Biologisch afbreekbare Fe-gedoteerde zinkoxide nanopartikelen: een veelbelovend ijzerleveringssysteem voor biologische toepassingen

Samenvatting

IJzer is het cruciale element voor levende organismen en de tekortkoming ervan wordt beschreven als de meest voorkomende voedingsstoornis over de hele wereld. Tegenwoordig worden meer effectieve en veilige ijzersupplementatiestrategieën voor zowel mensen als dieren een van de belangrijkste uitdagingen in de therapie van voedingsdeficiënties. Onze eerdere in vivo studies bevestigden de veiligheid en biologische afbreekbaarheid van in-house geproduceerde zinkoxide-gebaseerde nanopartikelen en hun snelle distributie naar de meerderheid van organen en weefsels in het lichaam. In vitro onderzoeken uitgevoerd op Caco-2 cellijn, een model van epitheele cellen van de maag-darmtract, onthulden een lage toxiciteit van de bestudeerde nanomaterialen. In de huidige studie onderzochten we biologisch afbreekbare zinkoxide nanopartikelen gedoteerd met Fe(III) als een perspectief supplementatiestrategie voor ijzertekort. Biologisch afbreekbare ZnO:Fe nanopartikelen werden intra-gastrisch toegediend aan volwassen muizen en na 24 uur werden de dieren geofferd met verzameling van inwendige organen voor verdere analyses. De ijzerconcentratie gemeten met atomaire absorptiespectrometrie en histologische kleuring (Perls' methode) toonde een snelle distributie van ijzer-gedoteerde nanopartikelen naar weefsels specifiek gerelateerd aan ijzerhomeostase. Accumulatie van ijzer was ook zichtbaar binnen hepatocyten en rond bloedvaten in de milt, wat kan duiden op de overdracht van Fe-gedoteerde nanopartikelen uit de bloedstroom in het weefsel. Samenvattend, de voorlopige resultaten verkregen in de huidige studie suggereren dat biologisch afbreekbare ZnO nanopartikelen gedoteerd met Fe goede dragers van exogeen ijzer in het levende lichaam kunnen zijn. Daarom zijn vervolgonderzoeken gericht op de bepaling van exacte mechanismen gerelateerd aan ijzerdepositie in het weefsel en de invloed van nanopartikeldragers op het ijzer metabolisme vereist.

Inleiding

IJzer is een van de belangrijkste componenten die levende organismen op aarde bouwen, inclusief de menselijke bevolking. Het belang van dit element is gerelateerd aan de essentiële rol van ijzer in veel structuren en processen die in het lichaam plaatsvinden, bijv. zuurstoftransport door het hele lichaamsweefsel en cellen (deel van hemoglobine en myoglobine), energieproductie (component van mitochondriale respiratoire keten eiwitten) en nog veel meer [1, 2]. Dus ijzer neemt deel aan cruciale levensprocessen van cellen en het hele organisme en de tekortkoming ervan kan leiden tot significante storingen in het functioneren van het levende lichaam.

Wereldwijde rapporten tonen aan dat ijzertekort een ernstig volksgezondheidsprobleem is in de menselijke bevolking. Volgens de WHO was bijna 30% van de samenleving over de hele wereld beïnvloed door anemie in de jaren 1993-2005. De prevalentie van anemie is nog veel groter bij jonge kinderen en zwangere vrouwen [3]. Het belang van ijzersupplementatie tijdens zwangerschap is gerelateerd aan het feit dat ijzertekort een risicofactor is voor voortijdige geboorte, laag geboortegewicht van pasgeborenen en hun algemene slechtere gezondheidstoestand [4]. In het geval van zuigelingen en jonge, kleuterkinderen, wordt het risicofactor van ijzertekort veroorzaakt door de snelle groei van het hele lichaam en het daaropvolgende verbruik van de ijzervoorraden; dus wordt ijzersupplementatie ook aanbevolen voor kinderen tussen 0 en 5 jaar oud [5]. Interessant zijn er wetenschappelijke rapporten die de correlatie van een goed ijzerniveau bij kinderen en hun emotionele en neuropsychologische ontwikkeling aangeven [6]. Bovendien is ijzertekort ook een ernstige voedingsstoornis onder andere zoogdiersoorten, met name bij zuigende biggen, waar beperkte intra-uteriene toelevering van dit element gekoppeld is aan een laag ijzergehalte in zeugmelk [7, 8]. Ook de snelle groei van de biggen ontdoet snel de restanten van ijzervoorraden, aangezien biggen binnen een paar dagen hun lichaamsgewicht verdubbelen, wat het aantal rode bloedcellen en het algemene bloedvolume verhoogt. Tegenwoordig is een meer effectieve en veilige ijzersupplementatiestrategie voor zowel de menselijke als dierlijke bevolking een van de belangrijkste uitdagingen in de preventie en therapie van voedingsdeficiënties.

