Complexering met C60 Fullereen verhoogt de efficiëntie van doxorubicine tegen leukemische cellen in vitro

Resultaten en discussie

HPLC-MS/MS-analyse van C₆₀ -Dox-complexen

Voor chromatografische scheiding gebruikten we de omgekeerde fase-omstandigheden in de verwachting dat tijdens het scheidingsproces hydrofoob C₆₀ moleculen worden veel sterker op de kolom vastgehouden dan die van de meer polaire Dox [41]. Elutie met de polaire mobiele fase zou duidelijk moeten leiden tot ontleding van het complex en het vrijkomen van vrije Dox die een hogere affiniteit heeft voor de mobiele fase en kan worden gedetecteerd met massaspectrometrie.

Om de aanwezigheid van het complex in oplossing te bevestigen, werd een concentratie van 1 M Dox gekozen als optimaal voor analytische analyse. Onder isocratische stromingsomstandigheden is de retentietijd voor vrije Dox en Dox als component van de complexen met C₆₀ was anders - respectievelijk 11,66 en 9,44 min (afb. 1). Bovendien waren de chromatografiepieken van Dox die vrijkwamen uit de complexen breder en met waargenomen "piekstaartvorming". Gedetecteerde verschuiving in retentietijden en verschillende pickvormen geven aan dat de ontbinding van C₆₀ -Dox conjugaten op de kolom fullereenmoleculen die een hogere affiniteit hebben voor de C18-kolom. Daarom neemt nanostructuur een deel van de actieve bindingsplaatsen in beslag en verstoort het de binding van Dox aan die plaatsen op de juiste manier, waardoor het scheidingsproces wordt beïnvloed. Dat heeft geresulteerd in een kortere retentie (kortere tijd die nodig is voor Dox om door de kolom te gaan) evenals piekgrenzen en staarten voor Dox die vrijkomt uit het complex in vergelijking met vrij geneesmiddel. Een zeer vergelijkbaar fenomeen werd waargenomen door Lie et al. [42] tijdens chromatografische scheiding van C₆₀ niet-covalente complexen met pullulan. De verschillen in chromatogrammen van de vrije Dox en die vrijgekomen uit de complexen wezen duidelijk op de aanwezigheid van C₆₀ -Dox-complexen in oplossing.

Meerdere reactiecontrolechromatogrammen van vrije Dox (1 μM), C₆₀ -Dox 1:1 en C₆₀ -Dox 2:1 (1 μM Dox-equivalente concentratie) complexen onder isocratische stroom (acetonitril, 0,1% mierenzuur in H₂ O, 80:20, v :v ), voorloper → productie-ionenovergang:544.2 → 130.2 en 361,1 m/z; a.u. willekeurige eenheden

Spectroscopische en fluorometrische analyse

De optische eigenschappen van Dox worden bepaald door elektronenovergang in π-gecomplexeerd systeem van zijn aromatische ringen en ketongroepen [43]. Het typische absorptiespectrum van Dox ligt in de golflengten van λ < 600 nm met een brede band bij 480 nm (Fig. 2a). Het UV/Vis-absorptiespectrum van ongerepte C₆₀ watercolloïdale oplossing heeft drie typische absorptiebanden met maxima bij 220, 265 en 350 nm en een lange kleine brede staart tot aan het rode gebied van het zichtbare licht [34, 44]. Daarom zijn de respectieve controlespectra van vrije C₆₀ werden afgetrokken van de spectra van het complex. De waargenomen absorptiespectra van beide 50 μM-complexen waren vergelijkbaar met die van vrije 50  μM Dox, maar er werd een hypochroom effect van 30% waargenomen (Fig. 2a) wat wijst op een Dox-fixatie op de C₆₀ oppervlak door π-π stapelinteracties.

