Goudnanodeeltjes moduleren CYP3A4-activiteit en cel-toxiciteit in humaan hepatocellulair carcinoom: invloed van grootte, oppervlaktechemie, en proteïne corona

Samenvatting

We onderzochten hoe 40- en 80-nm goudnanodeeltjes (AuNP) gefunctionaliseerd met kationische vertakte polyethyleenimine (BPEI), anionische lipoïnezuur (LA), of neutrale polyethyleenglycol (PEG) interageren met de humane hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellijn C3A, zowel in de aanwezigheid als afwezigheid van een humane plasma-proteïne corona (PC). Blote AuNP, behalve 80-nm LA-AuNP, waren cytotoxisch voor C3A-cellen, maar de PC verlichte deze effecten significant. Tijds-afhankelijke cellulaire opname nam toe voor 40-nm BPEI-AuNP, terwijl PC de opname van 80-nm PEG-AuNP verminderde. BPEI-AuNP induceerde bifasische oxidatieve/nitrosatieve stressresponsen, terwijl PEG-AuNP fungeerde als krachtige antioxidans. Alle blote AuNP remden CYP3A4-activiteit ongeacht grootte of oppervlaktelading, maar PC herstelde de activiteit behalve voor PEG-AuNP. De 40-nm PEG-AuNP induceerde genexpressieveranderingen die primair mitochondriale vetzure β-oxidatie beïnvloeden, en in mindere mate hepatische efflux/opname-transporters. Deze bevindingen verdiepen ons begrip van AuNP-cel-interacties en hun moleculaire onderbouwing in HCC, wat inzichten biedt voor verbeterde therapeutische strategieën.

Achtergrond

Hepatocellulair carcinoom (HCC) blijft een van de meest prevalente kankers wereldwijd en de snelst groeiende oorzaak van kankersterfte in de Verenigde Staten [1, 2]. Huidige curatieve opties - levertransplantatie of chirurgische resectie - zijn beperkt tot vroege-stadium ziekte, geavanceerde tumoren vertrouwen op chemotherapie of radiotherapie, die beide lijden aan lage selectiviteit en significante systemische toxiciteit [3, 4]. Gentherapieën, met name RNA-interferentie (RNAi), beloven hogere specificiteit, maar efficiënte levering vereist vectoren die doelcellen veilig penetreren. Terwijl virale vectoren hoge transductie-efficiëntie bieden, worden niet-virale platforms zoals nanodeeltjes (NP) bevorzugd om hun veiligheidsprofiel en afstelbare fysicochemische eigenschappen [5-8]. Goudnanodeeltjes (AuNP) zijn met name aantrekkelijk door hun gemakkelijke oppervlaktemodificatie en optische kenmerken, wat gerichte levering van therapeutische lading mogelijk maakt [11, 12]. Echter, bij binnenkomst in de bloedstroom, verwerven AuNP een proteïne corona (PC) die hun oppervlaktechemie en daarmee hun biologische lot verandert, inclusief cellulaire opname en toxiciteit [13-17]. Het begrijpen hoe NP-grootte, oppervlaktelading, en de PC cellulaire responsen in HCC-cellen moduleren, is essentieel voor het ontwerpen van veilige en effectieve nanogeneesmiddelen.

Methoden

Goudnanodeeltjes-synthese

40- en 80-nm AuNP werden op maat geproduceerd door nanoComposix (San Diego, CA). Functionalisatie met BPEI, LA, of PEG werd bereikt via EDC-chemie, dihydrolipoïnezuur-conjugatie, of thiol-methoxy-PEGylatie, respectievelijk. Grootte, poly-dispersiteitsindex (PDI), en zeta-potentiaal werden bevestigd door dynamische lichtspreiding (DLS), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), en UV-Vis-spectroscopie. De AuNP werden gezuiverd door tangentiële stroomfiltratie (TFF) en steriel-gefilleerd.

Proteïne corona-bereiding

Humaan plasma (n=5) van de Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) werd gemengd met AuNP bij 55% (v/v) en geïncubeerd bij 37 °C, 250 rpm gedurende 1 uur. Zwak gebonden proteïnen werden verwijderd door herhaalde PBS-wassen (20.000 × g, 20 min). De resulterende PC-gecoate AuNP werden heropgelost in PBS en vervolgens gedomineerd in celkweekmedium.

Fysicochemische karakterisering van AuNP

Hydrodynamische diameters (DH), PDI, en zeta-potentiaal van blote en PC-gecoate AuNP werden gemeten in DI-water, PBS, en compleet EMEM (10% FBS) bij 25 °C en 37 °C (0 en 24 u). Optische absorptiespectra werden opgenomen bij kamertemperatuur.

Transmissie-elektronenmicroscopie

AuNP-morfologie werd beoordeeld door TEM (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV). Monsters werden op 200-mesh koperen roosters gedropt en aan de lucht gedroogd.

