Evaluatie van de antimicrobiële, apoptotische en kankercel-genafgifte-eigenschappen van met eiwit afgedekte gouden nanodeeltjes gesynthetiseerd uit de eetbare mycorrhiza-schimmel Tricholoma crassum

Resultaten en discussie

Biosynthese van AuNP's bij pH 5,5

Tijdens de synthese wordt de vorming van de AuNP aangegeven door de kleurverandering van het celfiltraat van lichtgeel naar violet [23] als gevolg van de verandering in oppervlakteplasmonresonantie (SPR). 1 mM HAuCl₄ oplossing zonder schimmelfiltraat was groengeel (Fig. 1a, 'A') en het celfiltraat van T. crassum die bleekgeel was (Fig. 1a, 'B'). Na incubatie veranderde de kleur van het mengsel binnen 1 uur in violet (Fig. 1a, 'C'), wat wijst op de vorming van AuNP's.

Biosynthese van AuNP's met behulp van Tricholoma crassum en spectroscopische analyse. een Kleurverandering tijdens reactie. A 20 mM oplossing van HAuCl₄ . B Mycelia-vrij celfiltraat van Tricholoma crassum . C 1 mM HAuCl₄ met 24 uur celfiltraat gedurende 1 uur met violette kleur die de synthese van AuNP's aangeeft. b UV-vis-spectra van de AuNP's gesynthetiseerd met verschillende incubatieperioden (24, 48, 72 uur). Vaste pijl toont absorptiepiek bij 552 nm gedurende een incubatieperiode van 24 uur. De gestippelde pijl toont een lichte rode verschuiving van de absorptiemaxima met toename van de incubatieperiode. c AuNP's gesynthetiseerd onder verschillende pH met verschillende kleuren. d UV-vis spectra van hetzelfde. Vaste pijl geeft absorptiepiek aan bij 552 nm voor pH 5,5 en gestippelde pijl geeft blauwe verschuiving van absorptiemaxima aan met toename van pH

Een nadeel van andere methoden voor de productie van nanodeeltjes uit micro-organismen is dat deze tijdrovend zijn en de organismen toxines produceren. Eerder, Phanerochate chrysosporium celvrij extract werd gebruikt om AuNP's in 90 minuten te produceren [3]. Onlangs zijn zilveren en gouden nanodeeltjes gebiosynthetiseerd met behulp van Sporosarcina koreensis met een verlengde reactietijd van 1-2 dagen [24]. In ons rapport is de productietijd van AuNP teruggebracht tot slechts 1 uur.

Ultraviolette tot zichtbare spectroscopie

De optische absorptiespectra van metalen nanodeeltjes worden bepaald door vorm, aggregatie en de SPR, die verschuiven in overeenstemming met de deeltjesgrootte en vorm [25, 26]. Figuur 1b toont de UV-vis-spectra van AuNP's die zijn gesynthetiseerd met behulp van celfiltraten geproduceerd gedurende 24, 48 en 72 uur, gevolgd door 1 uur incubatie met 1 mM HAuCl₄ oplossing (pH 5,5). Hier ligt de absorptiepiek bij 552 nm voor het 24-uurs celfiltraat. De transversale plasmonresonantieband die het eerst verschijnt bij 552 nm, verschuift enigszins naar rood van 24 tot 48 en 72 uur (weergegeven als ononderbroken vs. stippellijn Fig. 1b), wat een rode verschuiving bevestigt met progressief versterkte intensiteit van absorptie. De verbreding van de pieken geeft aan dat de deeltjes polydispers zijn. De sterke SPR gecentreerd op ca. 550-560 nm is typerend voor colloïdaal goud (Fig. 1b). Naarmate de concentratie van het celfiltraat toenam met toename van de incubatieperioden (d.w.z. 24, 48, 72 uur), nam de absorptie ook evenredig toe. Toen de reactie werd uitgevoerd bij 28 °C, bereikte het evenwicht na 1 uur en was het stabiel gedurende 30 dagen zonder bewijs van aggregatie, waarschijnlijk als gevolg van de stabiliserende eiwitlaag. In eerdere onderzoeken vertoonden met BSA gecoate AuNP's geen aggregatie [27]. Verdere studies werden gedaan met AuNP's bereid met 24-uurs celfiltraat.