Er zijn drie belangrijke manieren van extra ijzertoelevering aan het levende organisme: intraveneus, intramusculair en oraal. Elk van hen vertoont zowel voor- als nadelen van de methode. Orale toediening lijkt eenvoudig en natuurlijker voor het lichaam, betrokken bij fysiologische paden van ijzerabsorptie en transportsystemen. Ook behoudt deze methode een natuurlijk systeem dat de hoeveelheid circulerend ijzer in het lichaam controleert op basis van hepcidine [9]. Echter, de orale route van supplementatie wordt vaak geplaagd door slechte absorptie en lage eind-efficiëntie. Wetenschappelijke studies rapporteerden ook dat de standaard, oplosbare orale ijzersupplementatiestrategie de samenstelling en metabolische activiteit van het darmmicrobioom van dieren sterk beïnvloedt [10]. Aan de andere kant worden intraveneuze of intramusculaire manieren van ijzertoelevering aan het organisme belemmerd door het risico op toxische bijwerkingen [11]. Bovendien is in de industrielle varkenshouderij de standaardmethode van ijzersupplementatie gebaseerd op individuele, intramusculaire toediening van een enkele dosis ijzer-dextran stressvol voor dieren en lastig voor fokkers. Ook onjuist uitgevoerde injecties kunnen ontstekingen en andere complicaties bij dieren veroorzaken, evenals bijdragen aan het verspreiden van verschillende ziekten in de kudde, wanneer steriele omstandigheden niet in acht worden genomen.

De bovengenoemde toxische bijwerkingen van exogeen ijzer aan het levende organisme zijn geassocieerd met het voorkomen van vrij en ongebonden ijzer in het lichaam, wat als overgangsmetaal (door verandering in valentie) kan leiden tot productie van schadelijke vrije radicalen (naamelijk reactieve zuurstofsoorten - ROS) door de Fenton-reactie [12]. Wetenschappelijke rapporten gaven een verhoogd risico op vrije radicalen in het organisme als factor die bijdraagt aan diverse aandoeningen waaronder: bacteriële infecties, neoplasie, of leverziektes [13]. De natuurlijke, fysiologische strategie om de generatie van ROS door vrij ijzer te voorkomen, is gebaseerd op het binden van het ijzer-element met specifieke eiwitten op elke stap van de absorptie- en transportpaden in het lichaam. In het geval van orale ijzeroverbelasting en intraveneuze/intramusculaire toediening, worden de fysiologische paden van ijzercirculatie over het algemeen overweldigd, wat resulteert in een snelle toename van ROS [14].

IJzer-gebaseerde nanopartikelen (Fe-gebaseerde NPs) zijn breed bestudeerd als een veelbelovend hulpmiddel voor biomedicale doeleinden. Het meest uitgebreide gebruik van deze nanostructuren is gerelateerd aan hun magnetische eigenschappen; dus zijn ze meestal getest als contrastmiddelen voor klinische diagnostische technieken gericht op tumorimaging of accumulatie in specifieke weefsels [15]. Recent zijn nanostructuren ook bestudeerd als een nieuwe, meer effectieve vorm van levering van bioactieve stoffen aan het organisme. NP-dragers kunnen aanzienlijk verhoogde biobeschikbaarheid voor het levende organisme onthullen, vergeleken met stoffen in bulkvorm, wat meestal gerelateerd is aan hun kleinere grootte [16, 17]. In één van de studies werd de effectiviteit van NPs bevattend ijzer vergeleken met ferrousulfate (standaard supplement voor het behandelen van anemie) in anemische ratten. Op basis van bloedanalyses toonden de verkregen resultaten een verhoogde ijzerbiobeschikbaarheid na orale, enkele dosis NPs met ijzer in anemische dieren. In het geval van meerdere doses nanopartikelen en ferrousulfate, waren de verkregen resultaten vergelijkbaar [18]. Een andere studie beschreef de verkregen resultaten van Fe-gebaseerde nanomaterialen als alternatieve ijzerleveringsagenten op mensen en een knaagdiermodel. Auteurs benadrukten met name de superieure veiligheid van nanoFe vergeleken met oplosbare vormen van ijzer, wat resulteerde in afwezigheid van ijzeraccumulatie in de darmmucosa en bevordering van nuttige microbiota [19]. Evenzo veelbelovende resultaten werden verkregen in de studie aan anemische ratten behandeld met Fe-gebaseerde NPs bekapt met vitamine C, wat het vermijden van de standaardroute van Fe-absorptie uit de maag-darmtrakt toestond. De verkregen resultaten gaven herstel van de geteste dieren van de anemische ziekte samen met verbetering van hun bloedparameters binnen korte tijd, vergeleken met de standaardmethode van ijzertekorttherapie [20].