Celkweek en leefbaarheidsmeting

C3A-cellen (ATCC CRL-10741) werden gekweekt in EMEM + 10% FBS, gezaaid bij 8 × 10⁴ cellen/put (96-put platen), en toegestaan om 48 uur te hechten voordat dosering plaatsvond. Leefbaarheid werd gemeten met behulp van de alamarBlue®-assay na 24 uur blootstelling aan AuNP-concentraties variërend van 0 tot 250 µg/cm².

Cellulaire opname-meting via ICP-MS

Cellen werden behandeld met 1,56 µg/cm² van AuNP voor 0,5-24 u. Na een ets-stap om oppervlakte-gebonden deeltjes te verwijderen, werden cellen verteerd in koningswater, en intracellulair Au gekwantificeerd door ICP-MS. Opname werd uitgedrukt als AuNP per cel.

Oxidatieve/nitrosatieve stress-metingen

ROS/RNS-productie werd gekwantificeerd met behulp van een totale ROS/SO-assay-kit (Enzo Life Sciences) bij 1, 3, en 24 u na blootstelling aan 40-nm BPEI- en PEG-AuNP tot 125 µg/cm².

Cytochroom P450 3A4-activiteit

CYP3A4-activiteit werd beoordeeld met de P450-Glo™-assay (Promega) na 24 uur blootstelling aan LC₅₀-concentraties van elk AuNP-type. Luminescentie werd genormaliseerd aan voertuig-controles.

Genexpressie-profilering

Gegeven de uitgesproken effecten van 40-nm PEG-AuNP, werden C3A-cellen blootgesteld aan de LC₅₀ (129,5 µg/cm²) gedurende 24 uur. Totaal RNA (RIN ≥ 7,8) werd geïsoleerd, omgekeerd getranscribeerd, en geanalyseerd door de Human Molecular Toxicology Pathway Finder en Human Drug Transporters RT² Profiler™ PCR-arrays (Qiagen). Differentieel geëxprimeerde genen (|vouwwijziging| > 2, p < 0,05) werden gevalideerd door qRT-PCR voor negen representatieve genen.

Statistische analyse

LC₅₀-waarden werden gefit met een variabele-helling Hill-vergelijking in GraphPad Prism. Eenrichtings-ANOVA (SAS 9.4) gevolgd door Tukey's HSD-toets beoordeelde significantie (p < 0,05).

Resultaten en discussie

Fysicochemische karakterisering van blote en PC-gecoate AuNP

Zoals getoond in Figuur 1, bevestigde TEM monodisperse AuNP met grootten die overeenkwamen met de nominale 40 en 80 nm diameters. PC-vorming induceerde een bescheiden toename in DH en een rode verschuiving in de UV-Vis-plasmon-piek, wat proteïne-adsorptie aangeeft. In compleet EMEM, bleven DH en PDI stabiel gedurende 24 u, behalve voor PC-BPEI-AuNP, die een tijdelijke daling in PDI vertoonde, wat verbeterde colloïdale stabiliteit suggereert. Zeta-potentialen verschoven naar neutrale waarden bij PC-coating, wat protein-maskering van oppervlakteladingen reflecteert.

AuNP-cytotoxiciteit

LC₅₀-waarden voor blote AuNP varieerden van 127,3 tot 205,5 µg/cm² (Figuur 2a). Alle 40-nm BPEI-, LA-, en PEG-AuNP, alsook 80-nm BPEI-AuNP, waren cytotoxisch, terwijl 80-nm LA-AuNP geen significante toxiciteit vertoonde. PC verminderde de cytotoxiciteit aanzienlijk voor de meeste AuNP-typen, met uitzondering van 80-nm BPEI-AuNP, dat 51% leefbaarheid behield bij 250 µg/cm² (Figuur 2b). Deze bevindingen sluiten aan bij eerdere werk dat PC-gemedieerde attenuatie van AuNP-toxiciteit in primaire hepatocyten en andere cellijnen toonde [7-9].

Intracellulaire opname van AuNP

Tijds-afhankelijke opname-analyses (Figuur 3) onthulden dat 40-nm BPEI-AuNP snel accumuleerde, piekend bij 6 u vooraleer te dalen. Integenstelling, PC dempte opname van 40- en 80-nm BPEI- en LA-AuNP, maar versterkte 80-nm PEG-AuNP-internalisatie. Deze trends zijn consistent met literatuur die aangeeft dat PC de NP-invang kan belemmeren of bevorderen, afhankelijk van NP-grootte, oppervlaktechemie, en celtype [8, 9, 33].

Oxidatieve en nitrosatieve stress-metingen

Beide AuNP-typen induceerden ROS/RNS op een tijds- en concentratie-afhankelijke manier (p < 0,0001). Hoge concentraties van 40-nm BPEI-AuNP produceerden een bifasische respons: een initiële antioxidante effect bij 1 u, gevolgd door een uitgesproken pro-oxidante golf bij 3 u en daarbuiten. Integenstelling, 40-nm PEG-AuNP onderdrukte consistent ROS/RNS-productie (vouwwijziging < 0,5) over alle tijdstippen, wat een beschermende antioxidante rol suggereert (Figuur 4).