Biosynthese van AuNP's bij verschillende pH- en UV-vis-spectroscopie

De AuNP's werden gesynthetiseerd bij verschillende pH's van 3, 5, 5,5, 7, 8 en 9 resulterend in roze tot diep violette kleuring (figuur 1c). De UV-vis-spectroscopie toonde de absorptiemaxima en de SPR-golflengte nam toe van pH 3,5 tot pH 5,5, wat resulteerde in een roodverschuiving. Met een verdere toename van de pH van 7 naar pH 9, namen de absorptiemaxima en de SPR-golflengte echter af, wat een blauwe verschuiving vertoonde (figuur 1d). De piek bij pH 9 had een kleinere amplitude en onveranderde kleur, wat aangeeft dat er slechts kleine hoeveelheden AuNP's werden gevormd. Omdat dit een enzymatische biosynthese is, remde pH 9 waarschijnlijk de enzymreactie die nodig is voor de vorming van AuNP's (figuur 1d). De nanodeeltjes geproduceerd bij verschillende pH's aggregeerden niet na 1 maand bij kamertemperatuur.

Productie van AuNP's met verschillende temperaturen, substraatconcentraties en precursorconcentraties

Optimalisatie van fysisch-chemische omstandigheden tijdens biosynthese is van cruciaal belang voor het genereren van functioneel efficiënte nanodeeltjes [28]. Synthese met hogere concentraties filtraat toonde een verhoogde productie van AuNP's met meer kleurintensiteit en absorptiemaxima (Fig. 2a, b). Een lichte blauwe verschuiving van de maximale gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) werd waargenomen voor synthese met × 2-filtraat, wat wijst op een grotere afstand tussen de deeltjes en een verminderde clustergrootte [29, 30].

Biosynthese en UV-vis spectroscopie van AuNP's van Tricholoma crassum verschillende syntheseparameters gebruiken. een , b Verschillende concentraties celfiltraat. c , d Verschillende concentraties HAuCl₄ . e , v Verschillende reactietemperaturen. g , u In het donker en onder licht. Vaste pijl toont de typische absorptiepiek bij 552 nm voor × 1 celfiltraat en 1 mM HAuCl₄ bij 28 °C pH 5,5 en gestippelde pijl geeft blauwe verschuiving van absorptiemaxima aan, gestippelde pijl geeft rode verschuiving in SPR-band weer

Van de drie geteste concentraties goudchloride (0,5, 1 en 2 mM) was de synthese maximaal voor 1 mM, met absorptiemaxima bij 552 nm. (Fig. 2c, d). 28 °C bleek optimaal te zijn voor synthese. Hogere temperaturen (75 en 100 ° C), hoewel gemedieerde snellere synthese van AuNP's, gaven de donkere kleur en de roodverschuiving van het absorptiemaximum (Fig. 2e, f) grotere deeltjes aan dan bij 28 ° C. Bij 0 en 15 °C was er geen kleurontwikkeling of absorptiepiek binnen 550-600 nm. Synthese in licht resulteerde in dieppaarse kleuring (Fig. 2g) en een roodverschuiving van het absorptiemaximum met een brede piek (Fig. 2h) die grotere deeltjes betekent. De deeltjesgrootte en het aantal werden getest met DLS (Fig. 3a-j). Deze variatie in de grootte en aggregatie van nanodeeltjes is afhankelijk van de aard en hoeveelheid geassocieerde organische stof [30] die weer varieert met de syntheseomstandigheden.

DLS met grootteverdelingen van de gesynthetiseerde AuNP's a met × 1 celvrij filtraat, 1 mM HAuCl4 bij 28 °C in het donker, b onder licht, c met × 0,5 celvrij filtraat, d met × 2 celvrij filtraat, e bij 0 °C, f bij 15 °C, g bij 75 °C, u bij 100 °C, i met 0,5 mM HAuCl₄ en j met 2 mM HAuCl₄

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

SEM toonde AuNP's van kleine afmetingen en verschillende geometrische vormen bij een vergroting van × -80000 (figuur 4a). TEM-analyse toonde duidelijk polydisperse AuNP's met een diameter van 2 - 22 nm (figuur 4b). De grootteverdelingsgrafiek laat zien dat AuNP's van het groottebereik 5-10 nm de hoogste frequentie hadden, achtereenvolgens gevolgd door 2-5 nm, 10-15 nm, 15-20 nm en 20-22 nm (figuur 4c). Deze hadden verschillende geometrische vormen, zoals kleine cirkelvormige of ruitvormige met een diameter van 5 nm of minder, zeshoeken, balkjes, gelijkbenige driehoeken en bijna gelijkzijdige driehoeken met zijden variërend van 4,36 tot 22,94 nm (Fig. 4d, e).

