Hydroxyapatiet-nanodeeltjes verbeteren MSC-osteogenese via endotheelcel-interactie

Samenvatting

Nano-hydroxyapatiet (nano-HA) heeft aanzienlijke aandacht getrokken in het veld van regeneratieve geneeskunde. Endotheelcel (EC)-mesenchymale stamcel (MSC) interacties zijn noodzakelijk voor botreconstructie, maar de manier waarop nano-HA in dit proces interageert, blijft onbekend. Hier onderzochten we de cytotoxiciteit en osteo-inductieve effecten van HA-nanodeeltjes (HANPs) op MSCs met behulp van een indirect co-cultuurmodel gemedieerd door ECs en benadrukten de onderliggende mechanismen. Het werd gevonden dat bij een subcytotoxische dosis, HANPs de levensvatbaarheid en expressie van osteoblaastgenen verhoogden, evenals gemineraliseerde knopen en alkalische fosfataase-productie van MSCs. Deze fenomenen berusten op HIF-1α gesuggereerd door ECs, wat de ERK1/2-signaalcascade activeerde. Bovendien werd een twee-fase cel-linage wiskundig model opgesteld om de impact van HIF-1α op de osteogene differentiatie van MSCs kwantitatief te analyseren. Het toonde aan dat HIF-1α een dosis-afhankelijke stimulerende effect uitoefende op de osteogene differentiatiesnelheid van MSCs tot 1500 pg/mL, wat in overeenstemming was met de bovenstaande resultaten. Onze gegevens impliceerden dat coöperatieve interacties tussen HANPs, ECs en MSCs waarschijnlijk fungeren om botregeneratie te stimuleren. Verder is het twee-fase cel-linage model behulpzaam als in vitro-systeem voor het beoordelen van de potentiële invloed van effectormoleculen in botweefseltechniek.

Inleiding

De reconstructie van botdefecten veroorzaakt door trauma, congenitale misvormingen of chirurgische resectie vormt een grote uitdaging voor orthopedische chirurgie. Hydroxyapatiet (HA), een representatief bioactief keramisch materiaal, is gebruikt als botvervanger. Ongewenste mechanische en osteo-inductieve eigenschappen beperken echter de klinische toepassing. In de afgelopen jaren heeft nano-HA meer optimale bioactiviteit en verbeterde mechanische prestaties getoond vanwege de unieke bionische kenmerken en heeft aanzienlijke belangstelling gewekt in biomedische velden gerelateerd aan regeneratieve geneeskunde. Wanneer nano-HA geïmplanteerd wordt in botdefecten, zullen meerdere cellen betrokken bij botreparatie er aan blootgesteld zijn. Als zodanig is het noodzakelijk om het biologische gedrag van nano-HA te beoordelen. Verscheidene bewijzen hebben direct aangetoond dat HA-nanodeeltjes (HANPs) kunnen worden opgenomen door humane navelstreng Wharton's jelly-afgeleide mesenchymale stamcellen (hWJ-MSCs) en osteoblaastcellen, wat resulteert in verbeterde osteogene differentiatie. Dua et al. rapporteerden eerder de capaciteit van HANPs om de integratie van ingeweefde kraakbeen in de novo kraakbeen te bevorderen; tegengesteld, HANPs remmen de angiogene capaciteit van humane navelvene-endothelcellen (HUVECs). In termen van menselijke gezondheid is een meer uitgebreid begrip van de impact van HANPs op botregeneratie gewenst, en lopende toepassingen van ingenieursgewijs nano-gebaseerd kunstmatig bot voegen urgente aan dergelijke studies.

Botregeneratie is onvermijdelijk vergezeld door de invasie van nieuwe vaten. ECs zijn de binnenste cellulaire bekleding van het vasculaire systeem die passief bloed leveren en ook een rol spelen bij het induceren, specificeren en leiden van orgaanregeneratie alsook het handhaven van homeostase en metabolisme. MSCs maken deel uit van de peri-endotheliale niche en bezitten zelfvernieuwing en multi-differentiatievaardigheden onder de inductie van specifieke fysiologische en biochemische micro-omgevingen binnen hun residentiële niches. Tsai et al. vonden dat ECs endotheline-1 kunnen secretoren om MSCs te richten naar osteo- en chondro-linage differentiatie. Daarnaast gebruikten Saleh et al. microarray-data-analyse om HUVEC-gesuggereerde eiwritten en gerelateerde crosstalk-signaalpaden te identificeren die interageren met MSC-membraangebonde receptoren om proliferatie en osteogene differentiatie te verbeteren. In botweefseltechniek kunnen HANPs in contact komen met nieuwe vaten en worden geëndocytoseerd door ECs, wat getoond is om de fysiologische functie van deze cellen te veranderen. Dit kan ook de omringende osteoprogencellen beïnvloeden en botreparatie beïnvloeden door paracriene signalering te veranderen. Echter, hoewel de directe impact van HANPs op MSCs is onderzocht, is er nog gebrek aan een duidelijk begrip of HANPs indirect osteogene differentiatie van MSCs kunnen induceren via ECs, wat essentieel is voor ons begrip van het effect van HANPs met betrekking tot botreparatie.