Optische karakterisering van complexen. Optische dichtheidsspectra van vrije Dox en C₆₀ -Dox-complexen (a ). Fluorescentie-emissiespectra van vrije Dox en C₆₀ -Dox-complexen bij een Dox-equivalente concentratie van 3 tot 50 M (b ); a.u. willekeurige eenheden

Het absorptiemaximum met lange golflengte van Dox (λ = 480 nm) werd gebruikt als een excitatiegolflengte voor het volgen van de fluorescentie. Het fluorescentiespectrum vertoont één brede band die bestaat uit drie pieken bij 560, 594 en 638 nm met een maximum rond 594 nm (Fig. 2b) [43], terwijl C₆₀ heeft geen detecteerbare fluorescentie op deze spectrale band. C₆₀ De fluorescentie van de Dox-complexen werd geschat in een reeks verdunningen met een Dox-equivalente concentratie van 3 tot 50 M. Ongeacht de verdunning, de fluorescentie van Dox (λ_ex = 480 nm, λ_em = 594 nm) in de complexen werd geblust door C₆₀ groepen (Fig. 2b). Zo bleek de fluorescentie van Dox in beide complexen bij een concentratie van 3 M Dox-equivalent met 50% te zijn uitgedoofd. De waargenomen uitdoving van de Dox-fluorescentie wordt toegeschreven aan het sterke elektronenaccepterende vermogen van C₆₀ [3] en intramoleculaire energieoverdracht in aangeslagen toestand die typisch is voor niet-covalente Dox-complexen [18, 36, 45], wat wijst op de nauwe ruimtelijke nabijheid van de componenten.

Grootteverdelingsanalyse door dynamische lichtverstrooiing

De grootte en stabiliteit van een geneesmiddel tegen kanker in nanodeeltjes is grotendeels afhankelijk van de samenstelling van het celkweekmedium, de ionsterkte en de eiwitconcentratie. De gemiddelde hydrodynamische diameter van 1 μM C₆₀ -Dox 1:1- en 2:1-complexen in fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) bleken respectievelijk 135 ± 5 nm en 134 ± 6 nm te zijn, wat overeenkomt met de gegevens van eerdere onderzoeken [20]. Om de stabiliteit in celkweekmedium te schatten, 1-μM C₆₀ -Dox-complexen werden 72 uur bij 37 ° C geïncubeerd in RPMI aangevuld met 10% FBS. Het patroon van de deeltjesgrootteverdeling in dit medium (Fig. 3) wordt toegeschreven aan het hoge eiwitgehalte en de waarschijnlijke aggregatie ervan [46, 47].

Hydrodynamische grootte (diameter, nm) van 1 μM С₆₀ -Dox-complexen in RPMI-celkweekmedium aangevuld met 10% FBS op 0 (a ) en 72 uur (b ) incubatie. Intensiteit (%) percentage van alle intensiteit van verstrooid licht

De dynamische lichtverstrooiingsgegevens op 1 μM C₆₀ -Dox 1:1 en 2:1 nanocomplex's hydrodynamische diameterverdeling in FBS-aangevulde celcultuur toonde aan dat hun grootte 138 ± 6 nm en 139 ± 5 nm was wanneer ze onmiddellijk werden gemeten (Fig. 3a) en 146 ± 4 nm en 144 ± 5 nm na 72  h incubatie (Fig. 3b), respectievelijk.

De gedetecteerde stabiliteit van het maximum (rond 140 nm) gaf aan dat er geen extra aggregatie van de C₆₀ was -Dox-complexen tijdens een langdurige incubatie in met FBS aangevuld celkweekmedium, wat hun geschiktheid voor in vitro-onderzoeken bevestigde.

Levensvatbaarheid van de cel

Levensvatbaarheid van menselijke leukemische cellen van verschillende lijnen werd geschat door MTT-test na 24, 48 en 72 h incubatie in aanwezigheid van C₆₀ -Dox-complexen en vrije Dox afzonderlijk in equivalente concentraties. C₆₀ alleen in concentraties gelijk aan die in de complexen had geen effect op de levensvatbaarheid van leukemische cellen (gegevens niet getoond).

