Gefunctionaliseerde folaat-gemodificeerde grafeenoxide/PEI siRNA-nanocomplexen voor gerichte gentherapie voor eierstokkanker

Abstract

Gentherapie is in opkomst als een geldige methode voor de behandeling van eierstokkanker, inclusief klein interfererend RNA (siRNA). Hoewel het zo krachtig is, hebben maar weinig efficiënte genafgiftesystemen de ontwikkeling van gentherapie ernstig belemmerd. In deze studie hebben we een nieuwe genvector PEG-GO-PEI-FA gesynthetiseerd door gefunctionaliseerd grafeenoxide (GO), waarin foliumzuur (FA) specifiek kan binden aan de folaatreceptor (FR), die tot overexpressie wordt gebracht bij eierstokkanker. Karakteriseringen van de nanocomplexen werden geëvalueerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS), atomaire krachtmicroscopie (AFM) en Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR). Het siRNA-condensatievermogen en de stabiliteit werden beoordeeld door agarosegelelektroforese. Cellulaire opname-efficiëntie en lysosomaal ontsnappingsvermogen in eierstokkankercellen werden onderzocht met confocale laser scanning microscopie. Verder werden de cellulaire bioveiligheid van het systeem en de remming van de siRNA-tolerantie geëvalueerd door middel van een CCK-8-assay. De grootte van de PEG-GO-PEI-FA-nanocomplexen was 216,1 ± 2,457 nm en vertoonde milde cytotoxiciteit in eierstokkankercellen. Met een hoge opname-efficiëntie kan PEG-GO-PEI-FA snel uit het lysosoom ontsnappen en het gen vrijgeven. Bovendien kan PEG-GO-PEI-FA/siRNA de groei van eierstokkankercellen effectief remmen. Over het algemeen kan het PEG-GO-PEI-FA/siRNA een veelbelovende strategie bieden voor siRNA-afgifte bij de behandeling van FR-positief ovariumcarcinoom of soortgelijke tumoren.

Inleiding

Eierstokkanker is de belangrijkste gynaecologische doodsoorzaak ter wereld en wordt meestal geassocieerd met slechte klinische resultaten vanwege de moeilijkheden bij vroege diagnose en therapie [1,2,3]. Helaas vertonen conventionele chemotherapeutische middelen inherente beperkingen zoals niet-specifieke distributie, slechte biologische beschikbaarheid, snelle bloedklaring en slechte oplosbaarheid in fysiologische omgevingen [4]. In de afgelopen decennia is gentherapie onderzocht als een mogelijke benadering voor de behandeling van verschillende genetische aandoeningen, waaronder kankers [5,6,7,8]. Het ontbreken van een veilige, zeer efficiënte en selectieve drager voor genafgifte heeft de vooruitgang naar klinische bruikbaarheid echter belemmerd. Momenteel zijn er twee categorieën genvectoren:virale en niet-virale vectoren. Hoewel virale vectoren een hoge transfectie-efficiëntie hebben laten zien, beperken verschillende nadelen hun klinische toepassing, bijvoorbeeld ernstige immuunontstekingsreacties en het risico van recombinatie met wildtype virussen [9, 10]. Daarentegen hebben niet-virale vectoren een uitgebreide afgiftecapaciteit, lage immunogeniciteit en structurele flexibiliteit, waardoor ze uitstekende alternatieven zijn voor virale vectoren [11,12,13]. Met de snelle ontwikkeling van nanotechnologie zijn veel nanodeeltjes onderzocht voor mogelijk gebruik als dragers van genafgifte [14, 15]. Hier had dit werk een nieuwe niet-virale vector PEG-GO-PEI-FA ontworpen die efficiënt aan tumorweefsels kan worden afgeleverd.