In deze studie, in een poging om meer inzicht te krijgen in de biologische effecten van HANPs op de interactie tussen ECs en MSCs, werd een indirect co-cultuurmodel opgezet met behulp van HUVECs en hWJ-MSCs. Door dit systeem te benutten, werden de cytotoxiciteit en osteo-inductieve effecten van HANPs op hWJ-MSCs via HUVEC-gemedieerde paracriene signalering beoordeeld. Om sleutelfactoren te identificeren die HANP-geïnduceerde endotheelcel-MSC-interacties beïnvloeden, werden oplosbare factoren in het supernataant van HUVECs die waren gestimuleerd met HANPs geëvalueerd met de nadruk op de gerelateerde mechanismen op zowel gen- als eiwitlevel. De resultaten toonden aan dat hypoxie-induceerbare factor (HIF)-1α een cruciale rol speelt in deze interacties.

Om de impact van HIF-1α op het proces van osteogenese kwantitatief te observeren en te voorspellen, werd een wiskundig model dat een twee-fase cellinage met HIF-1α combineert, opgesteld. Hierbij, door de empirische gegevens te analyseren, werd het twee-fase cellinage-model gebruikt om het MSC-aantal en differentiatiegraad op elk tijdstip te voorspellen, gebaseerd op de gedefinieerde initiële celzaaidichtheid en HIF-1α-concentratie, wat op zijn beurt passende suggesties kan bieden voor initiële culturomstandigheden en incubatietijden. De resultaten van deze studie zullen helpen licht te werpen op de interacties tussen nano-gebaseerde botvervangers en biologische systemen, wat kan dienen om de ontwikkeling van innovatieve biomaterialen voor gebruik in regeneratieve geneeskunde te bevorderen.

Materialen en methoden

Voorbereiding en karakterisering van deeltjes

HANPs van 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) en micro-gegrootte HA-deeltjes (m-HAP) met ≥ 99,0% zuiverheid werden gekocht van Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China). De grootte en vorm van de deeltjes werden bekeken met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, VS) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM; LEO1530VP, Duitsland). De hydrodynamische grootte en zeta-potentieel van HA-deeltjes (HAPs) werden bepaald via Zetasizer Nano ZS90 en Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, VK).

Celvoorbereiding en cultuur

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Ethiekcommissie van Nanjing Medical University. HUVECs en hWJ-MSCs werden geoogst uit verse humane navelstrengen, zoals eerder beschreven, na verkrijging van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de donoren. In het kort, de navelstreng en navelvène werden gespoeld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% penicilline en streptomycine (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Oostenrijk). Vervolgens werd de navelvène gevuld met 0,1% collagenaase I (Sigma, St. Louis, MO, VS) en 15 min geïncubeerd bij 37 °C. Na verzameling werden de HUVECs gekweekt in EC-medium (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, VS).

Vervolgens werden de bloedvaten verwijderd, en de Wharton's jelly werd in 1 mm² stukjes gesneden en vervolgens in 25 cm² weefselcultuurflessen (Corning Incorporated, Corning, NY, VS) geplaatst. Deze cellen werden geïncubeerd in L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, VS) aangevuld met 10% foetaal bovin serum (GIBCO) en 1% PS.

hWJ-MSCs werden beoordeeld om het fenotype te bevestigen met monoclonale antilichamen tegen CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 en CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, VS). HUVECs werden beoordeeld met von Willebrand factor (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China). HUVECs tussen passages 3–7 en hWJ-MSCs tussen passages 3–5 werden in deze experimenten gebruikt.

Deeltjessuspensies bij 1 mg/mL in PBS werden vervolgens gedilueerd in L-DMEM tot de finale concentratie. Zoals getoond in Fig. 1, werden de HUVECs geïncubeerd in de aangegeven concentratie HAPs gedurende 18 uur. Het kweekmedium werd gecentrifugeerd bij 15.000 toer/min bij 4 °C gedurende 15 min, en de supernaten aangevuld met 10% FBS werden gebruikt als geconditioneerd medium (CM) voor hWJ-MSCs om de volgende experimenten uit te voeren. Het CM bestond uit osteogeen medium aangevuld met osteogene inductievloeistof, wat 10 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/mL L-ascorbijnzuur-2-fosfaat en 0,1 μM dexamethason (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS) bevatte. Daarnaast werd 2-methoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, VS) gebruikt als specifieke HIF-1α-inhibitor. In de 2-MeOE2(+) groep werden hWJ-MSCs gekweekt met CM van HUVECs, die 40 min voor HAP-toevoeging voorbehandeld waren met 5 μM 2-MeOE2. PD98059 werd gebruikt als specifieke MEK-inhibitor. In de PD98059-groep werden hWJ-MSCs gekweekt met CM bevattende 5 μM PD98059.

Bepaling van cellevensvatbaarheid en -aantal

Celllevensvatbaarheid werd beoordeeld met MTS Assay Kit (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). hWJ-MSCs werden 24 uur laten hechten en vervolgens gekweekt met CM gedurende 24 en 72 uur. De absorbantie van formazan werd geëvalueerd bij 490 nm met een microplaatlezer (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, VS). De absorbantie werd ook omgezet in celaantallen met standaard kalibratiecurves onder dezelfde condities.