Materiaal en methoden

Synthese van nanopartikelen

Zinkoxide nanopartikelen gedoteerd met ijzer (ZnO:Fe NPs) werden gesynthetiseerd met behulp van microgolf hydrothermale techniek. De methode is goed gevestigd, relatief goedkoop, bio-vriendelijk en industriëel schaalbaar, capabel om verschillende vreemde ionen als functionele dopanten [21,22,23,24,25] in een verscheidenheid van oxiden [26,27,28] te introduceren. De concentratie ijzer in de huidige nanopartikelen was ingesteld op 5% molaire. De synthese werd uitgevoerd uitgaande van nitraten(V): Zn(NO₃)₂·6H₂O (99%, Sigma–Aldrich) en Fe(NO₃)₃·9H₂O (96%, Carl Roth). We hebben diverse leveranciers getest en gekozen voor degenen die het meest uniforme product aanboden dat geen meetbare niveaus van onoplosbare restanten bevatte. De verbindingen werden opgelost in gedestilleerd water: 17,63 g zinknitraat(V) en 1,25 g ijzer(III) nitraat(V). De heldere oplossing werd vervolgens gealkaliseerd met 25% waterige ammoniakoplossing (Carl Roth) tot pH 8. Het resulterende rode residu werd gewassen met een Büchner-klep, met ~ 1 l gedestilleerd water en zuiggefilterd. Het neerslag werd in een 100-ml Teflonvat geplaatst, gevuld met water tot 80% van het volume en vervolgens gesloten in een Ertec Magnum II reactorkamer. Het microgolf hydrothermale proces werd uitgevoerd bij 4 MPa gedurende 20 min. Na de reactie werd het bleekrode product verzameld en overnachten gedroogd bij 60 °C.

Karakterisatie van nanopartikelen

De karakterisatie van het product werd uitgevoerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), fotoluminescentie (PL) en kathodoluminescentie (CL) spectroscopie, en energie-dispersieve elementaire analyse (EDX). SEM-metingen werden uitgevoerd met hoge resolutie (1 nm) Hitachi SU-70 microscoop, uitgerust met karakteristieke stralingsdetector en kathodoluminescentiesysteem GATAN Mono CL3 in secundaire elektronen (SE) en transmissie (TE) modi. De fotoluminescentie-emissie en -excitatie spectra werden opgenomen met Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3 spectrofluorimeter, uitgerust met een xenonlamp als excitatiebron en Hamamatsu R928P fotomultiplier. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zetapotentiaal werden gemeten met DelsaMax Pro deeltjekarakteriseringssysteem. Thermogravimetrische analyse (TGA) werd uitgevoerd met NETZSCH STA 449 F1 Jupiter thermogravimeter onder argonstroom. SEM-metingen werden uitgevoerd na depositie van de nanopartikelen op het Agar polycarbonaat-gelamineerde 400 koperen gaas. Het monster werd opgelost in gedestilleerd water met behulp van Sonics VCX500 ultrasoon processor, en vervolgens werd een druppel van de suspensie op het gaas geplaatst en gedroogd. Het monster werd voorbereid na 2-uurs sedimentatie van zwaardere deeltjes.