Grafeenoxide (GO) is het derivaat van grafiet dat wordt geproduceerd door de meerstapsoxidatie, ultrasoon en zuivering van grafiet [16]. Het GO-oppervlak bevat epoxy-, hydroxyl- en carboxylgroepen [17]. De functionele zuurstofgroepen op het oppervlak geven GO een uitstekende biocompatibiliteit waardoor het een stabiele suspensie in het water en organische oplosmiddelen kan vormen, wat chemische modificaties en functionalisering vergemakkelijkt [18, 19]. GO is dus op grote schaal gebruikt voor fotothermische kankertherapie, medicijn- en genafgifte en biosensoren [20,21,22]. Polyethyleenglycol (PEG) is een veilig, niet-toxisch, biologisch afbreekbaar materiaal; het is door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurd als een hydrofiele medicijndrager [23]. De GO-functionalisatie met PEG kan de stabiliteit onder fysiologische omstandigheden verbeteren, de cyclustijd van GO-nanomateriaal in het lichaam verlengen en de farmacokinetiek van GO-nanomateriaal verbeteren voor een betere tumortargeting [24, 25]. Polyethyleenimine (PEI) is een gouden standaard geworden voor niet-virale vectoren vanwege de hoge transfectie-efficiëntie in verschillende cellijnen [26]. PEI vertoont echter ernstige cytotoxiciteit en slechte biocompatibiliteit, waardoor de klinische toepassingen ervan worden beperkt. In deze studie hebben we een significante afname van de cytotoxiciteit waargenomen wanneer PEI op het oppervlak van GO werd geënt. Foliumzuurreceptor komt tot overexpressie op het oppervlak van verschillende kankercellen, vooral in eierstokkankercellen, zowel voor als na chemotherapie [27]. Voor gerichte genafgifte werden foliumzuurmoleculen covalent gebonden met GO om folaatreceptoren te targeten.

Over het algemeen was het belangrijkste doel van de huidige studie het onderzoeken van een nieuw gericht op GO gebaseerd genafgiftesysteem om het nut van op siRNA gebaseerde gentherapie voor eierstokkanker te vergroten. De verkregen positief geladen PEG-GO-PEI-FA kon worden geladen met siRNA voor genafgifte. De succesvolle synthese, karakterisering, effectieve cellulaire internalisatie en het in vitro antikankereffect werden geanalyseerd met behulp van verschillende technieken. Bovendien werd de veiligheid van dit systeem ook in vitro geëvalueerd.

Materialen en methoden

Materialen

Grafeenoxide werd verkregen van Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Foliumzuur (FA), N -hydroxysuccinimide (NHS) en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) werden gekocht bij Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). Vertakt PEI 25K, PEG (MW =2000), agarose en 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC-HCL) werden gekocht bij Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Fosfaatgebufferde oplossing (PBS), Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en alle andere chemicaliën werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Alle andere chemicaliën waren van reagenskwaliteit. RPMI-1640-medium (Gibco), foetaal runderserum (FBS) (Gibco), trypsine (Gibco) en 20 x TAE-buffer werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Celtelkit8 (CCK-8) werd gekocht bij Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, 4% paraformaldehyde, 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) en Lipofectamine 2000-transfectiereagentia werden gekocht bij Invitrogen Co. Ltd. (China). Dil-fluorescentieprobe (Cat-nummer:C1036) werd gekocht bij Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) kort interfererend RNA (siRNA) werd gesynthetiseerd door Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Voorbereiding van PEG-GO-PEI-FA

De synthese van PEG-GO-PEI-FA is volgens de strategie weergegeven in figuur S2 (A). Ten eerste werd 10 mL GO-waterige suspensie (1000 μg / ml) gedurende 2 uur continu in bad gesoniceerd bij 50 W. Vervolgens werden 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) en NHC (5000 μg/mL) toegevoegd en met tussenpozen 30 min gesoniceerd bij 100 W, gevolgd door toevoeging van PEG (10 mg) gesoniceerd gedurende 30 min en geroerd op een magnetische roerder gedurende 6 h bij 0 °C. Om de niet-gereageerde reagentia te verwijderen en een GO-PEG-oplossing te krijgen, werd het mengsel 24 h gedialyseerd in gedestilleerd water met een dialysemembraan (MWCO, 3500 Da). Vervolgens werd de GO-PEG-oplossing 30 min gesoniceerd, 1 mL EDC·HCL (5000 μg/mL) en NHC (5000 μg/mL) werden toegevoegd en opnieuw 30 min gesoniceerd, gevolgd door het toevoegen van PEI 25K (5000 μg/ml) ) 2 ml. Het mengsel werd 30 min. gesoniceerd en 6 uur bij 0°C geroerd. Om vervolgens de PEG-GO-PEI te verkrijgen, werd het mengsel opnieuw 24 u gedialyseerd in het gedestilleerd water met een dialysemembraan (MWCO, 3500 Da). De PEG-GO-PEI-oplossing werd gedurende 60 min gesoniceerd, 1 mL EDC·HCL (5000 g/mL) en NHC (5000 g/mL) werd toegevoegd en opnieuw 30 min gesoniceerd, gevolgd door toevoeging van 10 mg FA aan de oplossing . De oplossing werd 30 min gesoniceerd en 12 uur bij 0 °C geroerd en 48 uur gedialyseerd om PEG-GO-PEI-FA te verkrijgen volgens de bovengenoemde procedure. De oplossing van nanocomplexen werd gedroogd met een vacuümvriesdroger (Biosafer-10D).