Kwantitatieve Real-Time Polymerase Kettingreactie (RT-PCR)

TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) werd gebruikt om het totale RNA van hWJ-MSCs-cellen geïncubeerd in CM voor de aangegeven tijd te isoleren. Complementaire DNA getranscribeerd van 1,0 µg RNA met behulp van een PrimeScript First Strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa, Tokyo, Japan) in een T3 thermocyclus (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Duitsland). De expressieniveaus van de aangegeven genen werden geanalyseerd met FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) kit (Roche, Basel, Zwitserland) op een kwantitatief real-time amplificatiesysteem (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). De relatieve mRNA-expressie van het doelgen werd genormaliseerd aan GAPDH en vervolgens bepaald met de 2^−ΔΔCt methode. Primer-sequenties voor de doelgenen zijn vermeld in Tabel 1.

Alizarine Rood S (ARS) Kleuring en Kwantitatieve Analyse

hWJ-MSCs werden gekweekt in 12-putplaten met osteogeen medium tot 14 d, en daarna werd extracellulaire matrix-mineralisatie waargenomen met ARS-kleuring (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, China) na de. In het kort, de monsters werden fixated met absolute ethylalcohol gedurende 15 min en vervolgens gekleurd in 1% (w/v) ARS (pH, 4,2) bij kamertemperatuur gedurende 5 min. De gekleurde cellen tweemaal gewassen met dubbel-gedestilleerd water en vervolgens gefotografeerd. Voor kwantitatieve analyse van het mineralisatieproces werd 300 μL 10% (w/v) cetylpyridiniumchloride monohydraat (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) aan elk putje toegevoegd, en de platen werden 30 min geïncubeerd. In totaal 90 μL van elk monster werd overgebracht naar een 96-putplaat, en de absorbantie werd vervolgens gemeten bij 405 nm in drievoud.

Alkalische Fosfataase (ALP) Kleuring en Kwantitatieve Analyse

Na de hWJ-MSCs waren gekweekt in 12-putplaten met osteogeen medium tot 14 dagen, werd ALP-kleuring uitgevoerd met een BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit (Beyotime). In het kort, hWJ-MSCs werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde. Vervolgens werden monsters gekleurd in een mengsel van nitro-blauw tetrazolium en 5-broom-4-chloro-3-indolyl-fosfaat gedurende 4 uur en gefotografeerd. Om de ALP-synthese te kwantificeren, werden cellen gelyst in ijzige RIPA-lysisebuffer (Beyotime) gedurende 30 min. Cellysaten werden gecentrifugeerd bij 12.000 toer/min bij 4 °C gedurende 10 min, en de supernaten ondergingen kwantitatieve ALP-analyse met een ALP Assay kit (Beyotime). De absorbantie werd in drievoud gemeten bij 405 nm en omgezet in ALP-activiteit met een standaardcurve.

Enzyme-gekoppelde Immunosorbentie (ELISA)

HUVECs werden gezaaid bij 2 × 10⁵ cellen/put. CM werd verzameld van HUVECs gekweekt met HAPs gedurende 18 uur (Aanvullend bestand 1), en het supernataant werd onderworpen aan ELISA-analyse (Fig. 1). Een humane HIF-1α ELISA-kit (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.

Immunofluorescentie

HUVECs werden gezaaid op objectglazen in 12-putplaten (7,6 × 10⁴ cellen/put). Na blootstelling aan CM gedurende 18 uur, werden cellen gefixeerd in 4% paraformaldehyde (Biosharp, Beijing, China) en permeabiliseerd met 0,1% Triton X‐100 (Beyotime) in PBS voor incubatie met 1% anti-HIF-1α antilichaam [EPR16897](ab179483, Abcam, VK) overnachten bij 4 °C. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met 1% CoraLite594-geconjugeerd Geit Anti-Rabbit IgG(H + L) (Proteintech, VS) in het donker gedurende 1 uur. Vervolgens werden de kernen gekleurd met DAPI (Beyotime, Shanghai, China), wat aan de cellen werd toegevoegd en 30 s gereageerd. Monsters werden onderzocht met een laser-confocale microscoop (Olympus, Japan). De fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met ImageJ v.1.4 analyse-software (Bethesda, MD, VS).

Western Blot Analyse

hWJ-MSCs werden geïncubeerd in CM gedurende 24 uur (extracellulaire signaal-gerelateerde kinase (ERK)1/2, p-ERK1/2) of in osteogeen medium gedurende 7 d (runt-gerelateerde transcriptiefactor (RUNX)-2, type 1 collageen/collageen 1 (COL I)). Vervolgens werden de cellen gelyst in RIPA-lysisebuffer gedurende 30 min. Cellysaten werden gecentrifugeerd, en de supernaten werden opgeslagen bij −20 °C voor analyse. Na 12% SDS-PAGE, werden de eiwritten overgebracht naar een polyvinylidene difluoride (PVDF) membraan. De primaire antilichamen die werden gebruikt waren anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I en GAPDH (1:1.000, konijnen-polyclonale antilichamen; Cell Signaling Technology, Boston, MA, VS). Na verwijdering van ongebonden antilichamen, werd het membraan geïncubeerd met secundaire antilichamen gedurende 1 uur. Het signaal op de membranen werd gedetecteerd met een chemiluminescent gel-imaging systeem (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Zweden). De verhouding van p-ERK tot ERK en RUNX-2/COL I tot GAPDH werd gekwantificeerd met ImageJ v.1.4 analyse-software (Bethesda).