In vitro model

Voor de huidige studie werd Caco-2 cellijn (Caucazische coloncarcinoom cellen) gebruikt, als model van epitheele cellen van de maag-darmtract. De cellijn werd verkregen van The European Collection of Authenticated Cell Cultures—ECACC (Sigma–Aldrich, Cat. Nr. 86010202). Cellen worden gezaaid met 0,5 × 10⁶ cellen/ml op 6-put of 96-put platen en onderhouden in Dulbecco's Modification of Eagle's Medium—DMEM (Gibco), aangevuld met 10% foetaal bovineserum—FBS (Gibco), 1% niet-essentiële aminozuren—NEAA (Gibco), 1% penicilline–streptomycine–neomycine—PSN (Gibco), en 0,2% natriumbicarbonaat (Gibco) bij 37 °C en 5% CO₂. Wanneer 95-100% confluentie werd waargenomen, werd het celcultuurmedium verwijderd en suspensie van ZnO:Fe NPs in vers groeimedium toegevoegd. Cellen werden geïncubeerd met vier verschillende concentraties ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; en 0,001 mg ZnO:Fe NPs/ml) gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO₂.

Cellevensvatbaarheidsanalyses

Cellevensvatbaarheid werd beoordeeld voor Caco-2 met behulp van twee methoden: XTT-assay en Trypan blauw kleuring. Alle reagentia vereist voor de XTT-assay werden geleverd uit de commerciële kit (Cell Proliferation Kit II, Roche). Na de incubatie van cellen gegroeid op 96-put plaat met verschillende concentraties ZnO:Fe NPs, werden cellen geïncubeerd met 50 μl XTT labelmengsel gedurende 4 uur bij 37 °C en 5% CO₂. Vervolgens werd de concentratie formazan beoordeeld met spectrophotometrische methode. De absorbantie werd gemeten bij 470/650 nm en resultaten gecorreleerd met het aantal levensvatbare cellen. In het volgende experiment werd het hoogste absorbantieresultaat aangenomen als 100% levensvatbaarheid van cellen. Eindresultaten werden berekend op basis van vier, afzonderlijke experimentreplicaten (n = 4).

Om trypan blauw kleuring uit te voeren, na de cellen gegroeid op 6-put platen geïncubeerd waren met verschillende concentraties ZnO:Fe NPs, werden cellen verzameld (0,05% trypsine en 0,2% EDTA gedurende 10 min), gecentrevueerd en het pellet weer opgelost in 1 ml groeimedium. Honderd microliter steriele 0,4% trypan blauw oplossing werd gemengd met 100 μl celsuspensie. Tien microliter van het monster werd geladen op de telplaat en geanalyseerd met JuLi Br Telling Software (NanoEnTek) voor het beoordelen van het aantal levensvatbare cellen. Eindresultaten werden berekend op basis van drie, afzonderlijke experimentreplicaten (n = 3).

Diermodel

Voor doeleinden van deze voorlopige studie werden volwassen, mannelijke Balb-c muizen (n = 6) individueel gehouden onder standaard en gecontroleerde leefomstandigheden (12/12-uur licht-donker periode, 25 °C, vochtigheid 30%) met standaard voer en water (ad libitum). Alle procedures werden geaccepteerd door het Lokale Ethische Comité, akkoord nr. WAW2/59/2017. Na 7 dagen acclimatisatie werd een suspensie van ZnO:Fe NPs in water (10 mg/ml; 0,3 ml/muis) toegediend door orale gavage (IG) aan dieren uit de experimentele groep (n = 4). Muizen uit de controlegroep ontvingen 0,3 ml drinkwater door IG (n = 2). Tijdens het experiment merkten we geen gedragsveranderingen in geteste dieren noch weefselafwijkingen. Na 24 uur werden muizen uit zowel experimentele als controlegroep geofferd in CO₂-O₂ kamer (CO2 Box, Bioscape, Merazet) met daaropvolgende verzameling van weefsels. De helft van de vers verzamelde monsters werd bevroren in −20 °C voor atomaire absorptiespectrometrie (AAS). De tweede helft van de weefsels werd vastgezet in 4% gebufferde formaline en overgebracht naar 70% ethanol (na 24 uur). Vervolgens werden monsters gedeshydrateerd in toenemende concentraties ethanol, in paraffine ingebed (Leica TP1020, Leica EG1150) en 6-μm-dunne (of 4 μm-dunne voor histopathologische onderzoeken) microscopische preparaten werden bereid met microtome (Leica RM2255).

