Eenvoudige aanpak om rGO@Fe3O4-microsferen voor te bereiden voor de magnetisch gerichte en NIR-responsieve chemo-fotothermische combinatietherapie

Abstract

Nabij-infrarood (NIR)-lichtgevoelig grafeen heeft een opwindend effect aangetoond op fotothermische ablatietherapie bij kanker. Hierin rapporteren we over de bereiding van Fe₃ O₄ -versierde holle grafeenmicrosferen (rGO@Fe₃ O₄ ) door een gemakkelijke sproeidroog- en coprecipitatiemethode voor de magnetisch gerichte en NIR-responsieve chemo-fotothermische combinatietherapie. De microsferen vertoonden een zeer hoog specifiek oppervlak (~ 120,7 m² g⁻¹ ) en groot poriënvolume (~ 1,012 cm³ g⁻¹ ), wat duidelijke voordelen aantoont voor een hoge laadcapaciteit van DOX (~ 18,43%). NIR geactiveerd fotothermisch effect van de rGO@Fe₃ O₄ microsferen reageerden op een aan-uit manier en induceerden een hoge fotothermische conversie-efficiëntie. Bovendien, The Fe₃ O₄ op de microsferen vertoonden een uitstekend vermogen om tumorcellen te richten. De chemo-fotothermische behandeling op basis van rGO@Fe₃ O₄ /DOX vertoonde in vitro superieure cytotoxiciteit ten opzichte van Hela-cellen. Uit onze onderzoeken bleek dat rGO@Fe₃ O₄ /DOX-microcapsules hebben een groot potentieel bij gecombineerde chemo-fotothermische kankerbehandeling.

Inleiding

Kanker is een van de meest kwaadaardige ziekten ter wereld en is een belangrijke doodsoorzaak bij mensen [1, 2]. Hoewel chemotherapie vaak wordt gebruikt bij de behandeling van kanker in de kliniek, beperken verschillende belangrijke problemen, waaronder een lage therapeutische efficiëntie en uitgebreide bijwerkingen, de toepassing ervan ernstig [3]. Geneesmiddelafgiftesystemen (DDS) hebben grote voordelen laten zien bij het verbeteren van de oplosbaarheid, biologische beschikbaarheid en tumoraccumulatie van geneesmiddelen, die naar verwachting hun antitumorefficiëntie aanzienlijk zullen verbeteren [4]. Onlangs hebben holle microbolletjes die worden gebruikt als medicijnafgiftesystemen steeds meer aandacht gekregen vanwege hun grote oppervlak en overvloedige poreuze structuren [5,6,7,8], en verschillende holle microbolletjesmaterialen zijn ontworpen met innovatieve technologieën [9,10,11 ,12,13].

Grafeenoxide (GO), een nieuw type anorganisch vrij-metaalmateriaal, is uitgebreid onderzocht bij de toediening van geneesmiddelen vanwege zijn unieke kenmerken, zoals goede biocompatibiliteit, lage kosten en eenvoudige bereiding [14,15,16,17]. Met name grafeenoxide kan licht effectief omzetten in warmte wanneer het wordt geactiveerd door NIR-straling [18,19,20], wat een veelbelovende strategie wordt om het fotothermische therapie-effect van kanker te verbeteren. Chen-groep heeft gemeld dat GO de geneesmiddelen tegen kanker zou kunnen leveren door niet-covalente interactie zoals π-π-stapeling, waterstofbinding en elektrostatische adsorptie [21]. De 2D grafeenoxide nanosheet heeft echter de neiging om te agglomereren vanwege het grote specifieke oppervlak en de van der Waals-bindingen tussen de grafeenlagen [17, 22], wat resulteert in een slechte oplosbaarheid in water en een afnemend vermogen om medicijnen te laden. Er zijn enkele strategieën onderzocht om deze tekortkomingen te verhelpen. De Tsukruk-groep heeft holle grafeencapsules ontwikkeld met behulp van laag-voor-laag assemblagetechnologie [23], die een extreem hoge medicijnbelading vertoonde in vergelijking met andere GO-materialen. Dit zou kunnen worden bijgedragen aan het hoge specifieke oppervlak en het grote poriënvolume van de holle capsule die door GO is gestabiliseerd. Er zijn echter maar weinig rapporten die verwijzen naar de studie van GO met een driedimensionaal verbonden poriestructuur voor medicijnafgifte.