Elektronenmicroscopie van de AuNP's. een SEM bij een vergroting van ×  80.000. b TEM toont verspreide deeltjes van verschillende groottes in een microscopisch veld. c Een histogram dat de deeltjesgrootteverdeling van de AuNP's toont. Vergrote weergave van individuele AuNP's met verschillende geometrische vormen en hun schematische weergaven met afmetingen. d Bolvormig (links) en ruitvormig (rechts) van klein formaatbereik. e Van links:zeshoekig, gelijkzijdig driehoekig, ruitvormig, veelvlakkig en gelijkbenig driehoekig

Atoomkrachtmicroscopie (AFM)

Figuur 5a toont een AFM-beeld van de verspreide AuNP's. De tweedimensionale weergave (figuur 5a) laat zien dat de deeltjes een bijna vergelijkbare oppervlaktedikte hadden. De hoogten van deze deeltjes werden gevisualiseerd met 3D AFM met één oppervlak (figuur 5b). De AFM 2D-grafiek van de AuNP's die op een willekeurige lineaire zone liggen (gemarkeerd met een stippellijn, Fig. 5c) toont hoogten variërend van 1 tot 4 nm. De plasmonband met het vlakke oppervlak gaf aan dat de dikte van de deeltjes kleiner was dan de randlengte.

AFM en röntgendiffractie van de AuNP's. een AFM afbeelding:bovenaanzicht. b AFM-beeld:driedimensionale weergave. c Een AFM-beeld van AuNP's en grafisch profiel voor hoogten van de nanodeeltjes die op de stippellijn in het veld liggen. d Röntgendiffractiepatroon van de nanodeeltjes met pieken die typisch zijn voor goud

Röntgendiffractieonderzoeken (XRD)

Het XRD-patroon van dunne film van de deeltjes onthulde de aanwezigheid van alleen AuNP's. Een sterke diffractiepiek rond 38° wordt over het algemeen toegeschreven aan {111} facet van de face-centered cubic (FCC) structuur [3]. Het XRD-patroon hier vertoonde een dominante diffractiepiek bij 38,23 toegeschreven aan de FCC-structuur. De diffractiepieken van de andere vier facetten waren zwakker. De vier verschillende Bragg-diffractiepieken op 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 en 81,63 kwamen nauw overeen met die van AuNP's (Fig. 5d, Aanvullend bestand 1:Tabel S1).

Berekening van de concentratie van AuNP's

De concentratie van de nanodeeltjes [15] bleek 15,56 mg/L te zijn voor deeltjes geproduceerd met 24 uur celfiltraat geïncubeerd met 1 mM HAuCl₄ .

Antimicrobiële test van de AuNP's met behulp van pathogene bacteriën en schimmels

De AuNP's vertoonden sterke antimicrobiële activiteiten tegen zowel menselijke bacteriën als plantpathogene bacteriën en schimmels. De antimicrobiële activiteit van de nanodeeltjes werd getest met behulp van papieren schijfjes met toenemende hoeveelheden AuNP, namelijk 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 en 1,245 μg. Menselijke bacteriën E. coli (DH5α), de plantpathogene bacterie A. tumefaciens (LBA4404) en de plantpathogene schimmel M. oryzae werden gebruikt. De AuNP's waren remmend voor al deze micro-organismen, zelfs bij de laagste concentraties, en de remmingszones namen evenredig toe met de toename van de deeltjesconcentratie (figuur 6). Afbeelding 6a–c laat zien dat de remzones voor E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) en M. oryzae , respectievelijk. Figuur 6f-h toont de grafiek van de remmingszones van deze drie microben als een functie van de hoeveelheid gebruikte AuNP's. Het schimmelextract alleen had geen remmend effect. De vergelijkende trend van remming voor de drie microben wijst op een groter remmend effect op DH5α vergeleken met dat van LBA4404 en M. oryzae (Aanvullend bestand 2:Fig. S1a).