IJzeraccumulatie beoordeeld door Perls' kleuring

Microscopische preparaten van milt, lever, en hersenen werden gekleurd met Perls' methode (Prussisch blauw) voor de aanwezigheid van ijzer. Monsters werden gedeparaffineerd en gerehydrateerd tot gedestilleerd water, vervolgens in een werkende oplossing geplaatst met gelijke delen van 5% kaliumferricyanide (Sigma–Aldrich) en 5% zoutzuur (Sigma–Aldrich) en 30 min gekleurd. Vervolgens werden coupes gespoeld in water en tegengekleurd met nuclear-fast rood (Sigma–Aldrich) gedurende 5 min, gespoeld in water, en gemonteerd onder de dekkerslipjes met Permount (Fisher Scientific). Afbeeldingen van gekleurde monsters werden genomen met Olympus BX60 microscoop en Cell^P beeldverwerkingssoftware. Van elk getest monster werden 16 willekeurig gekozen afbeeldingen geselecteerd voor verdere onderzoeken met MicroImage v.4.0 (Olympus) volgens intern beeldanalyseprotocol [29]. Voor miltonderzoeken werd alleen rood pulp binnen het weefsel in aanmerking genomen tijdens analyses. Ijzergehalte werd berekend als verhouding van oppervlakte en intensiteit van ijzer-positieve kleuringen (blauwe kleur) tot het oppervlakte van celkernen binnen een afbeelding.

IJzerconcentratie in geteste weefsels gemeten met atomaire absorptiespectrometrie

Eerder verzamelde, opgeslagen in −20 °C, en vervolgens ontdooide weefselmonsters werden voorbereid voor verdere kwantitatieve beoordeling van ijzerconcentratie met atomaire absorptiespectrometrie (AAS) methode, volgens het protocol dat eerder in detail beschreven is [24]. Kortweg, weefsels werden gewogen en bewaard voor > 16 uur in de oplossing bevattende 5 ml 65% salpeterzuur en 1 ml 30% waterstofperoxide (Merck). Vervolgens werden monsters gemineraliseerd in het microgolfsysteem Ethos 900 (Milestone, USA) tot vloeibare oplossing en geëvalueerd met AAS (Perkin-Elmer) voor ijzergehalte.

Statistische analyse

De in de studie verkregen gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voor statistische evaluatie van ijzeraccumulatie verkregen met Perls' kleuring, werden eénrichtings ANOVA met Tukey-Kramer meervoudige vergelijking post-hoc test uitgevoerd voor alle groepen. Voor het evalueren van een significant verschil tussen controle- en experimentele groepen uit AAS analyses, werd een ongepaarde t-toets gebruikt. Significante verschillen tussen controle- en experimentele groepen in in vitro experimenten werden geëvalueerd met behulp van eénrichtings ANOVA met Dunnett meervoudige vergelijkingstest. Statistische analyses werden berekend met GraphPad InStat 3.10. Voor alle testen werden verkregen resultaten beschouwd als statistisch significant met P ≤ 0,05 en P ≤ 0,01 en P ≤ 0,001 als hoogst en extreem significant.

Resultaten

Karakterisatie van nanopartikelen

Scanning elektronenmicroscopie (SEM) afbeeldingen van als gekristalliseerd in microgolf hydrothermale proces ZnO:Fe nanokristallen worden weergegeven in Fig. 1. Het droge poeder opgeslagen na de synthese werd gedispergeerd in water met ultrasoonbad, en vervolgens gedeponeerd op het koperen 400 gaas. De suspensie voortkomend van de ultrasoonbehandeling werd 2 uur gelaten voor agglomeratie en sedimentatie van grote korrels. In het monster worden meestal ZnO kristallen gezien gevormd in de vorm van uitgezaaide zeshoekige prismata. Kristallen zijn uitgezaaid in de richting van c-vlakken groei—[001]. Het snijpunt van prismata is duidelijk zichtbaar op de afbeelding: zeshoeken zijn 50-100 nm in grootte. Basis zijn nanopartikelen geagglomereerd en vormen grotere structuren. In Fig. 1b is een dergelijke structuur van zwaar geagglomereerde en gegroepeerde ZnO:Fe kristallen weergegeven. Het monster is ook samengesteld uit niet-uniforme korrels welke grootteverdeling bevat tussen honderden nanometer en micrometer. Er is geen duidelijke indicatie van afzonderlijke andere dan ZnO fase existentie, wat afwezigheid van ijzer-gebaseerde fase (bijv. ijzeroxide) kristallisatie suggereert [30].