Hoewel veel gerapporteerde medicijnafgiftesystemen een superieur medicijnlaadvermogen en gecontroleerd medicijnafgiftegedrag hebben vertoond, zijn hun preklinische onderzoek en toepassingen ook beperkt vanwege een onvoldoende specificiteit om tumorweefsels te targeten [24]. Van de verschillende toedieningssystemen voor geneesmiddeldoelen, Fe₃ O₄ , wordt een magnetisch doelwitmateriaal wild gebruikt in kankertherapie vanwege zijn hoge magnetische reacties, stabiele kwaliteit en gemakkelijke prestatie [25,26,27,28,29]. Ni group heeft een Fe₃ . ontwikkeld O₄ @SiO₂ nanodeeltjes met kern-schaalstructuur met superparamagnetische eigenschappen voor magnetische targeting van tumoren [30]. Verder Fe₃ O₄ verankerde GO-nanodeeltjes zijn goed bestudeerd in combinatie van magnetische doelafgifte en fotothermische therapie [31,32,33,34].

In de huidige studie rapporteren we een geavanceerde strategie voor het ontwikkelen van een DDS-platform dat bestaat uit een met ijzeroxide versierde holle rGO-microsferen (rGO@Fe₃ O₄ ) voor de magnetisch gerichte en NIR getriggerde fotothermische therapie (PTT). Zoals weergegeven in Schema 1, rGO@Fe₃ O₄ holle microsferen werden bereid door middel van drie stappen. Ten eerste, rGO-SiO₂ wordt gesynthetiseerd door sproeidroogmethode met behulp van SiO₂ als een sjabloon en vervolgens werden holle rGO-microsferen verkregen door SiO₂ . te verwijderen met HF-ets. Daarna, Fe₃ O₄ nanodeeltjes werden verankerd op holle rGO-microsferen om rGO@Fe₃ te construeren O₄ microsferen. In dit systeem wordt rGO gediend als een NIR-getriggerde PTT-agent en Fe₃ O₄ kan de magnetische targeting-eigenschap bieden aan Hela-cel. Doxorubicine (DOX), ingekapselde microsferen (rGO@Fe₃ O₄ /DOX) op basis van poriënadsorptie en π-π-stapeling, zal naar verwachting een ultrahoge medicijnlaadcapaciteit en pH-responsief medicijnafgiftegedrag vertonen, en kan het antikankereffect voor de combinatie van fotothermische chemotherapie aanzienlijk verbeteren.

Schematische illustratie van rGO@Fe₃ O₄ /DOX-microsferen en de gecombineerde fotothermische chemotherapie voor tumorremming

Materialen en methoden

Materialen

IJzerchloridehexahydraat (FeCl₃ ·H₂ O), natriumhydroxide (NaOH) en ferrosulfaatheptahydraat (FeSO₄ ·7H₂ O) werden gekocht van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Hela-cellen zijn van Tianjin Cancer Hospital. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)_, Doxorubicinehydrochloride (DOX·HCl), Dulbecco's minimum essential medium (DMEM), 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en cell counting kit-8 (CCK-8) werden gekocht bij Solarbio Science and Technology Co. , Ltd. SiO₂ (~ 300 nm) werd gekocht van Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Grafeenoxide-deionwateroplossing (2 mg/ml) was een in de handel verkrijgbaar product van Nanjing Xianfeng Company.

Voorbereidingen van rGO@Fe₃ O₄ Microsferen

Holle grafeenmicrosferen werden bereid via een sproeidroogmethode met behulp van SiO₂ (300 nm) als de sjabloon. In het kort, 100 mL SiO₂ suspensievloeistof (50 mg mL⁻¹ ) werd langzaam gedruppeld in 300 mL GO waterige oplossing (2 mg mL⁻¹ ) onder drastisch roeren werd de gemengde oplossing gesproeidroogd bij 200°C in een sproeidroogeenheid. Vervolgens werd het product gedurende 2 uur onder Ar-bescherming en rGO-SiO₂ bewaard bij 300°C. werd verkregen. SiO₂ . verwijderen , rGO-SiO₂ werd gedurende 48 h bij 60°C in HF-oplossing (10%) geplaatst. Het vaste product werd meerdere keren gewassen en gedroogd in een vacuümdroogoven bij 60°C gedurende 12°C, uiteindelijk werd rGO verkregen met een opbrengst van 75%.

