Gerichte genuitschakeling BRAF synergetisch fotothermisch effect remt de groei van levercellen met behulp van nieuw GAL-GNR-siBRAF-nanosysteem

Resultaten

Synthese en karakterisering van Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF

We hebben een nieuwe nanodrager GAL-GNR ontworpen die in staat is om klein interfererend RNA (siRNA) aan de levercellen te leveren en tegelijkertijd het fotothermische effect van de gouden nanostaafjes te behouden. De syntheseprocedure van GAL-GNR wordt getoond in Schema 1. Dit op de lever gerichte systeem bevat drie functionele componenten. Ten eerste is het basisdeel van GAL-GNR een GNR-skelet, dat ongeveer 30 nm lang en 10  nm in diameter is, zoals getoond in het TEM-beeld (Fig. 1a) en chemisch geconjugeerde GNR (GAL-GNR) vertoonde geen significante dimensionale verandering en bezat nog steeds een goede dispergeerbaarheid (figuur 1b). De gegevens van de deeltjesgrootte toonden aan dat de gemiddelde grootte van GNR 30,23 nm was, wat consistent was met de resultaten van elektronenmicroscopie, en dat de grootte van GAL-GNR (50 nm) en PEI-GNR (42,35 nm) groter was dan GNR sinds de conjugatie van GAL en PEI verhoogde de hydratatie tussen deeltjes (figuur 1c). Ten tweede werd biologisch toxisch CTAB op het oppervlak van GNR vervangen door positief geladen MUA-PEI dat kan worden geladen met negatief geladen siRNA. De zeta-potentiaalmeting toonde aan dat de oppervlaktelading van GNR toenam van 35,6 tot 42,7 mV of 41,8 mV wanneer de GNR werd gemodificeerd met respectievelijk PEI of GAL-PEI, wat aangeeft dat GAL-GNR een sterk vermogen bezat om siRNA te binden (Fig. 1d). Ten derde hebben we GAL toegepast als een gidsmolecuul om GNR-nanodragers te conjugeren, die kunnen worden gebruikt voor specifieke homing van hepatocellulair carcinoom. UV-Vis-absorptiespectroscopie werd gebruikt om de structuur van gemodificeerde GNR voorlopig te detecteren. De initiële absorptiespectrumgolflengte van ongewijzigde GNR was 763 nm; een verschuiving van 7 nm in golflengte werd aanvankelijk waargenomen met de MUA-PEI-modificatie en een andere verschuiving van 8 nm werd waargenomen aan het einde van de synthese, toen de modificatie van GNR met GAL met succes werd uitgevoerd (figuur 1e). Om GAL in het nanosysteem te bevestigen, werd NMR-beeld gebruikt om de chemische groepen te analyseren. De resultaten toonden aan dat het H-signaal van galactose alleen werd gevonden in het GAL-GNR-spectrum op het NMR-waterstofspectrum, dat δ was:3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. NMR-spectra bevestigden de chemische structuur van GAL, waarin GAL met succes werd geconjugeerd aan het GNR-oppervlak (Fig. 1f).

GAL-GNR synthetische procedure. een Het synthetische proces van MUA-PEI. b Activering van d-galactose en chemische reactie met MUA-PEI. c Het uiteindelijke synthetische product van GAL-GNR

Karakterisering van GNR en GAL-GNR. een TEM-microfoto van GNR (schaal =0,5 m/50 nm). b TEM-microfoto van GAL-GNR (schaal =0,5 m / 50 nm). c Deeltjesgrootteanalyse van verschillende gemodificeerde GNR. d Zeta-potentiaalanalyse van verschillende gemodificeerde GNR (GAL-GNR). e Genormaliseerde UV-Vis-absorptiespectra van verschillende gemodificeerde GNR en water. v NMR-absorptiespectra van GAL-GNR

siRNA-inkapselingsvermogen en stabiliteit van GAL-GNR

Het GAL-GNR nanoskelet werd gemodificeerd door positief geladen PEI, dat kan worden gecombineerd met negatief geladen siRNA door middel van elektrostatische interactie. We gebruikten gel shift-assay om het siRNA-bindend vermogen van GAL-GNR te evalueren. Het vrije siRNA kan langs de doorgang van de gel bewegen, terwijl het gebonden siRNA wordt vertraagd of volledig wordt gestopt. Bovendien zal het gebonden siRNA niet langer effectief binden aan bromide, en dus zal de fluorescentie-intensiteit dienovereenkomstig afnemen. Het resultaat van gelelektroforese toonde aan dat de optimale verhouding voor het verzadigen van GAL-GNR met siBRAF 6:1 (w/w) is (Fig. 2a).