Thermogravimetrische analyse (TGA) en differentiele scanning calorimetrie (DSC) werden uitgevoerd onder argonstroom van kamertemperatuur tot 800 °C en de verkregen resultaten worden weergegeven in Fig. 2. De eerste massaafname vond plaats tot 200 °C en veroorzaakte een afname van de monstermassa met 4,78% ten opzichte van de initiële massa. De tweede afname werd geregistreerd tussen 200 en 400 °C en de waarde is ongeveer 7,36%. Er waren geen andere massa-afnames tot 800 °C. De eerste was gerelateerd aan de verdamping van oppervlakte geadsorbeerde watermoleculen en de tweede waarschijnlijk veroorzaakt door een reductie van hydroxylgroepen. DSC-kromme toont endotermische piek bij 118,3 °C (−0,6175 mW/mg, verdamping van water) en exothermische piek bij 283,1 °C (0,4356 mW/mg, ontbinding van hydroxylgroepen). Klein effect gerelateerd aan ontbinding gaf aan dat bijna volledige kristallisatie van ZnO:Fe nanopartikelen plaatsvond in microgolf hydrothermale proces.

Figuur 3 toont kamertemperatuur fotoluminescentiespectra van ZnO:Fe NPs. Emissiespectrum (Fig. 3a) bestaat uit twee kenmerken: lage intensiteit smalle nabij-bandrand (NBE) luminescentie en zeer intense brede diepe niveaumissie (DLE) luminescentie. De eerste piekt bij ~ 380 nm terwijl de tweede bij 600 nm. Dominantie van DLE intensiteit op het spectrum suggereert dat verkregen nanokristallen sterk gedefecteerd waren op kristallografisch niveau [31,32,33]. Excitatiespectrum (Fig. 3b) wijst op het mechanisme van emissie van diepe niveaus in de bandkloof van ZnO:Fe.

Kathodoluminescentiespectrum van ZnO:Fe NPs wordt weergegeven in Fig. 4; DLE/NBE intensiteitsverhouding is ≈ 25. NBE-band piekt bij ca. 380 nm, DLE-band bevat vier componenten piekend bij ~ 570, 625, 653 nm en zeer zwak bij 770 nm. Volgens McCluskey en Jokela [34], is 570-nm band gerelateerd aan zuurstofvacatures, terwijl andere toegewezen werden aan zinkvacatures in de wurtziet-type rooster [35].

Hoeverheid ijzer in het monster werd bepaald met behulp van twee technieken: atomaire absorptiespectroscopie (AAS) en energie-dispersieve Röntgenspectroscopie (EDX). In het geval van AAS werd de suspensie vergelijkbaar bereid als gebruikt in knaagdierenexperiment geanalyseerd om 3,98 atomaire % Fe in de ZnO:Fe aan te geven. Door EDX-methode werd droog poeder geanalyseerd in het koperen gaas om concentratie ijzer van 4,5% at. te vinden in relatie tot de zinkionen.

De suspensie-eigenschappen werden gemeten met DLS en TEM methoden, met verdeling van nanopartikeldiameters weergegeven in Fig. 5. Verdeling is bimodaal: voor één populatie was de meest frequente diameter piekend tussen 20 en 100 nm (TEM) alsook tussen 50 en 200 nm (DLS). De tweede populatie bevat lagere hoeveelheid grotere objecten 100-500 nm (TEM) en ca. 150-500 nm (DLS). Bimodale karakter van nanopartikelen wordt duidelijk waargenomen door beide getoonde methoden. Hoge dispersie van groottes in de grotere populatie geeft aan dat het correspondeert met geagglomereerde nanopartikelen. Statistieken getoond voor diameters boven 100 nm wijzen op veel verschillende manieren waarop ZnO:Fe nanopartikelen agglomereren. De nanopartikelen in watersuspensie waren negatief geladen zoals onthuld door zetapotentiaal onder 0 V. Waarde van ongeveer −40 mV gaf ook aan dat de eindige watersuspensie stabiel was en nanopartikelen geen affiniteit hadden voor agglomeratie.

