Groen-gesynthetiseerde eiwit-gecoate goud nanopartikels uit Tricholoma crassum: Antimicrobiële, apoptotische en gen-delivery potentiëlen

Samenvatting

We rapporteren de eerste groene synthese van eiwit-gecoate goud nanopartikels (AuNPs) met behulp van de eetbare mycorrhiza schimmel Tricholoma crassum. De AuNPs, 5–25 nm in diameter en van diverse vormen, vormen zich binnen één uur bij 28 °C. UV–vis spectroscopie toont een karakteristieke SPR piek bij 552 nm, verschuivend met reactietijd en pH. Gedetailleerde karakterisering door SEM, TEM, AFM, XRD en DLS bevestigt monodispersiteit en een natuurlijke 40 kDa eiwitcorona. De deeltjes vertonen krachtige antimicrobiële activiteit tegen Gram-negatieve, Gram-positieve en schimmellijke pathogenen, inclusief multi-drug-resistente stammen, en remmen spore kieming. Comet assays onthullen dosis-afhankelijke apoptotische inductie in plantencellen, terwijl de 40 kDa eiwitmantel efficiënte gen-delivery naar Sarcoma 180 cellen vergemakkelijkt, bewijs door GFP expressie. Hemolyse tests tonen verwaarloosbare bloedtoxiciteit onder 20 µl mL⁻¹, wat een veilig therapeutisch venster aangeeft. Grote-schaal productie in fermentoren is haalbaar, wat deze AuNPs positioneert als veelzijdige agentia voor antimicrobiële, antikanker en gen-delivery toepassingen.

Achtergrond

De snelle adoptie van nanopartikels in landbouw, geneeskunde en consumentenproducten heeft de noodzaak verhoogd om hun veiligheidsprofiel te begrijpen. Groene synthese, die levende organismen of hun enzymen gebruikt, biedt een eco-vriendelijke, kosteneffectieve route die gevaarlijke chemicaliën elimineert. Filament schimmels, met hun hoge enzymsecretie, zijn bijzonder bekwaam in het produceren van extracellulaire metaal nanopartikels. Terwijl verschillende schimmels goud nanopartikels (AuNPs) hebben opgeleverd, beschrijven weinig rapporten natuurlijke eiwitmantels op deze deeltjes, die cruciaal zijn voor colloïdale stabiliteit en functionalisatie. Goud nanopartikels zijn aantrekkelijk voor therapeutisch gebruik omdat ze geen resistentie opwekken en ingenieurd kunnen worden om tumorecellen te targeten via het verbeterde permeatie en retentie (EPR) effect. Eiwit-gecapte AuNPs verbeteren cellulaire opname en bieden dockingsplaatsen voor geneesmiddelen of genen, waardoor de noodzaak voor additionele chemische cappingsstappen vervalt. Niettemin moeten biocompatibiliteit, cytotoxiciteit en aggregatierisico's zorgvuldig geëvalueerd worden voor klinische toepassing.

Methodes

Schimmels, Bacteriën en Plant Groei Condities

Tricholoma crassum werd gekweekt voor nanopartikelsynthese. Antimicrobiële tests gebruikten E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) en hun multi-drug-resistente derivaten, evenals de plantpathogenen M. oryzae en A. solani. Tomaat en tabak zaailingen werden gekweekt onder gecontroleerde condities (28 ± 1 °C, 16:8 h licht/donker, 50 µmol m⁻² s⁻¹).

Synthese van AuNPs

Mycelium matten werden geïncubeerd in aardappel dextrose bouillon (PDB) gedurende 7 dagen bij 28 °C. Na 24, 48 of 72 uur werd 1 g mycelium geschud met 10 mL gedemineraliseerd water gedurende 24 uur bij 50 RPM. Het filtraat (pH 5,2) werd gemengd met 1 mM HAuCl₄ en geroerd bij 28 °C in het donker gedurende 1 uur. Door het filtraat pH (3,5–9) en reactietemperatuur (0–100 °C) aan te passen, pasten we deeltjesgrootte en vorm aan. Variaties in filtraatvolume (×0,5–×2) en Au³⁺ concentratie (0,5–2 mM) verfijnden de synthese verder.