Beoordeling van Celapoptose

hWJ-MSCs werden gezaaid met een dichtheid van 10⁵ cellen per put in 6-putplaten. Hechtende cellen werden behandeld met de aangegeven concentraties HIF-1α voor de aangegeven tijd. Cellen werden vervolgens verzameld en gelabeld met FITC-Annexin V en PI (Fcmacs, Nanjing, China) gedurende 15 min in het donker. Alle monsters werden getest met een FACScan stroomcytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, VS). De gegevens werden geanalyseerd met FlowJo v10 (BD Biosciences).

Twee-fase Cel-linage Model

In overweging van het enorme potentieel van HAPs, en de moeilijkheid in het analyseren van het co-cultuursysteem, was een wiskundig model vereist dat kwantitatieve analyse en betrouwbare voorspelling kon bieden om de rol van HIF-1α in de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs te begrijpen.

hWJ-MSCs werden gekweekt met 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 en 4000 pg/mL HIF-1α alsook osteogene inductievloeistof. Na het fitten van de gegevens bij deze concentraties, gebruiken we de concentraties HIF-1α (geproduceerd door HUVECs) in de controle, m-HAP, np80 en np20 groepen (240, 300, 325 en 375 pg/mL respectievelijk) om de fitvergelijkingen te testen met MATLAB (MathWorks, Natick, MA, VS). Om het model te vereenvoudigen, beschouwen we hun vergelijkbare groeipatronen bij de verschillende concentraties HIF-1α als identiek. De gemiddelde differentiatiegraad werd gebruikt om de differentiatiegraad-tijd vergelijking te fitten. De proliferatiesnelheid, apoptosesnelheid en osteogene differentiatiegraden van de hWJ-MSCs in de verschillende groepen werden op gedefinieerde tijden gedetecteerd.

Een vereenvoudigd twee-fase cel-linage model, wat vergelijkbaar is met een multi-fase cel-linage model, werd opgesteld volgens de experimentele gegevens. C₀ en C₁ vertegenwoordigen het celaantal van de hWJ-MSCs en terminale cellen, respectievelijk. C₀ en C₁ worden beheerst door:

dC₀/dt = [(K − C₀ − C₁)/K · p − (p − 1)] · v₀ C₀

dC₁/dt = (2 − (K − C₀ − C₁)/K · p − p) · v₀ C₀ − A C₁

Hierbij vertegenwoordigt p, beïnvloed door HIF-1α en tijd, de replicatiekans van de hWJ-MSCs. Daarbij is d = 1 − p de differentiatiesnelheid die kan worden verkregen door de geschatte en experimentele gegevens van celaantal te fitten. De parameter v₀ kwantificeert hoe snel de cellen zich delen op elke linagestap (in het bijzonder v = ln2/c, waar c de duur van een celcyclus is). De apoptosesnelheid van de terminale cellen wordt gesymboliseerd door A. Voor eenvoud verwaarlozen we dat de apoptosesnelheid licht zal variëren over de tijd, en daarom is A = 4,5% een constante. K duidt de milieu-capaciteit aan omdat de cellen geen onbeperkte proliferatie kunnen ondergaan. HIF-1α verhoogt de differentiatiesnelheid van de hWJ-MSCs, wat leidt tot een differentiatiesnelheid gemodelleerd door:

d = d₀ / (1 + (r·H)^m)

p = 1 − d

Hierbij vertegenwoordigt H de concentratie van HIF-1α; d₀ duidt de differentiatiesnelheid aan bij 0 pg/mL HIF-1α; r vertegenwoordigt de intensiteit van regulatie (hierbij de intensiteit van regulatie van HIF-1α op MSCs); en m correspondeert met de Hill-coëfficiënt, te weten de relatie tussen MSC-differentiatiesnelheid en HIF-1α-concentratie.

Statistische Analyse

Alle gegevens die voldoen aan normaliteit en homoscedasticiteit vereisten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) uit drie of meer onafhankelijke experimenten. SPSS 24.0 software (SPSS Inc., Chicago, VS) werd gebruikt om de statistische analyses uit te voeren via eén-factor ANOVA of twee-factor ANONA. Een P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Statistische analyse wordt gepresenteerd met GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultaten

Karakterisering van HAPs

Zoals getoond in Fig. 2, werden HAPs voorbereid met specifieke grootte en vorm. De diameters van de np20 met bijna sferische vorm waren gemiddeld 20 nm, en de np80 was staafvormig met een gemiddelde lengte van 80 nm en breedte van 20 nm. De m-HAPs waren ook bijna sferisch van vorm en ongeveer 12 μm in diameter. Alle deeltjes hadden een negatief oppervlaktelading in L-DMEM. Het is voorgesteld dat negatieve waarden van zeta-potentieel een significant gunstig effect hebben op de heching en proliferatie van botcellen, alsook de directe botbinding en nieuw botvorming. Deeltjes, die in L-DMEM waargenomen werden, hebben de neiging om te aggregeren in aqueous systemen. Hun hydrodynamische grootte werd ook getest, wat ook een belangrijke factor kan zijn die hun biologische gedrag beïnvloedt.

Indirecte Toxiciteit van HAPs Tegenover hWJ-MSCs

Om de indirecte toxiciteit van HAPs op hWJ-MSCs te beoordelen, werd cellevensvatbaarheid gemeten via MTS-assays. CM met 50 μg/mL HANPs kon de hWJ-MSC-levensvatbaarheid na 24 uur en 72 uur significant stimuleren en met name na 24 uur. Echter, CM met 100 μg/mL HANPs verlaagde de cellevensvatbaarheid met 15–20% vergeleken met de controle na 72 uur. Bovendien stimuleerde CM met 25 μg/mL np20, maar niet np80, de cellevensvatbaarheid na 24 uur. Deze fenomenen bevestigden dat 50 μg/mL HANPs een subcytotoxische concentratie was die in alle volgende experimenten werd gebruikt (Fig. 3).