Analyse van antimicrobiële eigenschappen van AuNP's op pathogene bacteriën, schimmels en multi-drug-resistente (MDR) bacteriën. een , v Platen en bijbehorende grafieken die schijfdiffusie-assay van de nanodeeltjes met toenemende remmingszones voor E. coli . Remmingszones verkregen in vergelijkbare testen met b , g Agrobacterium tumefaciens . c , u Magnaporthe oryzae . d , ik MDR E. coli . e , j MDR A. tumefaciens . Alle experimenten werden gedaan met toenemende hoeveelheden AuNP's op papieren schijven; met de klok mee van boven:0,249 ug (20%), 0,498 ug (40%), 0,747 ug (60%), 0,996 ug (80%) en 1,245 ug (100%) AuNP's. Gegevens zijn gemiddelden ± SE van drie replica's. Verschillende letters geven statistisch significante verschillen tussen de steekproeven aan (P < 0,05, Tukey's HSD-test). Effect van AuNP's op de groeicurve van k E. coli , ik A. tumefaciens , m MDR E. coli , en n MDR A. tumefaciens . Sterretjes geven significante verschillen aan om te controleren (Student's t test, P < 0.05). o Microscopie van controle A. tumefaciens cellen. p A. tumefaciens met verlies van cellulaire integriteit na behandeling met de AuNP's

Bepaling van de antimicrobiële activiteit van AuNP's met behulp van multiresistente pathogene bacteriën bij mensen en planten

Multi-drug-resistente (MDR) DH5α en LBA4404 die plasmiden met resistentiegenen dragen, werden gemaakt. De MDR DH5α die pUC19 draagt, was resistent tegen 100 g/ml ampicilline en 35 μg/ml chlooramfenicol. LBA4404 getransformeerd met pCAMBIA2301 was resistent tegen 25 g/ml rifampicine en 50 μg/ml kanamycine. De AuNP's vertoonden krachtige remmende activiteit tegen MDR DH5α en MDR LBA4404 (Fig. 6d, e). Figuur 6i, j zijn de grafieken die de toename in remming tonen met toename van de concentratie van de nanodeeltjes. De vergelijkende trend van remming voor de twee MDR-bacteriën duidt op grotere remmende zones voor A. tumefaciens vergeleken met die van E.coli (Extra bestand 2:Afb. S1b).

Bacteriële groeitest over een tijdsverloop in aanwezigheid van AuNP's

De groeicurve van DH5α behandeld met AuNP's was significant verschillend van de controleset (Fig. 6k, m). In de controlesets van DH5α en MDRDH5α begon de log-fase van de groeicurve binnen 2 uur na inoculatie, terwijl in AuNP-behandelde DH5α en MDR DH5α tot 6 uur na inoculatie geen groei werd waargenomen. De groeicurven bereikten na 12 uur de stationaire fase in zowel controle- als behandelde cellen, maar de groei was significant verminderd in het geval van de behandelde bacteriën. De LBA4404-groeicurve toonde de start van de log-fase 4 uur na inoculatie in de controleset versus 6 uur in de met AuNP behandelde set. Een vergelijkbaar effect op de groeicurve van MDR LBA4404 werd waargenomen, hoewel in de controle MDR LBA4404 de log-fase binnen 2 uur begon (Fig. 6l, n).

Effect van AuNP's op bacteriële celmorfologie en levensvatbaarheid

Over het algemeen kunnen de meeste nanodeeltjes efficiënt hechten aan celmembranen, worden geadsorbeerd en daarna de celintegriteit beïnvloeden [31]. Normaal A. tumefaciens bacteriën zijn staafvormig met duidelijke contouren (Fig. 6o). De bacteriën vertoonden bij incubatie met de AuNP's een vervormde morfologie, desintegratie van het buitenmembraan resulterend in een onregelmatige omtrek en verlies van integriteit van celvorm en -grootte (figuur 6p). Dit is in overeenstemming met wat eerder is waargenomen in E. coli cellen behandeld met silica nanodeeltjes [32]. We ontdekten dat incubatie van bacteriële cellen met de nanodeeltjes gedurende langere perioden volledige desintegratie van cellen liet zien.

Systeem voor kieming van schimmelsporen

De AuNP's waren een krachtige onderdrukker van de virulentie van de plantpathogene schimmel Alternaria solani . Behandeling van schimmelconidia met toenemende doses AuNP's voor verschillende incubatieperiodes toonde een geleidelijke afname van de kiemfrequenties en de lengte van de kiembuizen (figuur 7a). The representative pictures of conidia (Fig. 7a) and graphs show that the percentage of germination (Fig. 7b) and average lengths of the germ tubes (Fig. 7c) emerging from the fungal conidia decreased with increasing doses of the particles and increasing incubation periods. Thus, these AuNPs had significant antifungal property which is mediated through the suppression of germination of spores and retardation in the growth of hyphae.