De rGO@Fe₃ O₄ nanodeeltjes werden bereid via de coprecipitatiemethode. In een typisch proces voor de synthese van rGO@Fe₃ O₄ nanodeeltjes, 0,27 g FeCl₃ ·H₂ O, 0,28 g FeSO₄ ·7H₂ O, en 0,1 g rGO holle microsferen werden opgelost in 10 mL gedeïoniseerd water en 30 min bij 50°C geroerd. Vervolgens 60 mL NaOH (0,15 mol L⁻¹ ) werd langzaam toegevoegd onder continu roeren gedurende 12 uur bij 50°C. De producten werden tenslotte magnetisch gescheiden en herhaaldelijk gewassen met gedeïoniseerd water en ethanol, gevolgd door 12 uur drogen bij 60 °C onder vacuüm.

Structurele karakterisering

De grootte en morfologie van het monster werden geanalyseerd met behulp van een veldemissie scanning elektronenmicroscopie (FE-SEM, Hitachi, S-4800) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEM2100F, JEOL). De samenstelling van de producten werd geanalyseerd via een röntgendiffractiesysteem (XRD, D8 Focus, Cu Ka-straling, Bruker, Duitsland) met een scansnelheid van 12°/min in een bereik van 10 tot 80°. Ook werd röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) uitgevoerd op een XPS-spectrometer (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, Amerika). De FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) werden geregistreerd van 500 tot 4000 cm⁻¹ met een resolutie van 4 cm⁻¹ . Magnetische metingen werden uitgevoerd met behulp van een supergeleidende kwantuminterferentie-apparaat (SQUID, Quantum Design MPMS) magnetometer bij kamertemperatuur (300 K). De Raman-spectra werden verzameld met behulp van een Raman-spectroscoop (Renishaw, inVia Reflex, Engeland) met een laser met een golflengte van 532 nm. De inhoud van rGO werd geëvalueerd met behulp van een thermogravimetrische analysator (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). Het specifieke oppervlak werd gemeten met de Brunauer-Emmett-Teller (BET) techniek. UV-Vis-spectra werden opgenomen met behulp van een Beckman DU 800 nucleïnezuur/eiwitanalysator (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

DOX laden en vrijgeven

DOX, een model chemotherapeutisch medicijn doxorubicine, werd ingekapseld in de kernen van rGO@Fe₃ O₄ om het laad- en afgiftegedrag van geneesmiddelen tegen kanker in vitro te evalueren. rGO@Fe₃ O₄ /DOX werd opgesteld volgens de vorige referentie. In het kort, 10 mL (0,2 mg mL⁻¹ ) waterige DOX-oplossing werd toegevoegd aan 10 mg rGO@Fe₃ O₄ oplossing werd het mengsel ultrasoon gehomogeniseerd om geen significante precipitatie te verzekeren. Vervolgens werd het mengsel geëquilibreerd op een heen en weer bewegende schudder (SK-O180-Pro) met een snelheid van 150 rpm gedurende 24 u. Na centrifugeren bij 6000 rpm gedurende 10 min, werd onbeladen DOX verwijderd, het supernatant van rGO@Fe₃ O₄ /DOX werd gemeten via een UV-Vis-spectrofotometer om de hoeveelheid geladen DOX te bepalen. De OD van DOX werd geregistreerd bij 490 nm, de volgende vergelijkingen werden gebruikt om de laadefficiëntie (LE) en laadcapaciteit (LC) van de DOX te berekenen:

$$ \mathrm{LE}=\left(\mathrm{total}\ \mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Free}\ \mathrm{DOX}\right)/ \mathrm{total}\ \mathrm{bedrag}\ \mathrm{of}\ \mathrm{DOX} $$$$ \mathrm{LC}=\left(\mathrm{total}\ \mathrm{bedrag}\ \mathrm {of}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Free}\ \mathrm{DOX}\right)/\mathrm{bedrag}\ \mathrm{of}\mathrm{rGO}@{\mathrm{Fe}}_3 {\mathrm{O}}_4/\mathrm{DOX} $$

De in vitro afgiftestudies van DOX werden uitgevoerd door rGO@Fe₃ O₄ /DOX (10 mg) in een dialysezak (MWCO =1000) met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 30 mL) bij pH 5,4, 6,5 of 7,4, in een waterbad van 37 °C en schudden bij 80 rpm. Met vooraf bepaalde tussenpozen werd 3 mL van het afgiftemedium verzameld en de hoeveelheid vrijgekomen DOX werd berekend door de UV-Vis te meten bij 480 nm.