Indirect Osteo-inductief Effect van HAPs op hWJ-MSCs

Om de indirecte osteo-inductieve effecten van HANPs op hWJ-MSCs te identificeren, werd de expressie van osteogene genen beoordeeld door kwantitatieve RT-PCR-analyse. Het transcriptniveau voor runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (RUNX-2) in de HANP-groepen, met name np20, vertoonde een opmerkelijke toename van Dag 7 tot Dag 21 (Fig. 4a). De genexpressie van type I collageen (Col I) in de np20-groep toonde een verbetering van Dag 7 tot Dag 21, terwijl de np80-groep een volgehouden toename vertoonde van Dag 7 tot Dag 14 (Fig. 4b). Osteocalcine (OCN) mRNA was duidelijk opgereguleerd in de HANP-groepen op Dag 14, wat een versnelde osteogenesnelheid aangeeft (Fig. 4c). De mRNA-niveaus van alkalische fosfataase (ALP) namen duidelijk toe in de HANP-groepen (Fig. 4d), wat de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs aangeeft. Echter, de m-HAP-groep presenteerde beperkte veranderingen ten aanzien van de niveaus van deze drie osteogene genen vergeleken met de controle-groep (Fig. 4). Daarnaast nam de expressie van pluripotentiemarkers, NANOG, OCT3/4 en SOX2, af in de HANP-groepen vergeleken met de controle (Fig. 4e–g), wat impliceert dat de hWJ-MSCs in de HANP-groepen gedifferentieerd waren, met name in de np20-groep. Vergelijkbare resultaten werden verkregen door Western blot-analyse (Fig. 5c, d), wat aangeeft dat de np20-groep indirect de expressie van RUNX-2 en COL I in hWJ-MSCs kon verbeteren.

Om de indirecte osteo-inductieve effecten van HANPs op hWJ-MSCs visueel te observeren, werden de cellen geïncubeerd met de aangegeven osteogene medium gedurende 14 d, gevolgd door ARS- en ALP-kleuring. Zoals getoond in Fig. 5a, b, werd een verhoogd aantal gemineraliseerde knopen en hogere ALP-activiteit van de hWJ-MSCs waargenomen in de HANP-groepen vergeleken met de m-HAP- en controle-groepen. Daarnaast toonde m-HAP, vergelijkbaar met de controle, beperkte effecten op de osteogene differentiatie van de hWJ-MSCs.

HAPs Activeerden ERK1/2-Signaling in hWJ-MSCs Indirect Geco-cultureerd met HUVECs

Om de effecten op de paracriene functie van HUVECs door HAPs te onderzoeken, werden immunofluorescentie- en ELISA-assays gebruikt om het mogelijke eiwit te identificeren dat de osteogene differentiatie van de hWJ-MSCs bevordert. Zoals getoond in Fig. 6a–c, werd de intracellulaire en extracellulaire productie van HIF-1α significant bevorderd door HANPs (met name np20), terwijl er een beperkt effect van m-HAP was op de productie ervan.

Om de differentiatiesignaalweg van de hWJ-MSCs geactiveerd door HIF-1α nauwkeuriger te begrijpen, onderzochten we de sleutelregulatoren van de ERK1/2-weg via Western blot-analyse. Zoals getoond in Fig. 6d, e, terwijl de eiwitniveaus van totaal ERK1/2 onveranderd bleven, waren de p-ERK1/2-niveaus duidelijk verhoogd in de hWJ-MSCs gekweekt met HANPs, en dit was met name waar in de np20-groep. Echter, m-HAP had weinig effect op p-ERK1/2-niveaus in de hWJ-MSCs, vergelijkbaar met het effect op HIF-1α-productie in HUVECs. Belangrijk is dat de verhoogde p-ERK1/2-niveaus in de hWJ-MCs geactiveerd door HIF-1α geblokkeerd konden worden door 2-MeOE2, een specifieke HIF-1α-inhibitor, wat aangeeft dat HIF-1α functioneerde upstream van de ERK1/2-signaalweg in hWJ-MSCs.

HIF-1α Bevorderde Osteogene Differentiatie van hWJ-MSCs via de ERK1/2-Weg

Om te bepalen of HIF-1α noodzakelijk was voor de waargenomen stimulatie van hWJ-MSC-osteogene differentiatie, werd een specifieke HIF-1α-inhibitor (2-MeOE2) toegepast op deze celcultures. Zoals getoond in Fig. 7, werden de gemineraliseerde matrix-depositie en ALP-activiteit van de 2-MeOE2 (+)-behandelde groep hWJ-MSCs gekweekt in osteogeen medium verzwakt, wat aangeeft dat HIF-1α onmisbaar was voor de osteogene differentiatie van de hWJ-MSCs. Op basis van deze resultaten verkennden we verder de rol van de ERK1/2-weg in de osteogene differentiatie van de hWJ-MSCs geactiveerd door HIF-1α. De gemineraliseerde matrix-depositie en ALP-activiteit in de hWJ-MSCs gekweekt met osteogeen medium werden onderdrukt na toediening van PD98059, een specifieke MEK-inhibitor.