Figuur 4 toont de tijd- en concentratieafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van leukemische cellen onder Dox-behandeling. Het medicijn bleek toxiciteit te vertonen tegen leukemische cellen in het nanomolaire bereik. De gevoeligheid van leukemische cellen voor de Dox bleek de volgorde te volgen Molt-16  THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM (minder gevoelig).

Levensvatbaarheid van CCRF-CEM-, Jurkat-, THP1- en Molt16-leukemische cellen, behandeld met gelijke doses vrije Dox of C₆₀ -Dox-complexen voor 24, 48 en 72 h (*p ≤ 0,05 in vergelijking met de gratis Dox, **p ≤ 0.05 in vergelijking met de C₆₀ -Dox 1:1-complex, n = 5)

Onder invloed van 100 nM Dox was de levensvatbaarheid van CCRF-CEM-cellen verminderd tot 84 ± 7, 50 ± 4 en 34 ± 7% vergeleken met de controle na respectievelijk 24, 48 en 72 h. Het vergelijkbare patroon van 100 nM Dox-toxisch effect werd gevonden in Jurkat-cellen. De levensvatbaarheid van THP1-cellen na behandeling met 100 nM Dox-cellen bleek respectievelijk 50 ± 4, 47 ± 5 en 13 ± 4% te zijn na 24, 48 en 72 h. Half-maximale remmende Dox-concentraties (IC50) voor CCRF-CEM-, THP1- en Jurkat-cellen bij 72 h incubatie werden geschat op respectievelijk 80 ± 9, 43 ± 5 en 38 ± 6 nM. Deze gegevens komen overeen met literatuurgegevens [48, 49]. Molt-16-cellen bleken het meest gevoelig voor het medicijn, aangezien het toxische effect ervan werd gedetecteerd in het bereik van 1 tot 25 nM binnen alle perioden van celincubatie. De levensvatbaarheid van Molt-16-cellen behandeld met 5 nM Dox was verminderd tot 75 ± 4, 28 ± 4 en 18 ± 4% van die van de controle na respectievelijk 24, 48 en 72 h, en de waarde van IC50 na 72 h was gelijk aan slechts 2,0 nM. De vergelijkbare hoge gevoeligheid van Molt-16-cellen met 10 keer intensievere apoptose-inductie in vergelijking met Jurkat-cellen onder behandeling van een kruidenalkaloïde werd eerder gerapporteerd door Cai et al. [50].

Cellen behandeld met vrije Dox werden gebruikt als controle om de levensvatbaarheid onder invloed van C₆₀ te beoordelen. -Dox-complexen in de equivalente doses van het medicijn. De waarde van IC50 voor de gratis Dox en C₆₀ -Dox-complexen werden berekend voor elk tijdstip en elke cellijn en wordt weergegeven in Fig. 4.

Er werd aangetoond dat zowel C₆₀ -Dox-complexen hadden een hoger toxisch potentieel in vergelijking met de vrije Dox tegen menselijke leukemische cellijnen (Fig. 4).

Samengevat toonden onze talrijke experimenten voor de vier cellijnen een verscheidenheid aan verhoogde toxiciteiten tot 3,5-voudig. C₆₀ -Dox 1:1-complex heeft een hogere toxiciteit laten zien in vergelijking met 2:1-complex. Het minder uitgesproken effect (IC50-afname tot ≥ 2,5 keer vergeleken met die voor gratis Dox) van het 2:1-complex kan worden toegeschreven aan de hogere concentratie van C₆₀ als zijn bestanddeel. Vanwege de antioxiderende activiteit [11, 13], wordt een overmaat aan C₆₀ kan cellen beschermen tegen Dox-geassocieerde oxidatieve stress [27].