Gel shift-assays. een siRNA-laadcapaciteit van GAL-GNR. Eén microgram siRNA werd in gelijke volumes gemengd met verschillende massaverhoudingen van GAL-GNR. Na incubatie gedurende 30 min werd een gelmigratietest gebruikt om de siRNA-laadcapaciteit van GAL-GNR te beoordelen. b Stabiliteit van siRNA in muizenserum. Eén microgram BARF-siRNA werd geïnoculeerd met de GAL-GNR in een massaverhouding van 1:6 en werd vervolgens toegevoegd aan vers muizenserum. Na reactie van 0, 3, 6, 12, 24 en 48 h bij 37 °C, werd siRNA van GAL-GNR-siBARF geëxtraheerd met 2% SDS en gevisualiseerd met Ethidium Bromide

Naakt siRNA is zeer afbreekbaar, vooral in vivo. Een belangrijke functie van het afgiftesysteem is het beschermen van siRNA tegen afbraak. We hebben dus het beschermende effect van nanocarrier GAL-GNR op siRNA in vers serum getest. In vergelijking met het naakte siRNA werd het gebonden siRNA gedurende langere tijd in serum bewaard. Zoals getoond in Fig. 2b, kon naakt siRNA tot 12 uur in serum voorkomen, terwijl het gebonden siRNA na 48 uur nog steeds overvloedig aanwezig was. Het resultaat toonde aan dat GAL-GNR effectief kan voorkomen dat siRNA wordt afgebroken in serum, waardoor gerichte levering in vivo wordt gegarandeerd.

Cytotoxiciteit van nanomaterialen

Lage biologische toxiciteit is een andere belangrijke eigenschap van nanomaterialen, waardoor ze kunnen worden gebruikt bij de behandeling van kanker. Om de biocompatibiliteit van deze nieuwe GAL-GNR-nanostructuur te evalueren, hebben we de cytotoxiciteit ervan getest. Zoals getoond in Fig. 3, werden dode cellen van Hepa1-6 in de niet-gemodificeerde GNR-behandelde groep aanvankelijk waargenomen bij een lage concentratie van 30 g/ml. Na incubatie met 75 g/mL GNR gedurende 24 h, was het celsterftecijfer tot 56,09% en de mortaliteit nam toe tot 75,5% na incubatie gedurende 48  h. Integendeel, GAL-modificatie verminderde de cytotoxiciteit aanzienlijk. Na 48  h incuberen van GAL-GNR waren meer dan 80% cellen nog in leven, zelfs bij hoge concentratie (105  μg/ml). Deze gegevens suggereerden dat de nanodrager GAL-GNR een hoge biocompatibiliteit had in vergelijking met GNR, wat de veiligheid van de toepassing garandeert.

Toxiciteit van GAL-GNR. Hepa1-6-cellen werden gedurende 24 of 48 h bij de aangegeven concentraties behandeld met GNR (CTAB-GNR) of GAL-GNR. De levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met MTT-assay (n =5)

Hepatomacellen-gerichte levering van siRNA en gen-uitschakeling van BRAF in vitro

Het vermogen om siRNA in kankercellen af ​​te geven is een van de belangrijkste functies van nanomaterialen. Om het potentieel van GAL-GNR bij siRNA-afgifte te onderzoeken, hebben we de werkzaamheid van gen-uitschakeling gedetecteerd met behulp van siBRAF geladen door GAL-GNR in Hepa1-6-cellen. Vergeleken met de blanco groep heeft de expressie van BRAF in met GAL-GNR-siGL2 (negatieve controle) getransfecteerde cellen geen verandering, terwijl de met GAL-GNR-siBRAF getransfecteerde cellen een significante afname hadden (Fig. 4a). Bovendien was het silencing-effect dosisafhankelijk, wat gecorreleerd is met de toename van de GAL-GNR-concentratie. De qPCR-resultaten toonden aan dat de ideale getransfecteerde concentratie van GAL-GNR-siBRAF 30 g/ml was, en de silencing-efficiëntie kan oplopen tot 90,29%, wat vergelijkbaar was met de groep van lipofectamine 2000 (positieve controle). Het resultaat van western blot was consistent met qPCR en de eiwitexpressie van BRAF werd neerwaarts gereguleerd na 48  h transfectie (Fig. 4b).