Twee-fase Cel-linage Modellen

Om de intrinsieke verband tussen de concentratie van HIF en osteogene differentiatie van hWJ-MSCs kwantitatief te onthullen, werd 0–4000 pg/mL HIF-1α gebruikt om acht groepen hWJ-MSCs te behandelen. Een twee-fase cel-linage wiskundig model werd gebruikt om de proliferatie, apoptose en osteogene differentiatiesnelheid van deze hWJ-MSCs behandeld met verschillende concentraties HIF-1α te analyseren. Zoals getoond in Fig. 8a, werden fitgegevens gebruikt om de gesimuleerde formule (d/d₀ = 1/(0,14H² − 0,43H + 1)) en curve (blauwe curve) te verkrijgen, wat toont dat de differentiatiesnelheid eerst toenem en daarna afnam met de toename van HIF-concentratie. Meer specifiek bereikte de differentiatiesnelheid een piek bij 1500 pg/mL HIF-1α.

Volgens onze studie waren de concentraties HIF-1α geproduceerd door HUVECs in de controle, m-HAP, np80 en np20 groepen 240, 300, 325 en 375 pg/mL respectievelijk. Het zwarte vierkant vertegenwoordigt de differentiatiesnelheid bevorderd door 240, 300, 325 en 375 pg/mL HIF-1α, en dit komt goed overeen met de gesimuleerde curve. Bovendien namen de differentiatiegraden van de hWJ-MSCs (relatieve ALP-activiteit) behandeld met verschillende concentraties HIF-1α op vergelijkbare wijze toe met de tijd. Daarom, om het model te vereenvoudigen, beschouwen we hun groeipatronen als vergelijkbaar of zelfs identiek. We vonden dat de toename in ALP-activiteit van Dag 0 tot Dag 7 evenredig was met het aantal osteoblasten, en osteoblaastcellen bereikten hun piek op het platformperiod. Daarom, na het fitten van de ALP-activiteit met de relatieve osteoblaastcelaantalcurve (osteoblaastcelaantal / maximum osteoblaastcelaantal), werd het maximum van ALP-activiteit voorspeld en relatieve ALP-activiteit (ALP-activiteit/maximum van ALP-activiteit), wat de differentiatiegraad vertegenwoordigt, verkregen (Fig. 8b). Door deze twee studies te combineren, werd het driedimensionale oppervlak van de differentiatiegraad die evolueert met tijd en HIF-1α verkregen (Fig. 8c).

Om de optimale kweektijd te schatten, was het nodig om celaantallen te simuleren. Na het verduidelijken van de differentiatiesnelheid onder verschillende concentraties HIF-1α, simuleerden we de grootte van elke populatie. De simulatie gebruikte een initiële zaaidichtheid van 1500 cellen per put (in een 96-putplaat) met verschillende concentraties HIF-1α. Zoals getoond in Fig. 8d–f, komen de experimentele gegevens (zwart vierkant) goed overeen met de gesimuleerde totale celaantallen (blauwe curve), wat een som is van het aantal hWJ-MSCs en osteoblasten, en dit ondersteunt de capaciteit van dit model om het aantal hWJ-MSCs en osteoblasten op elk tijdstip te voorspellen. Bovendien benaderde het osteoblaastcelaantal de platformperiode op 21, 18 en 15 dagen met 0, 375 en 1500 pg/mL HIF-1α respectievelijk. Dit model biedt de optimale kweektijd voor het begeleiden van weefseltechniek, en het biedt ook direct bewijs dat HIF-1α de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs versnelt.

Discussie

Met de recente vooruitgang in nanobiomaterialen zijn nano-gebaseerde kunstmatige botvervangers een gebied van intense onderzoek. De opbouwende bewijzen suggereren dat er complexe interacties zijn tussen cellen en nanobiomaterialen vanwege hun capaciteit om celmembranen te penetreren en interne retentietijden te verhogen. Een eerdere studie onthulde dat collageen/alginate nanofilms kunnen adsorberen op het MSC-membraan om intracellulaire signaleringscascades te activeren en osteogene differentiatie te bevorderen. Elegante experimenten van Wu en collega's toonden duidelijk aan dat TiO₂-nanobuizen de vascularisatie en osteogene differentiatie kunnen verbeteren door paracriene effecten en celjuncties via EC-MSC-interacties te faciliteren. Voor het ontwikkelen van uitstekende kandidaten voor botweefseltechniek is het noodzakelijk om de directe crosstalk tussen nano-gebaseerde botvervangers en cellen betrokken bij botreparatie alsook hun indirecte interacties te verduidelijken. Echter, ons huidige begrip hiervan is nog steeds beperkt. In de huidige studie gebruikten we een indirect co-cultuurmodel om de biologische effecten van HANPs op MSCs met betrekking tot de indirecte interacties gemedieerd door ECs verder te verduidelijken.