NIR-geactiveerd fotothermisch effect van rGO@Fe₃ O₄ Microsferen

Om de invloed van rGO@Fe₃ . te volgen O₄ dosis op door NIR geactiveerd fotothermisch effect, de rGO@Fe₃ O₄ oplossingen met verschillende concentraties (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mg mL⁻¹ ) werden bestraald met NIR-laser bij 2 W cm⁻² voor respectievelijk 5 min. Verder werd de invloed van NIR-energie op het fotothermische effect geëvalueerd door rGO@Fe₃ te bestralen. O₄ (0.25 mg mL⁻¹ ) met verschillende vermogens (1 W cm⁻² , 1,5 W cm⁻² , 2 W cm⁻² ) gedurende 5 min. De realtime temperatuur is gemeten met een FLIR I5 infrarood thermische camera.

In vitro opname

Hela-cellen werden gezaaid in 35 mm² confocale schalen met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen/put. Na 24 uur incuberen in een incubator (5% CO₂ , 37 °C), werd het medium verwijderd en het verse medium met rGO@Fe₃ O₄ /DOX-microsferen en rGO@Fe₃ O₄ /DOX met magneet werden toegevoegd en nog eens 5 h gekweekt. De rGO@Fe₃ O₄ /DOX-concentratie was 0,1 mg mL⁻¹ . De cellen werden vervolgens drie keer gewassen met koude PBS (pH =7,4) en gefixeerd met 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 20 min (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Duitsland).

Cell Viability Assays

De cytotoxiciteit van deze microsferen werd geëvalueerd met een CCK-8-assay na NIR-behandeling. HeLa-cellen werden gezaaid op platen met 96 putjes (5 x 10³ cellen/putje) in 100 μL van het medium en gekweekt in 5% CO₂ bij 37 °C gedurende 24 uur. Voor de biocompatibiliteitsbeoordeling, rGO@Fe₃ O₄ werden aan het putje toegevoegd met een concentratiebereik van 0,01 tot 0,2 mg mL⁻¹ ; voor de enkele fotothermische therapiegroep, rGO@Fe₃ O₄ werd toegevoegd met een concentratiebereik van 0,01 tot 0,2 mg mL⁻¹ , en het toepassen van NIR-lichtbestraling gedurende 10 min (2 W cm⁻² , 808 nm); voor de gecombineerde fotothermische-chemotherapiegroep, rGO@Fe₃ O₄ /DOX werd toegevoegd met een concentratiebereik van rGO@Fe₃ O₄ /DOX van 0,01 tot 0,2 mg mL⁻¹ , en het toepassen van NIR-lichtverlichting gedurende 10 min (2 W cm⁻² ,808 nm). De cellen werden gedurende 24 uur of 48 uur geïncubeerd. Daarna werden de cellen gewassen met PBS en nog eens 40 min geïncubeerd in 100 L DMEM-medium dat 10 μL CCK-8-oplossing bevat. De levensvatbaarheid werd gedetecteerd met behulp van een microplaatlezer bij een golflengte van 450 nm. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Resultaten en discussies

Synthese en morfologiekarakterisering

De voorbereiding van rGO@Fe₃ O₄ microsferen werd uitgevoerd door middel van drie stappen. Ten eerste, rGO-SiO₂ microsferen werden gesynthetiseerd door sproeidrogen met SiO₂ als sjabloon. De morfologie van rGO-SiO₂ microsferen werd gekarakteriseerd door SEM en TEM. Zoals getoond in Fig. 1a, de rGO-SiO₂ microsferen met een diameter van 3 μm vertoonden een uniforme bolvorm en bestonden uit een groot aantal dichtbevolkte SiO₂ nanodeeltjes (~ 300 nm). De TEM-gegevens en de hydrodynamische diameter gemeten door dynamische lichtverstrooiing bevestigden ook de resultaten. (Fig. 1d, g). Vervolgens werden holle rGO-microsferen verkregen door SiO₂ . te verwijderen van rGO-SiO₂ met verwarming tot 300 °C en HF etsen. Door SiO₂ konden duidelijke poriën met een poriegrootte van ongeveer 300 nm worden waargenomen oplossen (Fig. 1b, e). Eindelijk, Fe₃ O₄ vanwege het magnetische gerichte vermogen werd op de poreuze rGO gedecoreerd door de coprecipitatiemethode. De waarneming van SEM en TEM illustreerde dat de opmerkelijke afname van de poriegrootte na Fe₃ O₄ belading werd verkregen (Fig. 1c, f), wat de haalbaarheid van medicijnafgifte en de gecontroleerde medicijnafgifte opleverde. Met name de deeltjesgrootte en hydrodynamische grootteverdeling van rGO-SiO₂ , rGO, rGO@Fe₃ O₄ geen zichtbare veranderingen meer hebben tijdens deze behandelingen (Fig. 1g, h, i).