Effect of the AuNPs on the spore germination of plant pathogenic fungus Alternaria solani; een Spores after treatment with AuNPs (bar = 30 μm). Rows top to bottom:control spores followed by spores treated with different dilutions of AuNPs (15.56 mg/L stock). Columns left to right:increasing time of incubation with AuNPs showing least germination at 6 h incubation with 100% AuNPs. b Spore germination frequency (%) at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Asterisks indicate significant differences to control (Student’s t test, P < 0.05). c Average germ tube length at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Duncan’s multiple range test). Spore germination frequency and the average germ tube length decreased with increasing doses of the AuNPs and increasing incubation period

Thus, these AuNPs have antimicrobial functions on bacteria as well as fungi, which is rarely reported for AuNPs. These AuNPs being toxic to multi-drug-resistant human bacteria can be utilized in treatment of MDR or extensively drug-resistant (XDR) bacteria-related human diseases which are difficult to treat. Furthermore, the antimicrobial effect against typical phytopathogens like Agrobacterium and fungi, it makes the particles suitable for as bacteriocides and fungicides in the form of nano-agrochemicals. These would enable sustainable management of crop loss through elimination of excessive and indiscriminate use of agrochemicals causing deterioration of soil health, degradation of agro-ecosystem, environmental pollution, and resistance in pathogens [33].

The AuNPs have potent apoptogenic properties

The single cell gel electrophoretic assay or comet assay is a sensitive method to compare apoptoic effects of materials [34, 35]. Treatment of tobacco leaf cells with 7.78 mg/L of AuNPs for a period of 15, 20, and 30 min resulted in gradual increase in apoptosis indicated by increase in percentage of DNA in tail (Fig. 8a, ‘A’, ‘B’, ‘C’, ‘D’). The maximum migration of DNA occurred after 30 min of treatment showing a tail DNA value 28.44 ± 0.74% which was significantly higher than that of untreated control cells (1.7 ± 0.59%). The incubation periods of 15 and 20 min caused less DNA migration with tail DNA values of 7.25 ± 2.56 and 19.19 ± 1.54%, respectively (Fig. 8b). Therefore, these AuNPs have the capacity to induce apoptosis in eukaryotic cells in higher doses. Recently, nanoparticles are being used in novel strategies to target and kill cancer cells. As illustrated by dynamic and quantitative imaging, successful application of nanoparticles as an alternative therapy for cancer depends on the apoptotic properties of the particles [36]. Hence, the present finding shows potent apoptogenic properties of these AuNPs which holds promise in future cancer therapy.

Assay of apoptotic properties of the AuNPs. een Comet assay and fluorescent microscopic images of nuclei of tobacco leaves treated with AuNPs for A 0 min. B 15 min, C 20 min, and D 30 min (bar = 5 μm). In the control sets (0 min incubation), most of the DNA is located in the head of the comet while cells subjected to longer treatment show increasing DNA damage and longer comet tails. b Mean of % tail DNA ± SE after different periods of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P < 0.05, Tukey’s HSD test). c Assay of threshold dosage of AuNPs for apoptosis showing images of nuclei of tomato leaf cells treated with A 0% (control), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% of AuNP suspension for 24 h (bar = 10 μm). d Mean % tail DNA ± SE after 24 h treatment with different concentration of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test). Dosage below 10% show negligible DNA damage while higher than 20% show start of DNA damage

These AuNPs are non-apoptogenic at lower doses

Safe application of metal nanoparticles as therapeutic agent needs a pre-determination of biological effect of the particles at the borderline toxicity [37]. A threshold level of nanoparticles required for apoptosis was obtained through treatment of tomato leaf cells with different concentration of AuNP for 24 h (Fig. 8c). Low concentration, e.g., 5% v /v of AuNP stock suspension (15.56 mg/L) did not show significant apoptogenic effect on tomato cells even after 24 h of exposure. The nuclei after 10% AuNP treatment showed 6.52 ± 0.63 percentage of DNA in tail which was higher than untreated control nuclei (0.95 ± 0.66 percentage of DNA in tail) and those treated with 5% AuNP suspension (1.04 ± 0.89 percentage of DNA in tail). Treatment of tomato leaf cells with 15 and 20% AuNP resulted in a slight rise in DNA damage showing 7.15 ± 1.70 and 13.47 ± 2.16 percentage of DNA in tail, showing significant apoptogenic effect (Fig. 8d). Thus, in lower doses apoptogenic effect is negligible holding the possibility for these nanoparticles to be used as antimicrobial agent or drug/gene delivery vehicle in eukaryotic cells.