In vitro toxicologische evaluatie van ZnO:Fe nanopartikelen

Beide cellevensvatbaarheidsanalyses (XTT en Trypan Blauw) onthulden verminderde absorbantie van Caco-2 cellen geïncubeerd met ZnO:Fe NPs, wat direct gecorreleerd was met het aantal levensvatbare cellen. Statistisch significante veranderingen werden alleen waargenomen na 24-uurs blootstelling van geïncubeerde cellen aan de hoogste concentraties NPs (1,0 en 0,1 mg/ml), terwijl fysiologische niveaus van NPs concentratie (0,01 en 0,001 mg/ml) geen significant effect hadden op celcultures (Fig. 6 en 7).

IJzerdistributie in diermodel

Voor het beoordelen van in vivo ijzerbeschikbaarheid uit ZnO:Fe NPs, muizen (n = 4) ontvingen oraal suspensie van ZnO:Fe NPs en na 24 uur werden dieren geofferd met verdere verzameling van cruciale weefsels. Kwantitatieve evaluatie van ijzergehalte binnen onderzochte weefsels werd geanalyseerd met AAS-methode voor alle verzamelde organen en berekend met Micro Image software (gebaseerd op Perls' kleuring) voor lever, milt, en hersenweefsels. Gepresenteerd in Fig. 8, tonen gegevens een verhoogd niveau van ijzergehalte (vs. controle) in hart, skeletspier, milt, en dunne darm weefsels 24 uur na orale toediening van ZnO:Fe NPs (geen statistisch significante toename. In het geval van bot, was het gemiddelde niveau van ijzer binnen de experimentele groep slechts lichtjes hoger dan in het controle-resultaat. Gehalte van ijzer in lever en hersenweefsels was significant verhoogd (P ≤ 0,01) 24 uur na IG van ZnO:Fe NPs, vs. controle groep (Fig. 8). In de nieren, visceraal en subcutanaal vetweefsel, en longen, daalde Fe-niveaus 24 uur na toediening van ZnO:Fe NPs.

Evaluatie van ijzergehalte gekleurd met Perls' methode binnen de lever onthulde een extreem significante (P ≤ 0,001) verhoogde Fe-niveau in alle experimentele vs. controle dieren (Fig. 9b). Op dezelfde manier toonden resultaten verkregen voor het rode pulp van miltweefsel een extreem significante (P ≤ 0,001) toename van ijzergehalte in alle experimentele vs. controle dieren (Fig. 10b). Gegevens verkregen uit de analyse van hersenweefsel gaven geen toename van Fe in experimentele groep 24 uur na IG van ZnO:Fe NPs aan (Fig. 11b).

In het geval van ijzergehalte van elk dier uit experimentele en controle groepen, werden resultaten verzameld in Fig. 9a, 10a, en 11a. Het hoogste en significant verschillende (P ≤ 0,05 en P ≤ 0,01) niveau van ijzer binnen leverweefsel werd gedetecteerd voor muizen – 2 (24 u 2), vergeleken met resultaten van controlegroep (Fig. 9a). Niveaus van ijzerkleuringen in rode pulpen van de milt binnen de experimentele groep waren vergelijkbaar; de meeste waren echter statistisch hoger (P ≤ 0,05 of P ≤ 0,01) dan muis – 1 (CTRL 1) uit de controlegroep (Fig. 10a). Resultaten verkregen voor hersenweefsel waren vergelijkbaar tussen elk dier uit experimentele en controle groepen (Fig. 11a).

Coupes van lever- en miltweefsels gekleurd met Perls' methode werden ook kwalitatief beoordeeld. Verhoogd aantal ijzerdeposities (lichtblauwe kleuringen) was zichtbaar binnen hepatocyten van levercoupes van experimentele groep (Fig. 12).

Algemene grotere accumulatie van ijzer (blauwe kleuringen) binnen het rode pulp dan in wit pulp van milt werd waargenomen in zowel controle- als experimentele groepen (Fig. 13). Na toepassing van ZnO:Fe NPs, was het hogere niveau van ijzer met name zichtbaar binnen het rode pulp, vergeleken met afbeeldingen van controle groep (Fig. 13c, d). In experimentele groep was een verhoogde concentratie van ijzer ook waarneembaar rond bloedvaten (Fig. 13b, d).

Discussie