Cytotoxiciteit is een primaire kwestie voor het beoordelen van de biocompatibiliteit van elk nanobiomateriaal. Hoewel onze eerdere studie aantoonde dat HANPs de levensvatbaarheid of apoptose van hWJ-MSCs niet direct beïnvloedden, kunnen ze nog steeds verschillende impacten uitoefenen via de bemiddeling van andere cellen. Dus was het noodzakelijk om de cytotoxische effecten van HANPs op hWJ-MSCs gemedieerd door HUVECs te evalueren. Interessant genoeg, na incubatie in CM gedurende 24 uur en 72 uur, werd hWJ-MSC-levensvatbaarheid gehandhaafd en zelfs verhoogd in de 0–50 μg/mL HANP-groepen, met name in de np20-groep, wat het bestaan van effectormoleculen in de CM aangeeft. Toen de concentratie HANPs 100 μg/mL bereikte, werden ze cytotoxisch voor de hWJ-MSCs. Echter, 0–100 μg/mL m-HAP had geen invloed op hWJ-MSC-levensvatbaarheid (Fig. 3). Jiang et al. hebben getoond dat ingenieursgewijs nanodeeltjes van een bepaalde grootte afzonderlijke endocytose-routes en kinetiek kunnen hebben geassocieerd met gewijzigde downstream-signaling betrokken bij het reguleren van doeicelfuncties. In onze eerdere studie toonden we aan dat np20 en np80 geëndocytoseerd werden door HUVECs, en dit werd gevolgd door morfologische veranderingen en het verschijnen van grote vacuolen, wat de geactiveerde toestand van de HUVECs aangeeft. Daarnaast kunnen np20, met hun snellere opnamesnelheid en verhoogde accumulatie, resulteren in een sterkere activering van HUVECs, wat mogelijk resulteert in verhoogde hWJ-MSC-levensvatbaarheid via paracriene signalering. Integen, kunnen weinig m-HAPs geëndocytoseerd worden door HUVECs, en dit kan verklaren voor hun beperkte invloed op het metabolisme van hWJ-MSCs.

Om de potentiële osteo-inductieve effecten van geactiveerde HUVECs verder te verkennen, werd een subcytotoxische dosis van 50 μg/mL HAPs gebruikt in volgende studies. Het CM verzameld van de geactiveerde HUVECs bevorderde extracellulaire calcium-depositie, ALP-activiteit en osteogene eiwitexpressie in hWJ-MSCs, alsook de mRNA-expressie van osteogene genen (Fig. 4, 5). Runx2, een essentiële transcriptiefactor betrokken bij het specificeren van de osteoblaastlinage, toonde een substantiële verbetering in de np20-groep, wat een sterk osteo-inductief effect op hWJ-MSCs aangeeft (Fig. 4a en Fig. 5c, d). De np20-groep demonstreerde een 1,5-voudige verbetering in COLI-expressie op Dag 7 (Fig. 4b, 5c, d) en een verdubbeling op Dag 14, wat impliceerde de aanwezigheid van additionele gedifferentieerde osteoblasten in de HANP-behandelde groepen (Fig. 4b). OCN is een volwassen stadium botmarker, en dit gen toonde een significante toename in de HANP-groepen op Dag 14 (Fig. 4c), wat aangeeft dat np20 en np80 botveroudering kunnen versnellen vergeleken met m-HAP. ALP is een vroege marker van osteoblaastdifferentiatie, en het nam duidelijk toe met kweektijd in elke groep, met name de np20-groep, wat onthulde dat additionele transformatie plaatsvond van MSCs naar osteoblasten (Fig. 4d). Pluripotentiemarkers, NANOG, OCT3/4 en SOX2 impliceeren de capaciteit voor differentiatie. Zoals getoond in Fig. 4e–g, impliceerde de afgenomen expressie in de genen van de HANP-groepen dat de meeste hWJ-MSCs in HAP-groepen getransformeerd waren in osteoblasten.

Onze gegevens toonden aan dat de endocytose van HANPs door HUVECs geassocieerd was met een verbeterde osteogene differentiatie van hWJ-MSCs. Echter, de oorzaak van deze uitkomst is momenteel onduidelijk. In termen van de paracriene functie van HUVECs, centreerden we ons op oplosbare differentiatie-inducerende eiwritten in het supernataant van geactiveerde HUVECs. HIF-1α-signaling is essentieel in het koppelen van ossificatie en angiogenese tijdens botregeneratie. Heikal et al. rapporteerden dat beschadigde ECs meer HIF-1α secretoren zelfs onder normoxische condities. Het is ook getoond dat blootstelling aan HANPs de angiogene capaciteit van HUVECs remt. Dus maatten we de concentraties HIF-1α in de CM, en de resultaten toonden aan dat de HIF-1α-inhoud toenem in de HANP-behandelingsgroepen vergeleken met de m-HAP- en controle-groepen (Fig. 6a). Om de rol van HIF-1α in de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs te identificeren, werd 2-MeOE2, een specifieke HIF-1α-inhibitor, gebruikt. De verlaagde concentratie HIF-1α liep parallel met de verminderde gemineraliseerde matrix-depositie en ALP-activiteit in deze hWJ-MSCs, wat aangeeft dat HANPs de HIF-1α-productie van HUVECs kunnen bevorderen om de osteogenese van hWJ-MSCs te faciliteren (Fig. 7).