CYP3A4-activiteitsmeting

Alle blote AuNP (40- en 80-nm BPEI, LA, en PEG) remden CYP3A4-activiteit tot 20-31% van controle-niveaus bij LC₅₀-concentraties (Figuur 5). Niet-toxische concentraties van 80-nm LA- en PEG-AuNP onderdrukten de activiteit ook (~30%). PC herstelde CYP3A4-activiteit grotendeels voor alle AuNP behalve voor PEG-AuNP, die 63% en 46% activiteit behield voor 40- en 80-nm deeltjes, respectievelijk. Deze resultaten bevestigen eerdere rapporten van AuNP-gemedieerde CYP3A4-remming via directe enzym-interactie of substraten-kleppen-blokkade [7, 25].

Toxiciteitspad-gefocuste genexpressie-profilering van 40-nm PEG-AuNP

Gen-array-analyse identificeerde 212 differentieel geëxprimeerde genen (186 neer-gereguleerd, 26 op-gereguleerd) bij de LC₅₀ van 40-nm PEG-AuNP (Figuur 6). Opvallend betrof 12,3% van deze genen mitochondriale vetzure β-oxidatie, met sleutelenzymen (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) aanzienlijk onderdrukt (vouwwijziging 2-18). De neer-regulatie van β-oxidatie-enzymen wijst op beeinträchtigde NADH/FADH₂-productie, wat de citraatcyclus en ATP-synthese compromitteert, een kenmerk van mitochondriale dysfunctie geobserveerd in AuNP-behandelde hepatocyten [7-9].

Apoptose-genen (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) waren op-gereguleerd, terwijl anti-apoptotische genen (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) neer-gereguleerd waren, consistent met de waargenomen dosis-afhankelijke cytotoxiciteit. DNA-schade- en herstel-checkpoints (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) toonden gemengde regulatie, wat beschadigde genoomintegriteit suggereert. Hitte-shock-proteïnen (HSPA1A/B) waren op-gereguleerd, terwijl HSP40/90/60-subfamilies neer-gereguleerd waren, wat een complexe stressrespons weerspiegelt. Antioxidante genen (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) werden geïnduceerd, terwijl pro-oxidante genen (TXNIP, PPP1R15B) werden onderdrukt, in lijn met het antioxidante fenotype van PEG-AuNP.

Geneesmiddel-opname en -efflux-transporter genexpressie-profilering

PC-geïnduceerde modulatie van geneesmiddel-transporters benadrukt verder potentiële farmacokinetische implicaties. Van de 35 onderzochte transporter-genen, waren 12 ABC-transporters neer-gereguleerd (bijv. ABCB1, ABCC2/3/4, ABCG2/8, ABCA1) en 21 SLC-transporters onderdrukt (bijv. SLC31A1, SLC22A9). Integenstelling, MDR4 (ABCB4) en mitochondriale ABC-transporter (ABCB6) waren op-gereguleerd, wat een compensatoire reactie op nanodeeltjes-blootstelling aangeeft. Deze veranderingen kunnen de intracellulaire concentratie van chemotherapeutica beïnvloeden en vereisen zorgvuldige overweging in combinatietherapieën.

Real-time PCR-validatie van negen geselecteerde genen bevestigde de array-resultaten, wat de betrouwbaarheid van de transcriptionele data versterkt.

Conclusies

Deze studie demonstreert dat AuNP-oppervlaktechemie en de aanwezigheid van een humane plasma-proteïne corona hun cytotoxiciteit, cellulaire opname, oxidatieve stress-profiel, CYP3A4-remming, en genexpressie-veranderingen in C3A HCC-cellen kritiek bepalen. Blote BPEI- en LA-AuNP waren hoog-cytotoxisch, terwijl PEG-AuNP antioxidante eigenschappen vertoonde maar nog steeds CYP3A4-activiteit onderdrukte. De PC verlichtte toxiciteit en CYP3A4-remming grotendeels, behalve voor PEG-AuNP, die significante effecten behield. Genexpressie-analyse van 40-nm PEG-AuNP onthulde voorafgaande neer-regulatie van mitochondriale vetzure β-oxidatie-enzymen, op-regulatie van pro-apoptotische genen, en uitgebreide modulatie van geneesmiddel-transporters, wat inzicht biedt in potentiële mechanismen van hepatotoxiciteit en geneesmiddel-nanodeeltjes-interacties. Deze bevindingen benadrukken het belang van het overwegen van proteïne-corona-vorming en oppervlakte-functionaliserings bij het ontwerpen van AuNP-gebaseerde therapeutica voor HCC.