Karakteriseringstechnieken

• UV–Vis spectroscopie (450–750 nm) voor SPR analyse.
• SEM, TEM en AFM voor morfologie en grootteverdeling.
• XRD voor kristallijne fase bevestiging.
• DLS voor hydrodynamische grootte.
• SDS-PAGE voor eiwitcorona identificatie.

Antimicrobiële en Antischimmel Assays

Schijfdiffusie en groeicurven assays kwantificeerden remming tegen bacteriële en schimmellijke stammen. Schimmels pore kieming werd beoordeeld met variërende AuNP concentraties. De methode omvatte standaard incubatie en microscopische observatie.

Apoptose Beoordeling

Comet assays op tabak en tomaat bladkernen maatten DNA-fragmentatie na AuNP blootstelling. Verschillende concentraties (0–30 % v/v) en incubatietijden (15–30 min) werden getest.

Gen-delivery in Sarcoma 180 Cellen

Plasmide pCAMBIA1302 (GFP marker) gecomplexeerd met AuNPs en geïncubeerd met Sarcoma 180 cellen. GFP expressie bevestigde succesvolle transfectie. Hemolyse assays met humane erythrocyten evalueerde bloedcompatibiliteit.

Resultaten en Discussie

AuNP Vorming en Spectroscopische Kenmerken

De overgang van bleekgeel tot violet binnen 1 uur duidt op AuNP vorming. UV–Vis spectras tonen een SPR piek bij 552 nm voor 24-uur filtraat, verschuivend roodwaarts met langere incubatie en blauwwaarts met hogere pH. Optimale synthese vindt plaats bij 28 °C met 1 mM HAuCl₄, wat monodisperse deeltjes oplevert stabiel voor >30 dagen.

Effect van Syntheseparameters

Vergroting van filtraatvolume of Au³⁺ concentratie verhoogt kleurintensiteit en absorbantie, met een lichte blauwverschuiving bij ×2 filtraat. Hogere temperaturen (75–100 °C) produceren grotere, minder stabiele deeltjes. Lichtexpositie vergroot deeltjesgrootte en verbreedt de SPR piek.

Morfologie en Grootteverdeling

SEM en TEM onthullen 5–22 nm AuNPs in vormen variërend van spheren en rhomboïden tot hexagonen en driehoeken. AFM bevestigt sub-10 nm hoogtes, en XRD bevestigt kubisch-gecentreerd goud met dominante {111} diffractie bij 38,23°.

Antimicrobiële Activiteit

AuNPs remden groei van E. coli, A. tumefaciens en M. oryzae met dosis-afhankelijke inhibitie zones. Multi-drug-resistente stammen werden ook onderdrukt, wat breed-spectrum effectiviteit aangeeft. Groeicurve analyses toonden vertraagde log-fase en verminderde celdichtheid na AuNP behandeling.

Schimmels Pore Kieming

Toenemende AuNP concentraties verlaagden progressief pore kieming en kiembuislengte van A. solani, wat antifongale potentie demonstreert.

Apoptogene Eigenschappen

Comet assays onthulden significante DNA-schade bij >20 % AuNP blootstelling, terwijl 5–10 % verwaarloosbare apoptose veroorzaakten. Dus bestaat een therapeutisch venster voor antimicrobiële of gen-delivery toepassingen zonder cytotoxiciteit.

Eiwitcorona Identificatie

SDS-PAGE van gekookte nanopartikels toont een enkele 40 kDa band identiek aan het extracellulaire eiwit van T. crassum. De eiwitmantel stabiliseert deeltjes en biedt bindingsplaatsen voor DNA.

Gen-delivery en Hemolyse

AuNP-plasmide complexen bereikten GFP expressie in Sarcoma 180 cellen, terwijl naakt plasmide dit niet deed. Hemolyse bleef onder 8 % bij concentraties tot 20 µl mL⁻¹, wat lage bloedtoxiciteit bevestigt.

Conclusies

Eetbare mycorrhiza schimmel Tricholoma crassum stelt snelle, groene synthese van eiwit-gecoate AuNPs met diverse vormen en robuuste antimicrobiële, apoptotische en gen-delivery eigenschappen toe. De natuurlijke 40 kDa eiwitcorona garandeert colloïdale stabiliteit en functionalisatie, terwijl hemolysedata veilig therapeutisch gebruik ondersteunen. Grote-schaal productie in fermentoren is haalbaar, wat een schaalbaar platform biedt voor antimicrobiële, antikanker en nanomedische toepassingen.