Om HANPs goed toe te passen voor gebruik in botweefseltechniek, is het noodzakelijk om dieper inzicht te krijgen in de mechanismen waarmee HANPs de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs bevorderen gemedieerd door HUVECs. De ERK1/2-weg is downstream van HIF-1α en is fundamenteel voor de differentiatie van MSCs. In dit werk kwamen de concentraties HIF-1α in de CM goed overeen met de p-ERK1/2-niveaus in de hWJ-MSCs (Fig. 6b, c). Toen 2-MeOE2 werd toegepast, faalde de p-ERK1/2-expressie in de hWJ-MSCs om geactiveerd te worden, wat aangeeft dat HIF-1α upstream functioneerde van ERK1/2-signaling. Om de rol van ERK1/2-signaling in de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs direct aan te pakken, werd PD98059, een specifieke MEK-inhibitor, gebruikt. De onderdrukking van ERK1/2-signaling resulteerde in de laagste osteogene differentiatie van hWJ-MSCs. Een mogelijke reden voor deze gebeurtenis is dat de ERK1/2-weg een sleutelrol speelt in zowel HIF-1α-signaling als in de apoptose- en proliferatie-signaalwegen, wat verantwoordelijk kan zijn voor de waargenomen veranderingen in osteogene differentiatie in deze cellen. Bovendien kan dit ook gerelateerd zijn aan de aanwezigheid van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF). VEGF is een van de downstream-effectoren van HIF-1α-signaling, en het kan ook de osteogene differentiatie van MSCs bevorderen via activering van de ERK1/2-weg. Onze eerdere studie vond dat np20 de productie van VEGF in HUVECs induceerde; daarom is het mogelijk dat de onderdrukking van de ERK1/2-weg kan resulteren in inhibitie van VEGF, wat zou leiden tot verminderde osteogene differentiatie van hWJ-MSCs. Volgens de beschikbare experimentele resultaten kunnen we als volgt samenvatten. HANPs kunnen meer optimale directe en indirecte osteo-inductieve effecten verwerken dan m-HAPs. Vergeleken met autologe bottransplantaten en allogene bottransplantaten, is er een uitgebreide bron van HANP en zonder secundaire schade en potentiële immunogeniciteit. Echter, vergeleken met m-HAPs, kunnen HANPs de angiogene capaciteit van HUVECs onderdrukken en vertonen lichte cytotoxiciteit in zowel tijd- als dosis-afhankelijke manier.

Recentelijk heeft groeiende bewijskracht het belang van HIF-1α in botregeneratie aangetoond. Echter, weinig studies zijn in staat geweest om de MSC-differentiatiesnelheid kwantitatief te voorspellen onder specifieke initiële condities, zoals de HIF-1α-concentratie. Rekening houdend met celproliferatie, apoptose en osteogene differentiatie, presenteren we een wiskundig model dat een twee-fase cellinage met HIF-1α combineert dat hoog gecorreleerd is met onze experimentele gegevens. Door de differentiatiesnelheid van hWJ-MSCs in 0–4000 pg/mL HIF-1α te fitten, verkregen we de vergelijkingen voor het beschrijven van de differentiatiesnelheid, HIF-1α-concentratie en tijd. Zoals getoond in Fig. 8d, kan dit model de celaantalkaart onder verschillende HIF-1α-concentraties afbeelden, zodat het mogelijk is de intrinsieke dynamica van het twee-fase systeem te verkennen. Bovendien valideert dit model wiskundig het effect van HIF-1α op de osteogene differentiatie van hWJ-MSCs. Daarnaast, gebaseerd op een multi-fase cellinage-model en logistisch model, is ons model voldoende stabiel om langetermijnvoorspellingen te maken zonder in de val van onbeperkte populatie-explosie te vallen.

Door de bestaande experimentele gegevens te gebruiken, kunnen zowel het celaantal als de differentiatiesnelheid worden voorspeld met een gedefinieerde initiële celzaaidichtheid en HIF-1α-concentratie. Als zodanig wordt de optimale incubatietijd ook verkregen. Gevolgelijk kunnen we de optimale concentratie HIF-1α voorspellen en de meest optimale tijd voor osteogenese bepalen, wat belangrijk is voor efficiënte weefseltechniek. Een twee-fase cel-linage model is toepasbaar voor het voorspellen van de proliferatie en differentiatie van stamcellen, die twee cellinages hebben. Op deze basis kan het model gegrondvest op de initiële condities en bestaande experimentele gegevens worden opgesteld om de optimale culturomstandigheden in vitro te identificeren, wat zal helpen bij het optimaliseren van botreparatie in vivo.

Conclusie

In deze studie hebben we de specifieke biologische effecten van HANPs op hWJ-MSCs gemedieerd door HUVECs onderzocht. Vergeleken met m-HAPs, toonden zowel np20 als np80 lichte cytotoxiciteit in zowel tijd- als dosis-afhankelijke manier. Belangrijk is dat de grootte van de HANPs geen significante impact leek te hebben op deze cytotoxiciteit. Onze gegevens toonden ook aan dat HANPs, met name np20, in staat waren HUVECs te faciliteren om verhoogde niveaus van HIF-1α te secretoren, wat direct correleerde met de verbeterde osteogene differentiatie van hWJ-MSCs via activering van de ERK1/2-weg (Fig. 9). Meer opmerkelijk, de resultaten van het twee-fase cel-linage model suggereerden dat HIF-1α een dosis-afhankelijk stimulerend effect uitoefende op de osteogene differentiatiesnelheid van hWJ-MSCs. Bovendien werden de optimale concentratie HIF-1α en incubatietijd geschat op basis van de initiële condities met behulp van een in vitro-model, wat in de toekomst onschatbaar kan zijn voor weefseltechniektoepassingen. Collectief leveren deze waarnemingen bewijs dat HANPs botregeneratie kunnen verbeteren door cel-cel-interacties te modelleren.