Morfologische karakterisering van microsferen. SEM-afbeeldingen van (a ) rGO-SiO₂ , (b ) rGO, (c ) rGO@Fe₃ O₄; TEM-afbeeldingen van (d ) rGO-SiO₂ , (e ) rGO, (f ) rGO@Fe₃ O₄; hydrodynamische grootteverdeling van de overeenkomstige monsters (g ) rGO-SiO₂ , (u ) rGO, (i ) rGO@Fe₃ O₄

Structuur en compositiekarakterisering

Om de succesvolle voorbereiding van rGO@Fe₃ . verder te bevestigen O₄ , SEM met EDS werd gebruikt om de structuur en samenstelling van de microsferen te onderzoeken. De EDS-afbeeldingen van rGO@Fe₃ O₄ werden gekenmerkt door het visualiseren van de inelastisch verstrooide elektronen in de energieverliesvensters voor elementair O, Fe en C, en de verschillende kleurgebieden vertegenwoordigen respectievelijk met O, Fe en C verrijkte locaties in echte structuren. Zoals getoond in Fig. 2a en b, waren Fe en O wijd verspreid in rGO@Fe₃ O₄ microsferen met een hoge laaddichtheid. Figuur 2d bevestigde dat de Fe₃ O₄ nanodeeltjes uniform gedispergeerd in de rGO met een diameter van ongeveer 18 nm, wat resulteert in een scherpe afname van de poriegrootte in rGO@Fe₃ O₄ microsferen. Het geselecteerde gebiedselektronendiffractiepatroon (SAED) verifieerde verder de aanwezigheid van Fe₃ O₄ in rGO (Fig. 2e), de karakteristieke resonantie in 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm en 1,49 nm vlakafstand toegewezen aan de 220, 311, 400, 511 en 440 vlakken van de face-centered-cubic fase van Fe₃ O₄ , respectievelijk. De pieken verschenen bij 220, 311, 400, 511 en 440, wat overeenkomt met Fe₃ O₄ werden ook gedetecteerd in de XRD-spectra, wat consistent was met SAED-resultaten (figuur 2c). Er wordt echter gemeld dat Fe₃ O₄ en γ-Fe₂ O₃ konden niet onafhankelijk worden onderscheiden door het XRD-patroon voor dezelfde locatie van karakteristieke pieken [35]. Het XPS-resultaat toonde aan dat de overheersende pieken bij 725,9/724,5 eV en 714,1/711,0 eV, overeenkomend met Fe2p_1/2 en Fe 2p_3/2 van de rGO@Fe₃ O₄ (Fig. 2g, h), respectievelijk, die de coëxistentie van Fe³⁺ aangeeft en Fe²⁺ in Fe₃ O₄ [36]. Thermogravimetrische (TGA) analyse werd uitgevoerd om het thermische degradatiegedrag van rGO in rGO@Fe₃ te volgen O₄ microsferen door het monster te verwarmen tot 800°C en af te koelen tot 100°C in een luchtatmosfeer (Fig. 2f). De massaverliescurve toonde twee verschillende massaverliesregio's, waaronder het dehydratatiegebied (40-300 °C) en het devolatilisatiegebied (300-800 °C) van rGO in rGO@Fe₃ O₄ , het koolstofgehalte berekend op basis van het monster was 25,6 gew.%.

Structuur- en samenstellingskarakterisering van rGO@Fe3O4. (een , b ) SEM met EDS-kaartafbeeldingen van rGO@Fe₃ O₄ microsferen:C-, Fe- en O-elementen; (c ) XRD-patronen van rGO-SiO₂ , rGO en rGO@Fe₃ O₄ microsferen; (d , e ) SEAD-afbeeldingen van rGO@Fe₃ O₄ microsferen; (f ) TG-curven van rGO@Fe₃ O₄ microsferen; (g , u ) XPS-spectra van rGO@Fe₃ O₄ microsferen; (ik ) Magnetische hysteresislussen van de Fe₃ O₄ en rGO@Fe₃ O₄ microsferen (inzet bovenaan toont coërcitieveldwaarden (Hc) van monsters, en inzet onderaan toont hun suspensies voor en na magnetische scheiding door een externe magneet)

De magnetische eigenschappen van rGO@Fe₃ O₄ microsferen werden onderzocht met behulp van een supergeleidend kwantuminterferentieapparaat. Het magnetische veld werd bij kamertemperatuur geleid met een scanbereik van -20.000 tot 20.000 Oe. Figuur 2i toont de verzadigingsmagnetisatie (Ms) waarde en coërcitiefveld (Hc) waarde van Fe₃ O₄ zijn 66,6 emu g⁻¹ en 9,3'Oe. Na het laden van Fe₃ O₄ op rGO, de Ms-waarde en Hc-waarde van de rGO@Fe₃ O₄ microsferen verlaagd tot 33,9 emu g⁻¹ en 7.44 Oe. De opmerkelijke afname van magnetische verzadiging kan worden bijgedragen aan de diamagnetische eigenschappen van rGO in rGO@Fe₃ O₄ microsferen. Bovendien, het selectieve agglomeratievermogen van rGO@Fe₃ O₄ microsferen werd intuïtief uitgevoerd door een magnetisch scheidingsexperiment. De schorsingen van de Fe₃ O₄ en rGO@Fe₃ O₄ microsferen werden gedurende 2 min met een externe magneet in het flesje gedaan, de suspensies kunnen aan de magneetzijde worden geconcentreerd en de waterige oplossing werd transparant. Toen de magneet werd weggenomen, werd de rGO@Fe₃ O₄ microsferen werden na langzaam schudden weer uniform gedispergeerd, wat aangeeft dat rGO@Fe₃ O₄ microsferen met de verdienste van een goed waterdispergerend vermogen. Het uitstekende waterdispergerende vermogen en de magnetische responseigenschappen hebben de weg vrijgemaakt voor de magnetische gerichte toepassing van rGO@Fe₃ O₄ zoals medicijn draagt bij de behandeling van kanker.

Fotothermische effectanalyse

Gezien de diepere penetratie in het weefsel en minder schade aan de omliggende weefsels van NIR, werd NIR-responsieve fotothermische therapie vaak gebruikt voor de behandeling van tumoren. Vandaar dat het fotothermische transformatiegedrag van rGO@Fe₃ O₄ waterige oplossingen in verschillende concentraties en verschillende vermogensdichtheden werden opgenomen onder NIR-laserbestraling bij 808 nm gedurende 5 min. Figuur 3a, b toonde aan dat de temperatuurstijging van rGO@Fe₃ O₄ was sterk afhankelijk van de concentratie en de laservermogensdichtheid. Wanneer de concentratie van de microsferen maximaal 1 mg mL⁻¹ . was , de temperatuur steeg van 27,9 tot 70,3 °C onder NIR-laserbestraling gedurende 5 min bij 2 W cm⁻² , terwijl de temperatuur voor de PBS-groep net steeg van 31,7 naar 36,2 °C. De hoge fotothermische conversie-efficiëntie van rGO@Fe₃ O₄ zal een groot potentieel hebben voor fotothermische therapie van tumoren volgens eerder rapport dat eiwitdegeneratie en DNA-schade in de cel zal plaatsvinden (gebeurd) bij blootstelling aan 50 °C gedurende 4 tot 6 min [21, 37]. Om intuïtief het fotothermische transformatiegedrag van rGO@Fe₃ . weer te geven O₄ , IR-thermografie werd uitgevoerd en de resultaten werden getoond in Fig. 4c. De rGO@Fe₃ O₄ oplossing met een concentratie van 1 mg mL⁻¹ werd snel verhoogd tot 70,3 ° C na 5 min. NIR-bestraling, terwijl de watergroep geen duidelijke veranderingen vertoonde, wat consistent was met de thermometrieresultaten. Verder is de fotothermische stabiliteit van de rGO@Fe₃ O₄ werd bestudeerd door een laser aan/uit procedure uit te voeren met een 808 nm laser bij 2 W cm⁻² gedurende zes cycli (Fig. 3d). De identieke temperatuurstijging werd verkregen, wat wijst op de perfecte NIR-fotothermische stabiliteit van rGO@Fe₃ O₄ composieten. Deze resultaten toonden aan dat rGO@Fe₃ O₄ microsferen die veelbelovend zijn als fotothermisch middel voor fotothermische therapie bij kanker.

Fotothermische effecten van rGO@Fe3O4. een Concentratieafhankelijke temperatuurverandering van rGO@Fe₃ O₄ oplossingen in verschillende concentraties (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mg mL⁻¹ ) onder 808 nm bestraling bij 2 W cm⁻² gedurende 5 min. b Vermogensafhankelijke temperatuurrespons van 0,25 mg mL⁻¹ rGO@Fe₃ O₄ oplossing onder bestraling van een 808 nm NIR-laser gedurende 5 min (1 W cm⁻² , 1,5 W cm⁻² , 2 W cm⁻² ). c Infrarood warmtebeelden van rGO@Fe₃ O₄ oplossing met intervallen van 0, 1, 2, 3, 4 en 5 min gestimuleerd bij 808 nm (2 W cm⁻² ). d Temperatuurstijgingen van rGO@Fe₃ O₄ (0.25 mg mL⁻¹ ) oplossing gedurende 6 opeenvolgende cycli van laser aan/uit onder 808 nm bestraling bij 2 W cm⁻²

Het oppervlak en de poriegrootte van rGO@Fe3O4-microsferen, DOX-laad- en afgiftegedrag. een Stikstofadsorptie-desorptie-isothermen van rGO@Fe₃ O₄ . b Poriëngrootteverdeling van rGO@Fe₃ O₄ . c FTIR-spectra van rGO@Fe₃ O₄ en rGO@Fe₃ O₄ /DOX. d , e SEM en afbeeldingsafbeeldingen van N, Fe en O van rGO@Fe₃ O₄ /DOX-microsferen. v Kinetische curves voor geneesmiddelafgifte verkregen bij verschillende pH-waarden van rGO@Fe₃ O₄ microsferen. g NIR-responsieve DOX-afgifte kinetische curven

Drugs laden en vrijgeven

Het oppervlak en de poriegrootte van rGO@Fe₃ O₄ werden geëvalueerd door BET- en BJH-analyses (Fig. 2a, b). N₂ het type adsorptie-desorptiecurve was het isotherme IV-type en het oppervlak en de poriegrootte waren 120,7 m² g⁻¹ , 2-8 nm en 1,012 cm³ g⁻¹ , respectievelijk. De resultaten toonden aan dat rGO@Fe₃ O₄ bezat mesoporeuze kanalen en een gemiddelde poriegrootteverdeling, met een groot potentieel voor het laden van antitumorgeneesmiddelen. Dan, de rGO@Fe₃ O₄ microsferen met een poreuze structuur werden geserveerd om een model chemotherapeutisch geneesmiddel doxorubicine te laden door eenvoudigweg te mengen en licht te soniceren. De ATR-FTIR-analyse verifieerde verder de stabiele opname van DOX in rGO@Fe₃ O₄ vanwege de karakteristieke resonantie van -COOH en benzeengroepen van DOX bij 1726 cm⁻¹ en 1618 cm⁻¹ (Fig. 4c). Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) -observatie toonde aan dat de nieuwe signalen van N-elementen toegewezen aan DOX uniform verdeeld in microbolletjes na DOX-lading (Fig. 4d, e). Bovendien zijn de DOX-laadefficiëntie (LE) en laadcapaciteit (LC) van rGO@Fe₃ O₄ /DOX waren respectievelijk 92,15% en 18,43%. De opmerkelijk hogere LC's van rGO@Fe₃ O₄ /DOX dan veel drugsdragers kunnen worden toegeschreven aan extreem hoge oppervlakten en poriegroottes [19]. De hoge LE van rGO@Fe₃ O₄ /DOX kan worden toegeschreven aan twee aspecten, een daarvan is dat rGO@Fe₃ O₄ kan interageren met DOX door sterke π–π-stapeling tussen sp2-gehybridiseerde π-bindingen van rGO@Fe₃ O₄ en het kininegedeelte van DOX [21], en een andere kan zijn dat ze waterstofbindingen kunnen vormen tussen de carbonzuur (–COOH), hydroxyl (–OH) groepen van rGO@Fe₃ O₄ en de amine (–NH₂ ), hydroxyl (-OH) groepen van DOX. Vervolgens hebben we het DOX-afgiftegedrag in PBS bij pH 7.4, 6.5 en 5.4 gevolgd om de extracellulaire omgevingen van tumor en normale weefsels na te bootsen. Zoals aangegeven in Fig. 4f, werd de afgiftesnelheid van DOX versneld wanneer de pH werd aangepast van 7,4 tot 5,4, en de aanhoudende DOX-afgifte bij pH -5,4 kan tot 73% zijn na een behandeling van 98 h. Daarom is het cumulatieve afgifteprofiel van DOX van rGO@Fe₃ O₄ vertoonden een pH-afhankelijke manier. Deze versnelde afgifte onder zure omstandigheden kan te wijten zijn aan de gedeeltelijke protonering van de hydroxyl- en aminegroepen van DOX, wat leidt tot een hogere oplosbaarheid van geneesmiddelen en verzwakking van waterstofbindingen tussen DOX en grafeen [38]. Verder hebben we ook het NIR-responsieve DOX-afgiftegedrag in vitro bestudeerd. Zoals aangegeven in Fig. 4g, werd de DOX-afgifte versneld door NIR-straling en was de afgiftesnelheid van DOX tot 85%. Dit op pH- en NIR-stimuli reagerende gedrag speelt een belangrijke rol bij een effectieve medicijnafgifte naar de tumorplaats.