The AuNPs are protein-coated

A few previous studies have mentioned nanoparticles coated with protein of natural origin [15]. Lower magnification TEM showed that the AuNPs are surrounded by protein-like material (Fig. 9a, b). In order to confirm the nature of the material, the AuNPs were washed and run on SDS-PAGE along with cell-free extracts in other lanes (Fig. 9c). Boiling in SDS served to detach the surface bound proteins from the nanoparticles. The boiled nanoparticles (lane 4) showed the presence of a single intense band of 40 kDa which was similar to a protein band present in lane 2 (cell filtrate). However, in the sample that was not boiled (lane 3), a faint protein band bound to AuNP was seen at the 116 kDa level. Although another faint band did appear at the 40 kDa level due to dissociation of the capping proteins from the particles. Protein coats are known to promote stability of nanoparticles in solution and their catalytic activity [28, 38]. The naturally formed protein coat around the nanoparticles makes them functionally efficient for biomedical uses including easy adsorption and delivery of DNA or hydrophobic drugs [39]. Peptides and protein-aided delivery of AuNPs have been successfully used to overcome blood-brain barrier in treatment of central nervous system disorders [14]. Hence, these biocompatible AuNPs can be potentially suitable for several biomedical applications due to the small size, unique physico-chemical properties, and other advantages.

Protein cap analysis. een , b TEM images showing capping protein layer (arrows) around AuNPs. c SDS-PAGE of extracellular protein secreted from T. crassum and protein associated with nanoparticles. Lane 1, molecular size marker. Lane 2, total extracellular protein. Lane 3, nanoparticles loaded without boiling show faint protein band bound to the AuNPs at 116 kDa mark. There is also a band of detached protein at 40 kDa mark. Lane 4, nanoparticles after boiling with 1% SDS loading buffer showing disappearance of the 116 kDa band and a distinct 40 kDa band. Arrow indicates 40 kDa

The AuNPs could deliver green fluorescence protein (GFP) gene into Sarcoma 180 cancer cell lines

Plasmid DNA pCAMBIA1302 harboring gfp marker gene, complexed with AuNPs, was used to treat Sarcoma 180 cells. The cells produced green fluorescence indicating uptake of plasmid DNA/AuNPs complex and subsequent expression of the gene in the cancer cell, while the cells treated only with naked plasmid DNA did not show the fluorescence (Fig. 10a, b). This confirms the high potential of these particles to not only deliver genes into cancer cells, the genes were stably expressed and remained functional once delivered into the cells.

Gene delivery using AuNPs into Sarcoma 180 cancer cells and hemolysis assay with human erythrocytes; fluorescence microscopic image of a cancer cells expressing green fluorescence protein after uptake of DNA-AuNP complex and b control cells treated with free plasmid DNA (bars = 20 μm). c Percentage hemolysis with different dilutions of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test)

Earlier metallic nanoparticles have been shown to exhibit immense therapeutic potential in treating variety of diseases like retinal neovascularization, HIV, Dalton’s lymphoma, and exhibited activity against hepatitis virus, respiratory syncytial virus, and herpes simplex virus [18]. Congruent to these reports, gold nanocarrier-based drug delivery in present study using AuNPs can be considered as a prospective mediator in numerous medical applications including diagnostics, drug delivery, and cancer therapeutics.

Compatibility of the AuNPs with human erythrocytes and toxicity assay

Erythrocytes are simple and convenient model of the cell membrane system and used for studying nanoparticle-membrane interactions [40]. The hemolytic assay elucidates membrane-lytic activity of the AuNPs at different concentrations. Figure 10c shows that membrane-lytic activity of the nanoparticles was negligible at low concentrations. The highest hemolytic activity found at higher concentrations of nanoparticle suspension (up to 20 μl/mL) was less than 8% which indicates very low blood toxicity. The gradually increasing hemolytic activity with increasing concentration of AuNPs is likely due to increased affinity and adhesion of larger number of particles with the erythrocytes. This affinity of the particles to cell membranes is expected to facilitate their cellular transport. Low hemolytic activity along with effective cellular uptake render nanoparticles highly suitable for the development of safe and efficient theranostic agents [41].