling aan toenemende concentraties (1, 5, 10 en 20 mg/l) van a Au, b Pt, c Pd, d Ag en e CuO-nanodeeltjes na 1, 3, 5 en 24 uur. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van herhaalde experimenten met dubbele monsters. Let op verschillende y -asschalen voor Au en Pt

Effect op chlorofyl (Chl ) Fluorescentie

Chl fluorescentie werd niet significant beïnvloed (P> 0.1) door Au NP's bij elke concentratie gedurende de periode van 24 uur en door Pt gedurende de periode van 5 uur (Fig. 5a, b en aanvullend bestand 1:Tabel S4). Aan de andere kant remden Ag, Pd en CuO NP's sterk (P < 0.001) Chl fluorescentie met toenemende concentratie en belichtingstijd, b.v. Chl fluorescentie werd verlaagd van 98% (1 uur) tot 22% (24 uur) (P < 0,001) wanneer algencellen werden gekweekt in aanwezigheid van 5 mg/L Ag (aanvullend bestand 1:Tabel S4). Een vergelijkbare vermindering van fluorescentie werd ook waargenomen voor 10 en 20 mg/L Ag, waarbij de niveaus daalden tot 20 en 9% (P <-0,001), respectievelijk (Fig. 5c). CuO en Pd NP's (beide 20 mg/L) veroorzaakten een scherpe daling in Chl fluorescentie na 24 h (P < 0,001). Er was geen waarneembaar effect (P> 0.1), echter voor 1 of 5 mg/L Pd en voor 1 mg/L Ag en CuO NP's (Fig. 5c–e).

Percentage Chlamydomonas reinhardtii cellen met chlorofyl (Chl ) fluorescentie na blootstelling aan toenemende concentraties (1, 5, 10 en 20 mg/l) van a Au, b Pt, c Pd, d Ag en e CuO-nanodeeltjes na 1, 3, 5 en 24 uur. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van herhaalde experimenten met dubbele monsters

Effect van NP's op algenfotosysteem II

Au, Pt en CuO NP's hadden een licht significant effect (P <0,05) op fotosysteem II QY op sommige tijdstippen gedurende de periode van 24 uur in concentraties variërend van 1 tot 20 mg/L (Fig. 6 en Aanvullend bestand 1:Tabel S5). Aan de andere kant was QY significant verminderd (P <-0,001) na slechts 1 uur na contact met Ag NP's in alle concentraties (Fig. 6c en Aanvullend bestand 1:Tabel S5). Pd en CuO NP's resulteerden in een significante vermindering van QY bij de hoogste concentratie van 20 mg/L (Fig. 6d, e en aanvullend bestand 1:Tabel S5).

Effect van een Au, b Pt, c Pd, d Ag en e CuO-nanodeeltjes (1, 5, 10 en 20 mg/L) op fotosysteem II-efficiëntie (QY %) na 1, 3, 5 en 24 uur. Honderd procent op de y -as vertegenwoordigt de QY van de controle-algencultuur zonder nanodeeltjes. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van herhaalde experimenten met gedupliceerde monsters

Discussie

In het huidige werk wilden we de eliminatie van de productie van giftig afval tijdens de synthese van metaal- en metaaloxidenanomaterialen onderzoeken bij het implementeren van de groene chemiebenadering [16, 57, 58], waarbij de nadruk lag op het gebruik van milieuvriendelijke dispergeermiddelen en hernieuwbare en biologisch afbreekbare materialen. We gebruikten met succes GK, een natuurlijk, hernieuwbaar en biologisch afbreekbaar materiaal voor de synthese en stabilisatie van een reeks NP's. Door DI-water als oplosmiddel te gebruiken, werkten de functionele groepen die aanwezig zijn in GK (dwz -OH en -COO-) als reductiemiddelen en het GK-polymeer zelf werkte als een afdekmiddel voor de gevormde NP's, waardoor groene synthese van NP's mogelijk werd [59, 68]. De in ons onderzoek gesynthetiseerde NP's (Au, Pt, Pd, Ag en CuO) waren qua grootte, stabiliteit en kosteneffectiviteit vergelijkbaar met andere groen gesynthetiseerde NP's uit eerdere onderzoeken [13, 69].

Vervolgens gebruikten we een reeks nanoschaalconcentraties (1-20 mg/L) gerelateerd aan verwachte of geregistreerde omgevingsconcentraties [39, 71,72,73] om het biologische effect van de NP's op C te beoordelen. reinhardtii gebruikmakend van eindpunten zoals algengroei, membraanintegriteit, Chl fluorescentie fotosysteem II efficiëntie en oxidatieve stress. Onze resultaten lieten twee verschillende groepen zien:Au en Pt NP's die weinig of geen effect hebben op de alg, en Ag, Pd en CuO NP's die een sterk effect hebben op bijna alle eindpunten (aanvullend bestand 1:Tabel S6). Toxiciteitsstudies van metaal- of metaaloxide-NP's hebben verschillende belangrijke fysisch-chemische kenmerken van NP's geïdentificeerd die gerelateerd kunnen zijn aan hun toxiciteit, waaronder samenstelling, coating, grootte, vorm en homo- of heteroaggregatie [69, 74,75,76,77, 78]. Bovendien is de toxiciteit van opgeloste metalen (ionische vorm) eerder aangetoond op algen met behulp van een reeks criteria, waaronder intracellulaire ROS-generatie, Chl uitputting en remming van de fotosynthese [79,80,81]. We hebben duidelijk ROS-generatie en een effect op de groei gedetecteerd, Chl productie en fotosysteem II na blootstelling aan Ag, Pd en CuO NP's.

Hoewel Pd NP's meestal als een toxische groep worden beschouwd, zijn ze niet uitgebreid bestudeerd en zijn ze pas recentelijk erkend als belangrijke antibacteriële NP's [41]. Algemeen wordt aangenomen dat de kleine omvang (1,5-3 nm) van Pd NP's bijdraagt ​​aan hun antibacteriële eigenschappen, wat mogelijk het transport naar cellen vergemakkelijkt door bacteriën of algencelwandporiën, die een diameter hebben van 5 tot 20 nm [82, 83] . In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO₃ on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .