Evaluatie van C60 Fullerene's Modulatie van Difenyl-N-(Trichlooracetyl)amidofosfaat-DNA Binding en Cytotoxiciteit in Humane Leukemiecellen

Samenvatting

Een nieuwe vertegenwoordiger van carbacylamidofosfaten - difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL), dat twee fenoxy-substituenten in de buurt van de fosforylgroep bevat, werd gesynthetiseerd, geïdentificeerd door elementaire analyse en IR en NMR-spectroscopie, en getest als cytotoxisch agens zichzelf en in combinatie met C₆₀ fullereen.

Volgens moleculaire simulatieresultaten kunnen C₆₀ fullereen en HL met DNA interageren en een rigide complex vormen, gestabiliseerd door stapelingsinteracties van HL fenylgroepen met C₆₀ fullereen en DNA G-nucleotide, alsook door interacties van HL CCl₃ groep door ion-π bindingen met C₆₀ molecuul en door electrostatische bindingen met DNA G-nucleotide.

Met behulp van de MTT-test werd de cytotoxische activiteit van HL tegen humane leukemische CCRF-CM cellen aangetoond met een IC₅₀ waarde gedetecteerd bij 10 µM concentratie na 72 uur celbehandeling. Onder gecombineerde werking van 16 µM C₆₀ fullereen en HL werd de IC₅₀ waarde gedetecteerd bij een lagere 5 µM HL concentratie en een vroegere 48 uur incubatieperiode, en bovendien werd het cytotoxische effect van HL waargenomen bij een lage 2,5 µM concentratie waarbij HL zichzelf geen invloed had op cellevensvatbaarheid. Binding van C₆₀ fullereen en HL met de kleine DNA-groef met vorming van een stabiel complex wordt verondersteld een van de mogelijke redenen te zijn voor hun synergistische inhibitie van CCRF-CEM celproliferatie.

Toepassing van C₆₀ fullereen in combinatie met 2,5 µM HL bleek geen schadelijk effect te hebben op de structurele stabiliteit van bloederythrocytenmembranen. Dus, de gecombineerde werking van C₆₀ fullereen en HL in een lage concentratie versterkte het cytotoxische effect van HL tegen humane leukemische cellen en werd niet gevolgd door hemolytisch effect.

Achtergrond

De vertegenwoordiger van koolstofnanostructuur C₆₀ fullereen blijkt unieke fysicochemische eigenschappen en biologische activiteit te bezitten, niet alleen als antioxidant of fotosensitizer maar ook als modifier van de toxische effecten van antikankermiddelen vanwege zijn vermogen om de cel binnen te dringen en te functioneren als medicijndrager [1,2,3,4]. C₆₀ molecuul kan interageren met chemotherapeutische middelen zoals doxorubicine, cisplatine, en paclitaxel en kan complexes met ze vormen die het therapeutische effect versterken [5,6,7,8].

Carbacylamidofosfaten (CAPh) zijn organische moleculen die aandacht hebben getrokken vanwege hun bijzondere structuur, biologische activiteit, en perspectieven van biomedische toepassing [9,10,11,12]. De aanwezigheid van peptideo fosforamidegroepen gecombineerd in het fragment C(O)N(H)P(O) van het molecuul bepaalt de interactie met biologische moleculen en celmembranen. Variatie van substituenten in de buurt van fosforyl- en carbonylgroepen geeft de mogelijkheid om CAPh stereochemische en farmacologische eigenschappen te moduleren. In het bijzonder bleken verschillende CAPh vertegenwoordigers antineoplastische activiteit te bezitten [13, 14].

Onlangs hebben we bevestigd dat CAPh vertegenwoordiger dimethyle-N-(benzoyl)-amidofosfaat gebruikt in millimolaire concentratiebereik de levensvatbaarheid van leukemische L1210 cellen verlaagde en dat het toxische effect werd vergemakkelijkt door C₆₀ fullereen [15]. We hebben ook getoond dat de introductie van additionele aromatische substituenten en elektronegatieve CCl₃ groep in de CAPh-structuur resulteerde in versterking van de toxiciteit [16]. Dus werd een significant toxisch effect van dimorfolido-N-trichlooracetylfosforamide getoond tegen humane leukemische cellen van verschillende oorsprong, maar de effectieve concentratie was nog steeds hoog en geen versterking van toxiciteit na gecombineerde werking met C₆₀ fullereen werd waargenomen. In voortzetting van deze onderzoeken synthetiseerden we een nieuwe vertegenwoordiger van CAPh difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) die twee fenoxy-substituenten heeft in plaats van morfolido-groepen in de buurt van de fosforylgroep (Fig. 1).

De structuur van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL).

Het doel van het onderzoek was om de biologische activiteit van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) alleen of in combinatie met C₆₀ fullereen te schatten met behulp van in silico analyse van hun interactie met DNA en in vitro studie van cytotoxische effecten tegen humane leukemische celijn.

Methoden/Experimenteel

Chemicaliën

RPMI 1640 vloeibaar medium, Fetal Bovine Serum (FBS), Penicilline/Streptomycine en L-glutamine (Biochrom, Duitsland), Dimethylsulfoxide (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Duitsland), MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazoliumbromide] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., VS), HCl (Kharkivreachim, Oekraïne).

Karakterisering van Chemische Stof

Om de oplosbaarheid te verhogen, hebben we het natriumzout van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) verkregen volgens de volgende reacties (Fig. 2).

Schema van oplosbaarheid van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) in natriumzout.

De trichloorfosfazotrichlooracetyl oplossing (0,035 M) in 200 ml chlorofoorm werd langzaam toegevoegd aan een goed geroerde natriumfenolaat suspensie (0,106 M, 12,3 g) in 150 ml chlorofoorm (Fig. 2; stap 1). De mengseltemperatuur mocht niet boven 40–50 °C stijgen. Roeren werd ongeveer 1 uur voortgezet, en daarna werd de oplossing op 70 °C verhitt en 20 min onder deze condities geroerd. Het resulterende product trifenoxyfosfazotrichlooracetyl werd uitgeparend. Daarna werd 40 ml 1 M NaOH toegevoegd en 90 min teruggekoken (Fig. 2; stap 2). Een resulterende mengsel werd uitgeparend. Het vaste neerslag van natrium HL werd driemaal gewassen met diethylether en gerecrystalliseerd uit i-propanol als een wit kristallijn poeder (80% opbrengst). Kleurloze kristallen van NaL·3H₂O geschikt voor Röntgenanalyse werden verkregen door langzame verdamping van i-PrOH:H₂O (9:1 v/v) oplossing. De stof is luchtstabiel, hoog oplosbaar in water en alcoholen. Smpt. 215 °C.

HL werd geïdentificeerd door elementaire analyse en IR en NMR-spectroscopie: elementaire analyses (C, H, N) werden uitgevoerd met de EL III Universele CHNOS elementaire analyzer. IR-spectrale metingen werden uitgevoerd voor monsters als KBr-tabletten op een Perkin–Elmer Spectrum BX FT-IR spectrometer met resolutie van 2 cm⁻¹ en accumulaties van 8 scans, die gecombineerd worden om willekeurige absorptie-artefacten in het spectrale bereik 4000–400 cm⁻¹ te gemiddelen. ¹H NMR-spectra in DMSO-d6 oplossingen werden opgenomen op een AVANCE 400 Bruker NMR-spectrometer bij kamertemperatuur.

HL: IR (cm⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amide II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹H NMR (DMSO-d₆): 7,05 (t, 2H, γ-CH₂); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- en β-CH₂).

Voor CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂ werd de elementaire samenstelling bepaald, %: C 40,58, H 2,35, N 3,15; en berekend, %: C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Synthese en Karakterisering van C₆₀ Fullerene

Een uiterst stabiele waterige colloïdale oplossing van C₆₀ fullereen (200 µM, zuiverheid > 99,5%, gemiddelde deeltjesgrootte tot 50 nm) werd gesynthetiseerd in de Technische Universiteit Ilmenau (Duitsland) zoals beschreven in [17, 18].

Celkweek

De experimenten werden uitgevoerd op humane acute T-cel leukemische CCRF-CM cellijn. Cellijn werd aangeschaft van het Leibniz Instituut DSMZ-Duitse Collectie van Micro-organismen en Celcultures: CCRF-CM (ACC 240). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1% Penicilline/Streptomycine, en 2 mM Glutamine, gebruikmakend van 25 cm² flessen bij 37 °C met 5% CO₂ in een vochtige incubator.

Cellen in RPMI 1640 medium werden geïncueerd met C₆₀ fullereen (16 µM) of HL (2,5, 5, en 10 µM) apart en samen gedurende 24, 48, en 72 uur. Cellevensvatbaarheid zonder toevoeging van HL of C₆₀ fullereen werd ontvangen als 100% (controlemonster bevatte 0,05 M DMSO).

Cellevensvatbaarheid (MTT) Toets

Cellevensvatbaarheid werd beoordeeld door de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazoliumbromide] reductietoets [19]. Op aangewezen tijdstippen van incubatie, werden 100 µl aliqouten (0,5 × 10⁴ cellen) in de 96-put microplaten Sarstedt (Nümbrecht, Duitsland) geplaatst, 10 µl MTT-oplossing (5 mg/ml in PBS) werd aan elke put toegevoegd, en de platen werden nog 2 uur geïncueerd bij 37 °C. Het kweekmedium werd vervolgens vervangen door 100 µl DMSO; diformazanvorming werd bepaald door absorptie te meten bij 570 nm met een microplaatlezer Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Zwitserland).

Dieren

De studie werd uitgevoerd op witte mannelijke ratten van de "Wistar" lijn van 170 ± 5 g. De dieren werden onder standaardcondities in het vivarium van het ESC "Instituut voor Biologie en Geneeskunde," Taras Sjtsjenko Nationale Universiteit van Kiev, gehuisvest. Dieren hadden vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale beginselen van het Europees Verdrag voor bescherming van gewervelde dieren onder controle van de Bio-Ethiekcommissie van de bovengenoemde instantie.

Schatting van Erythrocyten Hemolyse

Erythrocyten werden verkregen uit gehepariniseerd bloed van de "Wistar" lijn rat en gedilueerd in 0,85% NaCl oplossing tot 0,700 o.u. bij 630 nm op de Scinco spectrophotometer (Duitsland). Hemolyse van erythrocyten werd veroorzaakt door 0,001 N HCl. De kinetiek van hemolyse werd spectrophotometrisch (λ = 630 nm) elke 10 s gedurende 2 min gemeten. Het percentage gehémoliseerde erythrocyten werd berekend zoals gepresenteerd in [20]. Erythrocyten werden geïncueerd in 0,85% NaCl oplossing met C₆₀ fullereen (16 µM) of HL (2,5 en 10 µM) apart en samen gedurende 1 uur. Erythrocyten zonder toevoeging van HL of C₆₀ fullereen werden ontvangen als 100% (controlemonster bevatte 0,05 M DMSO).

In Silico Studie

Het dubbele-helix DNA-molecuul werd gebruikt als sjabloon uit de PDB (Protein Data Bank) basis. De interactie van DNA-molecuul met HL apart en in combinatie met C₆₀ fullereen is bestudeerd. We namen de volgende structuren van DNA-molecuul in overweging: 2MIW (CCATCGCTACC - intercalatie van stof in een kleine groef van DNA-helix), 1XRW (CCTCGTCC - intercalatie van stof in een kleine groef van DNA-helix), en 2M2C (GCGCATGCTACGCG - binding van stof met grote en kleine groeven van DNA-helix). We pasteerden het algoritme van systematische docking (SDOCK+), ingebouwd in het QXP-pakket (deze methode demonstreert alle mogelijke conformaties van de bestudeerde structuren met de minimale waarde van Root mean square deviation (RMSD)) [21]. We genereerden 300 potentiëel mogelijke complexen met DNA, de tien beste werden geselecteerd voor de volgende stap, gebruikmakend van een scorefunctie, ingebouwd in het QXP-pakket [22].

De interacties van het DNA-molecuul met HL apart en in combinatie met de C₆₀ fullereen werden gekarakteriseerd door de volgende parameters: (1) het aantal waterstofbindingen, (2) het oppervlak van contactoppervlakken van DNA en bijbehorende structuur, (3) de afstand tussen het DNA en gedockte structuur, en (4) de totale energie van de bindingsstructuur.

Om de stabiliteit van de complexen van chemische stof met C₆₀ fullereen te beoordelen, voerden we korte moleculaire dynamica (MD, 100 ps) uit met Gromacs softwaretool [23] volgens een Nosé-Poincaré-Anderson algoritme (NPA) [24, 25] gebaseerd op OPLS-AA krachtveld [26, 27].

De berekeningen werden uitgevoerd op de volgende parameters: temperatuur (in Kelvin) - 300; druk (in kilopascal) - 100; binding betreffende het waterstofatoom of ligand werd beperkt door het algoritme [25].

Statistische Analyse

De data werden voorgesteld als gemiddelde ± SD van meer dan vier onafhankelijke experimenten. Gemiddelde (M) en standaarddeviatie (SD) werden berekend voor elke groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met tweerichtings ANOVA gevolgd door post-Bonferroni toetsen. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Dataverwerking en plotten werden uitgevoerd door IBM PC met gespecialiseerde applicaties GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., VS).

Resultaten en Discussies

In Silico Studie

Interactie van HL met DNA

Het werd getoond dat HL in DNA kan intercaleren en een stabiel complex vormt wanneer gebonden in een kleine DNA-groef via AGC-GCTA nucleotiden (Fig. 3a). In dit geval werd de stapelingsinteractie tussen de nitrogenbase van A-nucleotide en HL fenylgroep alsook electrostatische interactie tussen CCl₃ groep en C-nucleotide gevormd. Na MD-simulatie werden de RMSD-waarden voor DNA-dubbele helix en HL respectievelijk 3,3 en 1,62 Å gevonden. Nucleotide-omgeving van HL (GCA-CTA) was deels gewijzigd en stapelingsinteractie was verloren, terwijl een waterstofbinding werd gevormd tussen G-nucleotide en CO-groep van HL.

Interactie van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) met DNA-molecuul: a, b binding met kleine en grote groeven; intercalatie in een kleine groef. De gebruikte DNA-structuur uit PDB-database: a, b—2M2C en c—1XRW.

Binding van HL met een grote DNA-groef vond plaats via TCG-AT nucleotiden (Fig. 3b). In dit geval werd een waterstofbinding tussen de CO-groep van HL en nitrogenbase van A-nucleotide gevormd en stapelingsinteractie tussen beide HL fenylen en nitrogenbases van C en G nucleotiden trad op. Bovendien trad een kans op electrostatische binding tussen HL CCl₃ groep en nitrogenbases van AT nucleotiden op.

Na MD-simulatie werden geen veranderingen in de nucleotide-omgeving van HL gedetecteerd. De RMSD-waarden voor DNA en HL waren respectievelijk 2,77 en 1,58 Å. Hierdoor verdween de stapelingsinteractie tussen C-nucleotide en fenylgroep.

In het geval van HL-intercalatie in DNA, bestond de omgeving uit CG-CG nucleotiden (Fig. 3c). De stapelingsinteractie met CG nucleotiden trad op: één fenylgroep was geklemd tussen de nitrogenbases en de andere vormde een stapelingsinteractie met C-nucleotide.

Na MD-simulatie waren de RMSD-waarden voor DNA-dubbele helix en HL respectievelijk 1,71 en 1,89 Å. De nucleotide-omgeving van HL was niet gewijzigd. Een van de fenylgroepen vormde een ion-π interactie met de nitrogenbase van G-nucleotide, wat bleek te zijn verschoven met 1,12 Å.

De verkregen energieparameters getuigden dat de energie van sterische botsingen tussen DNA en HL alsook binnen HL zelf onbetekenend was (Tabel 1).

We hebben een vergelijkende analyse gedaan van energieparameters van HL-binding met kleine en grote DNA-groeven of de intercalatie in kleine DNA-groef. Bump-waarden bleken 6,2 kJ/mol in het geval van HL-intercalatie in DNA en 2,5 kJ/mol in het geval van binding met kleine en grote DNA-groeven (Tabel 1). Int-waarden waren 8,7 kJ/mol in het geval van HL-intercalatie in DNA, 6,3 kJ/mol in het geval van binding met een grote DNA-groef, en 3,6 kJ/mol in het geval van binding met een kleine DNA-groef. Deze gegevens toonden aan dat HL-binding met een kleine groef van DNA het meest stabiel was.

Gecombineerde Interactie van HL en C₆₀ Fullerene met DNA

Eerder hebben we met behulp van computersimulatie aangetoond dat C₆₀ molecuul met DNA kan interageren en een stabiel C₆₀+DNA complex kan vormen wanneer gebonden met DNA kleine groef [15]. Zoals getoond in Fig. 4, kan C₆₀ fullereen ook ion-π bindingen vormen met CCl₃ groepen van HL molecuul.

Gecombineerde interactie van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) en C₆₀ fullereen met DNA (HL+C₆₀ of C₆₀+HL versies): a, b binding met kleine en grote groeven, c, d intercalatie in kleine en grote groeven. De gebruikte DNA-structuren van de PDB-database: a, b—2M2C, c—1XRW, en d—2MIW.

We hebben twee versies van moleculaire modellering van HL, C₆₀ fullereen en DNA-interactie gebruikt, die voorgesteld werden in [16] en blijken nuttig voor interpretatie van MD-simulatieresultaten. We hebben 1XRW PDB-structuur van DNA-molecuul gebruikt in de versie, waarbij eerst HL en daarna C₆₀ molecuul in DNA intercaleren (HL+C₆₀) en 2MIW PDB-structuur van DNA-molecuul - in de versie, waarbij eerst C₆₀ molecuul en daarna HL in DNA intercaleren (C₆₀+HL).

De binding met een kleine DNA-groef in het geval van HL+C₆₀ versie trad op via GCTA-GCAT nucleotiden (Fig. 4a). Fenylgroepen vulden een kleine groef en gingen in stapelingsinteracties: één groep met C₆₀ fullereen en de andere met de nitrogenbase van G-nucleotide. De electrostatische interacties ontstonden tussen CCl₃ groep van HL en zowel de nitrogenbase van G-nucleotide als C₆₀ fullereen.

Volgens MD-simulatieresultaten werd een DNA-dubbele helix in dit geval gekenmerkt door aanzienlijke mobiliteit (RMSD-waarde is 3,08 Å), RMSD-waarde voor HL was 2,04 Å, terwijl C₆₀ fullereen vrijwel onbeweeglijk bleef. Als resultaat werd de nucleotide-omgeving van HL+C₆₀ structuur gewijzigd door TGC-GCATG. Bovendien trad een waterstofbinding tussen aminogroep van HL en DNA en stapelingsinteracties tussen de nucleotiden van nitrogen GC-basen en C₆₀ fullereen op.

De binding van HL+C₆₀ met een grote DNA-groef trad op via C-ATCC nucleotiden (Fig. 4b). Waterstofbindingen werden gevormd tussen HL CO-groep en de nitrogenbase van A-nucleotide. Fenylgroepen vulden een grote DNA-groef en gingen in stapelingsinteractie met C₆₀ fullereen.

Volgens MD-simulatieresultaten was de nucleotide-omgeving van HL+C₆₀ structuur niet gewijzigd: de waarden van RMSD voor DNA en HL waren respectievelijk 3,14 en 2,24 Å, C₆₀ fullereen bleef vrijwel onbeweeglijk. In dit geval verdwenen alle interacties tussen HL en C₆₀ fullereen en HL interageerde alleen sterisch met DNA. Er wordt verondersteld dat als resultaat C₆₀ fullereen alsook HL uit de grote DNA-groef geduwd zouden worden.

Wanneer HL+C₆₀ in een kleine DNA-groef intercaleren (Fig. 4c), trad binding met CGT-GAG nucleotiden op. C₆₀ fullereen bleek ingebouwd te zijn in een kleine DNA-groef en er sterisch mee te interageren. HL fenylgroepen vormden stapelingsinteracties met de nitrogenbases van CG-CG nucleotiden. Volgens MD-simulatie waren de waarden van RMSD voor DNA en HL respectievelijk 2,29 en 2,13 Å, C₆₀ fullereen bleef vrijwel onbeweeglijk, en CC1₃ groep van HL trad in electrostatische interactie met de nitrogenbase van G-nucleotide.

In het geval van C₆₀+HL versie, trad de binding met een kleine DNA-groef (Fig. 4d) op via CGC-GCC nucleotiden. Een van de HL fenylgroepen vormde een stapeling met C₆₀ fullereen en de andere met G-nucleotide. De CC1₃ groep van HL bleek electrostatische binding te vormen met de nitrogenbase van C-nucleotide. Volgens MD-analyse waren de waarden van RMSD voor DNA en HL in dit geval respectievelijk 2,35 en 2,75 Å, C₆₀ fullereen bleef onbeweeglijk, en de nucleotide-omgeving van C₆₀+HL structuur werd gewijzigd door CGCT-GC. Bovendien penetreerde het C₆₀ molecuul dieper in DNA en vormde een stapelingsinteractie met de nitrogenbase van C-nucleotide.

Volgens de berekende energieparameters was het complex gevormd in het geval van C₆₀+HL intercalatie in een kleine DNA-groef het meest rigide (de Bump-waarde 20,0 kJ/mol) (Tabel 1). In tegenstelling in het geval van HL+C₆₀ interactie met DNA, was deze parameter slechts 6,2 kJ/mol wanneer HL+C₆₀ in een kleine DNA-groef intercaleerde, 7,8 kJ/mol wanneer het gebonden was met een kleine DNA-groef, en 8,8 kJ/mol wanneer het gebonden was met een grote DNA-groef. Bovendien toonden de energieparameters aan dat vorming van sterke waterstofbindingen binnen HL+C₆₀+DNA complex alleen mogelijk was in het geval van binding met een grote groef van DNA, wanneer de waarde van Hbnd was −2,3 kJ/mol, in andere typen interactie was het gelijk aan nul of −1,0 kJ/mol (Tabel 1). Bovendien, volgens MD-resultaten in dit geval bleken zowel C₆₀ fullereen als HL verplaatst te worden uit een grote DNA-groef.

Daarom wordt C₆₀+HL binding met een kleine DNA-groef voorgesteld als de meest waarschijnlijke versie van C₆₀ fullereen, HL, en DNA gecombineerde interactie.

In Vitro Studie van HL Biologische Effecten

CCRF-CEM Cellen Levensvatbaarheid

In in vitro experimenten werd de langdurige invloed van difenyl-N(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) in het bereik 2,5–10 µM op de levensvatbaarheid van humane leukemische CCRF-CEM cellen geschat door MTT-toets. Cellen werden geïncueerd voor 24, 48, en 72 uur in RPMI 1640 medium met ofwel 16 µM C₆₀ fullereen of HL apart of hun combinatie. Levensvatbaarheid van cellen geïncueerd zonder C₆₀ of HL werd geacht 100% te zijn.

Bij 24 uur incubatie werd geen effect van HL op CCRF-CEM cellen levensvatbaarheid waargenomen (Fig. 5). Nog bij langere incubatie werd de cytotoxische activiteit van HL in 5 en 10 µM concentratie duidelijk, cellevensvatbaarheid bij 48 uur was geïnhibeerd met 25 en 33%, respectievelijk, en daalde verder bij 72 uur.

Levensvatbaarheid van CCRF-CEM cellen geïncueerd met difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) in verschillende concentraties. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 vergeleken met controlecellen.

Het moet worden opgemerkt dat 50% afname van CCRF-CEM cellen levensvatbaarheid (IC₅₀) werd gedetecteerd bij 72 uur onder de werking van HL in 10 µM concentratie (Fig. 5). Onlangs hebben we getoond dat een andere CAPh vertegenwoordiger dimorfolido-N-trichlooracetylfosforylamide 50% afname van CCRF-CEM cellen levensvatbaarheid veroorzaakte bij 72 uur in concentratie 1 mM [16]. De vergelijkende analyse van deze gegevens toont aan dat introductie van fenoxy in plaats van morfolido groepen in de structuur van CAPh-derivaat toeliet om de effectieve toxische concentratie tegen leukemische cellen met twee ordes te verlagen. We nemen aan dat conformationele flexibiliteit van –P(O)(OC₆H₅) kern meer effectieve interactie van deze stof met DNA zorgde.

Geen invloed van C₆₀ fullereen alleen gebruikt op cellevensvatbaarheid tijdens incubatieperiode werd gedetecteerd (data niet gepresenteerd). Tegelijkertijd tonen de resultaten op Fig. 6 aan dat C₆₀ fullereen HL cytotoxische activiteit tegen CCRF-CEM cellen versterkte. Onder gecombineerde werking van C₆₀ fullereen en HL werd 50% afname van cellevensvatbaarheid waargenomen bij lagere HL concentratie (5 µM) en vroegere periode (48 uur) van incubatie dan onder de werking van HL zichzelf. Bovendien bij 72 uur gecombineerde werking van C₆₀ fullereen en HL werd het cytotoxische effect van HL gedetecteerd in een lage 2,5 µM concentratie waarbij HL zichzelf geen invloed had op cellevensvatbaarheid (Fig. 6).

Levensvatbaarheid van CCRF-CEM cellen geïncueerd met difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) alleen of in combinatie met 16 µM C₆₀ fullereen. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 vergeleken met controlecellen; ^#p < 0,05 vergeleken met HL.

Dus, C₆₀ fullereen werd getoond om cytotoxische effecten van HL te potentialiseren en de gevoeligheid van leukemische cellen voor zijn werking in een lage concentratie significant te verhogen. Rekening houdend met dat C₆₀ fullereen in staat is om zich in leukemische cellen over 24 uur te accumuleren [28] en te lokaliseren in intracellulaire compartimenten [29,30,31], met name in de kern [32, 33], mag de interactie met kern-DNA van actief prolifererende kankercellen niet worden uitgesloten.

De in vitro verkregen gegevens zijn in overeenstemming met de resultaten van in silico studie en tonen aan dat initiële binding van C₆₀ molecuul en daarna van HL met kleine DNA-groef met vorming van een stabiel complex een van de mogelijke redenen kan zijn voor hun synergistische inhibitie van CCRF-CEM cellen proliferatie.

Erythrocyten Weerstand tegen Hemolyse

Bij inschatting van antikankerpotentieel van HL en C₆₀ fullereen combinatie, is het belangrijk rekening te houden met mogelijke effecten op niet-maligna cellen, in het bijzonder op bloedcellen.

Studie van erythrocyten weerstand tegen zuur-hemolyse stelt in staat om de invloed van farmacologisch middel op membraneniveau te ontrafelen. Dynamiek van hemolyse weerspiegelt de dynamiek van erythrocyten plasmamembraanontbinding en dus de stabiliteit van zijn structurele organisatie. In Fig. 7, de afhankelijkheid van het percentage van hemolyse erythrocyten werden geïncueerd voor 1 uur in NaCl oplossing zonder toevoegingen (controle) en met ofwel HL of C₆₀ fullereen alleen of in combinatie. Geen invloed van 16 µM C₆₀ fullereen op erythrocyten hemolyse werd gedetecteerd (niet getoond). HL in 2,5 µM concentratie alleen of in combinatie met C₆₀ beïnvloedde erythrocyten weerstand tegen hemolyse niet (Fig. 7). Ondertussen, onder de werking van HL in 10 µM concentratie werd versnelling van hemolyse met maximum op 20 s gedetecteerd. Gecombineerde werking van 10 µM HL en C₆₀ fullereen werd gevolgd door verdere hemolyse-intensivering met 60% gehémoliseerde erythrocyten op 20 s.

Erythrocyten weerstand tegen hemolyse in de aanwezigheid van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) apart en in combinatie met 16 µM C₆₀ fullereen. (M ± m, n = 8).

De verkregen gegevens toonden aan dat toepassing van C₆₀ fullereen in combinatie met 2,5 µM HL geen schadelijk effect had op structurele stabiliteit van bloederythrocytenmembraan en tegelijkertijd toeliet om de cytotoxische activiteit van HL in deze lage concentratie tegen leukemische cellen significant te verhogen. Ondanks het synergistische cytotoxische effect van C₆₀ fullereen en HL in 10 µM concentratie tegen leukemische cellen, bleek de toepassing van hun combinatie beperkt door intensivering van hemolytisch effect.