Karakterisering

Het oppervlakte-zeta-potentieel en de gemiddelde deeltjesgrootte van de nanocomplexen in wateroplossing werden gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, VK). De morfologieën van de nanocomplexen werden waargenomen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop in de atmosfeer (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Duitsland). Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) spectra werden verkregen door Thermo Nicolet 6700 FTIR-spectrograaf, met behulp van de KBr-pellet in het bereik van 400-4000 cm⁻¹ . De UV-Vis-absorptiespectra van de nanocomplexen werden gemeten met een UV-Vis-spectrofotometer (UV, EV300, VS). De Raman van de nanocomplexen werd gemeten met een dispersieve Raman-microscoop (Senterra R200-L, Duitsland) met een excitatiegolflengte bij 532 nm.

In vitro biosecurity-assay

De SKOV3 (humane eierstokkankercellen) is gekocht bij Keygen (China). Cellen werden in RPMI-1640-medium gehouden, aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, 100 g/mL streptomycine, en gekweekt bij 37 °C onder een bevochtigde atmosfeer die 5% CO₂ bevat. . In deze studie werd de cytotoxiciteit van materialen geanalyseerd in SKOV3-cellen door middel van CCK-8-assay. In het kort werden de cellen gezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 6 × 10³ cellen/putje in 100 μL 1640 medium dat 10% FBS bevat en vervolgens gedurende 12 uur bij 37 °C geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ . Vervolgens werden GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA toegevoegd in eindconcentraties variërend van 10 tot 1000 g / ml en geïncubeerd met de cellen gedurende nog eens 12 u. Een andere, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA werden geïncubeerd met een verschillende tijd van 4 tot 24 h bij de concentraties van 100 μg / ml. Vervolgens werd 10 L CCK-8 aan elk putje toegevoegd en nog eens 3 u bij 37 °C geïncubeerd. Daarna werd de absorptie bij 450 nm gemeten op een microplaatlezer. Elk groepsexperiment werd drie keer herhaald. De relatieve cellevensvatbaarheid (%) gerelateerd aan controlecellen gekweekt in media werd berekend als (absorptie van monster absorptie van blanco)/(absorptie van controle − absorptie van blanco) × 100%.

Agarosegelvertragingstest

De 20 x TAE-bufferoplossing werd verdund met DEPC-behandeld water om 1% agarose-oplossing te maken. Vervolgens werd de oplossing gedurende 5 min verwarmd door een magnetron om de agarose volledig op te lossen. Toen de temperatuur van de agarose-oplossing daalde tot 55°C, werd een ethidiumbromide (EB, 0,5 g/ml) oplossing in de volumeverhouding van 10.000:1 toegevoegd en gelijkmatig gemengd, waarna de agarose-oplossing werd afgekoeld om agarosegel te vormen. . Het PEG-GO-PEI-, PEG-GO-PEI-FA- en siRNA-mengsel in verschillende gewichtsverhoudingen werden aan het gat toegevoegd. De gel werd gedurende ongeveer 60 min bij 110 V en 40 mA gelopen en vervolgens geobserveerd en geanalyseerd met een ultraviolet-imager.