Intracellulaire accumulatie van Free Dox en C₆₀ -Dox-complexen

Onderzoek naar een mogelijke correlatie van het versterkte toxische effect van C₆₀ -Dox-complexen met een effectievere intracellulaire accumulatie van geneesmiddelen, de cellulaire opname van vrij Dox en C₆₀ -Dox werd bestudeerd. Omdat Dox een sterke absorptie en fluorescentie heeft in het zichtbare spectrale gebied [43, 45] (Fig. 2), is het volgen van Dox-complexen mogelijk met niet-invasieve, op directe fluorescentie gebaseerde technieken. CCRF-CEM-cellen werden geïncubeerd in aanwezigheid van 1 μM Dox of C₆₀ -Dox-complexen in een geneesmiddelequivalente concentratie, onderzocht met fluorescentiemicroscopie en onderworpen aan flowcytometrie om het intracellulaire niveau van geaccumuleerd geneesmiddel te kwantificeren na behandeling van 1, 3 en 6 uur (Fig. 5). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk monster werd berekend uit logaritmische FACS-histogrammen door de waarde van het respectieve Dox rode fluorescentiesignaal (λ_ex = 488 nm, λ_em = 585/29 nm) en weergegeven in Tabel 2. Autofluorescentie van onbehandelde cellen werd gebruikt als een negatieve controle (Fig. 5a).

Intracellulaire accumulatie van de 1 μM vrije en C₆₀ gecomplexeerde Dox. Flowcytometrie (a ) en fluorescentiemicroscopiebeelden (b ) van CCRF-CEM-cellen geïncubeerd met Dox en C₆₀ -Dox in de verhouding 1:1 en 2:1 voor 1, 3 en 6 h. Schaalbalk 20 μM

Tijdsafhankelijke accumulatie van 1 M Dox werd geschat door verbetering van de fluorescentie-intensiteit (Fig. 5, Tabel 2). De fluorescentiemicroscopiebeelden illustreren dat C₆₀ -Dox-complexen werden sneller geïnternaliseerd dan vrij medicijn, zoals blijkt uit een veel helderdere intracellulaire fluorescentie (figuur 5b). De gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de CCRF-CEM-cellen, behandeld met 1:1 C₆₀ -Dox-complex bij 1 M Dox-equivalente concentratie, was 1,5, 1,7 en 2,2 keer verhoogd in vergelijking met vrije Dox bij respectievelijk 1, 3 en 6 h. 2:1 C₆₀ -Dox-complex vertoonde een vertraagde intracellulaire accumulatie van geneesmiddelen die hetzelfde niveau bereikte als het 1:1-complex bij 6 h (Fig. 5, Tabel 2).

De verkregen gegevens toonden aan dat Dox-complexatie met C₆₀ bevorderde de toegang tot de cellen, maar had geen invloed op de lokalisatie ervan. De controlekleuring van bestudeerde cellen met DNA-bindende kleurstof Hoechst 33342 onthulde de colokalisatie ervan met Dox-signaal (gegevens niet getoond). Het is duidelijk dat Dox-moleculen van C₆₀ complexen en het vrije medicijn kwamen de kernen binnen die de antiproliferatieve impact weerspiegelen door DNA-schade [26,27,28]. Een verhoogde intracellulaire opname van het geneesmiddel na complexatie met C₆₀ wijst erop dat laatstgenoemde als een promotor voor drugstransport functioneert. C₆₀ nanostructuur bleek het cellulaire plasmamembraan te transmigreren als gevolg van passieve diffusie [51] en/of endocytose/pinocytose [52, 53], terwijl kleine moleculen als Dox alleen via passieve diffusie kunnen doordringen. De C₆₀ structuur lijkt op de structuur van clathrine [54, 55], de belangrijkste mantelcomponent van blaasjesvorming tijdens endocytose. Daarom, C₆₀ kan functioneren als transporteur van kleine aromatische moleculen [56]. Integendeel, een covalente binding tussen vervoerder en lading introduceert een structurele wijziging in het medicijnmolecuul. Dientengevolge worden het accumulatiepatroon en de interactie met intracellulaire doelen gewijzigd, wat resulteert in volledig of gedeeltelijk verlies van de functie van het geneesmiddel. Liu et al. [15] toonde aan dat C₆₀ met twee Dox-moleculen gebonden via een amidebinding werd voornamelijk in het cytoplasma verdeeld.