Hepatoomcel-gerichte levering van siRNA en gen-uitschakeling van BRAF in vitro. een Het mRNA van BRAF-expressie na GAL-GNR-siBRAF-transfectie. Hepa1-6-cellen werden gedurende 24 uur getransfecteerd met verschillende concentraties GA-GNR met dezelfde hoeveelheid BRAF-siRNA (1 g). De expressie van BRAF-mRNA werd bepaald met qPCR. De foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van drie experimenten (***p <0,001). b De eiwitexpressie van BRAF in Hepa1-6 na GAL-GNR-siBRAF-transfectie. Hepa1-6-cellen werden gedurende 48 uur getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 of PBS, de niveaus van BRAF en β-actine werden bepaald door Western-blot. c en d Op leverkanker gericht leveringsvermogen van GAL-GNR-siBRAF. Eén microgram cy3-gelabeld siBRAF werd gedurende 20  min bij kamertemperatuur geïncubeerd met lip2000, PEI-GNR (30 g/ml), GAL-GNR (30 g/ml) en vervolgens toegevoegd aan de media van Hepa1-6-cellen. Voor een competitieve remmingstest werden Hepa1-6-cellen een nacht voorbehandeld met Lactobionzuur. De intracellulaire fluorescentie-intensiteit werd waargenomen onder de fluorescentiemicroscoop (schaalbalk =200 m), en de mRNA-expressies van BRAF werden gekwantificeerd door q-PCR. De foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van drie experimenten (*p <0,05)

Lactobionzuur is qua structuur vergelijkbaar met GAL en kan competitief worden gecombineerd met de asialoglycoproteïnereceptor (ASGPR) die tot expressie wordt gebracht op het oppervlak van het celmembraan van hepatocellulair carcinoom [35]. Om de specifieke doelgerichtheidsefficiëntie van GAL-GNR te bevestigen, werden Hepa1-6-cellen vooraf geïncubeerd met lactobionzuur en vervolgens getransfecteerd met GAL-GNR-siBRAF. Onbehandelde cellen werden gebruikt als blanco controle en klassiek transfectiereagens lipofectamine 2000 werd gebruikt als positieve controle. Zoals getoond in Fig. 4c, was de rode fluorescentie-intensiteit van GAL-GNR-getransfecteerde cellen vergelijkbaar met de positieve controlegroep, terwijl de fluorescentie-intensiteit van PEI-GNR-getransfecteerde cellen significant verminderd is. Aan de andere kant werden cellen getransfecteerd met alleen GAL-GNR-siBRAF waargenomen sterkere rode fluorescentie van Cy3 dan Hepa1-6-cellen die waren voorbehandeld met lactobionzuur (Fig. 4c), en het resultaat van qPCR was consistent met dat van rode fluorescentieresultaten ( Afb. 4d). Deze resultaten illustreerden verder dat GAL de endocytose van siRNA door Hepa1-6-cellen effectief bevorderde en kan worden toegepast als een gericht deel van HCC.

De impact van GAL-GNR-siBRAF op proliferatie, migratie en invasie van Hepa1-6-cellen

BRAF speelt een belangrijke rol in de MAPK-route, die verantwoordelijk is voor het reguleren van celproliferatie, migratie en invasie [36]. Om de impact van GAL-GNR-siBRAF op hepatocellulaire carcinoomcellen te beoordelen, analyseerden we eerst de celproliferatie door MTT-assays. Zoals getoond in Fig. 5a, was de proliferatie van met GAL-GNR-siBRAF getransfecteerde hepa1-6-cellen significant verminderd in vergelijking met de GAL-GNR-siGL2 (negatieve controle) of PBS-behandelde cellen. Vervolgens hebben we het effect van GAL-GNR-siBRAF op celmigratie onderzocht door middel van scratch- en transwell-assays. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).

The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. een Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0,05). b Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). c en e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d en f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)

To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF

Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).

Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. een 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm ² ) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. b Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope

The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.