In vitro celopname

Om het magnetische richtvermogen van Fe₃ . te verifiëren O₄ in rGO@Fe₃ O₄ microsfeer werden de cellulaire opname-experimenten met of zonder magnetische veldbehandeling kwalitatief onderzocht met confocale laser scanning microscopie (CLSM). Hela-cellen werden geïncubeerd met rGO@Fe₃ O₄ / DOX gedurende 4 uur en de kernen van Hela werden gekleurd door DAPI. De resultaten in Fig. 5 toonden aan dat de zwarte vlek die overeenkomt met rGO@Fe₃ O₄ microbolletjes en duidelijke intracellulaire rode fluorescentiesignalen toegewezen aan DOX werden waargenomen in de rGO@Fe₃ O₄ groep met een magneetveldbehandeling. Daarentegen was er minder zwarte vlek en zwakkere DOX-fluorescentie kan worden gevonden wanneer rGO@Fe₃ O₄ groep zonder magnetische veldbelasting. De verklaring kan zijn dat de zwarte vlek die wordt toegeschreven aan rGO@Fe₃ O4 geïnternaliseerd in de cel kan worden bevorderd door een magneet. De resultaten geven aan dat Fe3O4 in rGO@Fe₃ O4/DOX zou specifiek Hela-cellen efficiënt kunnen targeten en de celinternalisatie van microsferen aanzienlijk kunnen verbeteren, wat een gunstig magnetisch richtvermogen van het medicijnafgiftesysteem bij kankertherapie aantoont.

Magnetische doelevaluatie van rGO@Fe3O4-DOX-microsferen. CLSM-afbeeldingen van rGO@Fe₃ O₄ /DOX-geïncubeerde HeLa-cellen met en zonder magneet (inzetstukken tonen het beeld bij hoge vergroting)

In vitro cytotoxiciteitsanalyses

De biocompatibiliteit van rGO@Fe₃ O₄ werd geëvalueerd met behulp van CCK-8-assay tegen Hela-cellen. Zoals getoond in Fig. 6a, na incubatie met rGO@Fe₃ O₄ bij een groot aantal verschillende concentraties was de levensvatbaarheid van de cellen ook hoger dan 90%, zelfs bij hoge concentraties tot 200 g ml⁻¹ , gaven de resultaten aan dat rGO@Fe₃ O₄ vertoont een hoge biocompatibiliteit en zou kunnen dienen als een efficiënt platform voor medicijnafgifte. De werkzaamheid van fotothermische therapie van rGO@Fe₃ O₄ werd verder onderzocht na incubatie met Hela-cellen gedurende 24 h en 48 h onder NIR-lichtbestraling (808 nm NIR-laser, 10 min). Zoals getoond in Fig. 6b, was de fototoxiciteit duidelijk dosisafhankelijk na NIR-stimulatie, en de levensvatbaarheid van de cellen nam af van 90,37 tot 35,52% bij 24 h en van 93,77 tot 31,75% bij 48 h, wat impliceert dat rGO@Fe₃ O₄ had een uitstekende fototoxiciteit en was veelbelovend in fotothermische therapie. Om de synergetische therapeutische werkzaamheid van fotothermische chemotherapie te schatten, is de cytotoxiciteit van rGO@Fe₃ O₄ /DOX naar Hela-cellen met en zonder NIR-bestraling werden bestudeerd. Zoals getoond in Fig. 6c, d, vertoonde de levensvatbaarheid van de cellen een concentratieafhankelijke en tijdgestuurde manier. Ongeveer 65% en 80% van de Hela-cellen werd gedood door rGO@Fe₃ O₄ /DOX zonder NIR-bestraling en DOX bij 24 h, het verminderde tumordodende vermogen van rGO@Fe₃ O₄ /DOX vergeleken met vrije DOX kan te wijten zijn aan het vertraagde DOX-afgiftegedrag van rGO@Fe₃ O₄ /DOX-microsferen. Na NIR-laserbestraling (808 nm NIR-laser, 10 min), rGO@Fe₃ O₄ /DOX met lasergroep doodde meer dan 86% cellen bij een equivalente dosis DOX (30 μg mL⁻¹ ). Vergelijkbare resultaten konden worden waargenomen na dezelfde behandelingscellen gedurende 48 uur, de afname van de levensvatbaarheid van DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. een Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. b Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. (c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm⁻² ) (*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001)

Conclusions

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ O₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ O₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. De Fe₃ O₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ O₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.