Ten slotte, in de context van de bovenstaande in vitro studie, is het belangrijk te benadrukken dat een water/vaste stof interface begrensd water heeft wat ook zowel het transport, thermodynamische eigenschappen van nanostructuren [34, 35], als hun interactie met celmembranen [36] kan beïnvloeden.

Er zijn literatuurgegevens over de intracellulaire lokalisatie van carbacylamidofosfaat-derivaten, in het bijzonder, penetratie van fosforamidaten in de cellen. Dus, fosforamidaat-derivaten kunnen door de membraan van MDA-231 borstkanker en longkanker (H460, H383, en H2009) cellijnen penetreren [37]. Nitrobenzyl fosforamidaat-mosterds bleken celmembranen te doordringen en in mitochondriën van NTR⁺ zoogdiercellen te lokaliseren [10]. Het is niet uitgesloten dat C₆₀ fullereen, die in staat is om de membraan van de kankercel te penetreren door passieve diffusie of endocytose [28, 30, 32] met accumulatie in de kern en mitochondriën [30, 32, 33], een transporter kan zijn van kleine antitumorale moleculen [38,39,40].

Conclusies

Een nieuwe vertegenwoordiger van carbacylamidofosfaten-derivaten die twee fenoxy-substituenten in de buurt van de fosforylgroep heeft, difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL), werd gesynthetiseerd en getest als cytotoxisch agens zichzelf en in combinatie met C₆₀ fullereen. Volgens moleculaire simulatieresultaten, wanneer C₆₀ fullereen en daarna HL gebonden waren met een kleine DNA-groef, werd een rigide complex gevormd, gestabiliseerd door stapelingsinteracties van HL fenylgroepen met C₆₀ fullereen en DNA G-nucleotide, alsook door interacties van HL CCl₃ groep door ion-π bindingen met C₆₀ molecuul en door electrostatische bindingen met DNA G-nucleotide.

Met behulp van MTT-toets hebben we cytotoxische activiteit van HL tegen humane leukemische CCRF-CM cellen getoond met IC₅₀ waarde gedetecteerd bij 10 µM concentratie bij 72 uur celbehandeling. Het cytotoxische effect van HL werd vergemakkelijkt door C₆₀ fullereen. Onder gecombineerde werking van 16 µM C₆₀ fullereen en HL werd de IC₅₀ waarde gedetecteerd bij lagere 5 µM HL concentratie en vroegere 48 uur incubatieperiode en bovendien werd het cytotoxische effect van HL waargenomen bij een lage 2,5 µM concentratie waarbij HL zichzelf geen invloed had op cellevensvatbaarheid.

Eerder hebben we een significant toxisch effect van dimorfolido-N-trichlooracetylfosforamide getoond tegen humane leukemische cellen van verschillende oorsprong, maar de effectieve concentratie was hoog en geen versterking van toxiciteit na gecombineerde werking met C₆₀ fullereen werd waargenomen [16]. We nemen aan dat introductie van flexibele –P(O)(OC₆H₅) groepen in plaats van morfolido groepen in CAPh-derivaat bijdroeg aan verlaging van zijn toxische concentratie tegen humane leukemische cellen, wat effectieve interactie met C₆₀ molecuul en DNA zorgde. Binding van C₆₀ fullereen en HL met kleine DNA-groef met vorming van een stabiel complex wordt verondersteld een van de mogelijke redenen te zijn voor hun synergistische inhibitie van CCRF-CEM cellen proliferatie.

We hebben onthuld dat toepassing van C₆₀ fullereen in combinatie met 2,5 µM HL geen schadelijk effect had op structurele stabiliteit van bloederythrocytenmembraan, terwijl combinatie van C₆₀ fullereen met 10 µM HL beperkt bleek door intensivering van hemolytisch effect.

Dus, C₆₀ fullereen werd getoond om cytotoxisch effect van HL te potentialiseren en de gevoeligheid van humane leukemische cellen voor zijn werking in een lage concentratie significant te verhogen. Een combinatie van C₆₀ fullereen met HL in een lage concentratie 2,5 µM kan veelbelovend zijn voor verdere biomedische studies.