Cell Uptake Studies van PEG-GO-PEI-FA

Om de celopname te onderzoeken, werden de nanocomplexen gelabeld met FITC volgens de eerder beschreven methode met een kleine wijziging [28]. In het kort, de oplossing van nanocomplexen (ongeveer 1 mg / ml, 2,0 mL) werd gemengd met 0,2 mL FITC (26 mM) opgelost in DMSO en vervolgens een nacht bij kamertemperatuur geroerd. De resulterende mengsels werden gedialyseerd door een membraan van 5000 MWCO om niet-gelabeld FITC te verwijderen en vervolgens gevriesdroogd. De cellen werden gezaaid in een plaat met 6 putjes (met de dekglaasjes) met een dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/putje in 2 mL 1640 medium dat 10% FBS bevat en vervolgens gedurende 12 uur bij 37 °C in een celcultuurincubator geïncubeerd. Vervolgens werd het medium in elk putje vervangen door serumvrij 1640-medium. Vervolgens werden de cellen behandeld met verschillende nanocomplexen/FITC. Cellen die zonder de nanocomplexen zijn behandeld, vormen de controlegroep en cellen die zijn behandeld met PEI 25 K zijn de parallelle controlegroep. Na incubatie gedurende 4 uur bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO₂ , de vloeistof van de kweekplaat werd verwijderd, de cellen werden tweemaal gewassen met koude DPBS (pH =7,4), vervolgens werden 20 L DAPI en 5 L Dil (cytomembraankleurstof) aan elk putje toegevoegd en 20 min bij 37 ° C onder het donker. Vervolgens werden de DAPI en Dil van het kweekmedium verwijderd en tweemaal gewassen met koude DPBS (pH =7,4), en werden de dekglaasjes van cellen eruit gehaald en op een glasplaatje gefixeerd met Permount TM Mounting Medium. Daarna werd het fluorescentiesignaal van de objectglaasjes van cellen waargenomen door Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) en werd de celopname van nanocomplexen geanalyseerd.

Endosomale ontsnapping en penetratie in de kern

Om de cellulaire distributie, endosomale ontsnapping en de penetratie van nanocomplexen te visualiseren, werden SKOV3-cellen gezaaid in een plaat met 12 putjes (met de dekglaasjes) met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen/putje in 2 mL 1640 medium dat 10% FBS bevat en vervolgens 12 h (37 °C, 5% CO₂) geïncubeerd ). Vervolgens werd het medium in elk putje vervangen door 1 mL / putje serumvrij 1640-medium. Vervolgens werden de verschillende nanocomplexen (100 μg/mL) gelabeld door FITC toegevoegd in 12-wells plaat voor 1 mL/well. Na 6 u werd de vloeistof verwijderd, werden de cellen tweemaal gewassen met koude DPBS (pH =7,4) en werd aan de 12-putjesplaat LysoTracker Red (5 g/ml) toegevoegd voor 50 μL/putje. Na incubatie gedurende 15 min bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO₂ , werd de vloeistof van de plaat met 12 putjes verwijderd, de cellen werden tweemaal gewassen met koude DPBS (pH =7,4), vervolgens werd 20 L DAPI aan elk putje toegevoegd en gedurende 20 min bij 4 ° C onder het donker geïncubeerd. Vervolgens werd de DAPI-vloeistof verwijderd en tweemaal gewassen met koude DPBS (PH =7,4). Daarna, met 4% paraformaldehyde 15 min bij kamertemperatuur gefixeerd, werden de dekglaasjes eruit gehaald en op een glasplaatje gefixeerd met Permount TM Mounting Medium. Het fluorescentiesignaal van de glaasjes werd waargenomen door confocale laser scanning microscopie en analyseerde de lysosomale ontsnapping en penetratie in de kern van nanocomplexen [29].

Cyto-inhibitie-analyse

We analyseerden het celremmingseffect van PEG-GO-PEI/siRNA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA met behulp van de CCK-8-assay. Kort daarna werden de cellen gezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 6 × 10³ cellen/putje in 100 μL 1640 medium dat 10% FBS bevat en vervolgens gedurende 12 uur bij 37 °C geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ . Vervolgens werden PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA toegevoegd in eindconcentraties variërend van 10 tot 500 g / ml en geïncubeerd met de cellen gedurende nog eens 12 en 24 u. Vervolgens werden PEG-GO-PEI/siRNA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA geïncubeerd met cellen van 4 tot 48 h bij een concentratie van 100 μg/ml. Het siRNA werd getransfecteerd met Lipofectamine 2000 en onbehandeld als de controlegroep. Vervolgens werd 10 L CCK-8 aan elk putje toegevoegd en nog eens 3 u bij 37 °C geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 450 nm. Elk groepsexperiment werd drie keer herhaald. Het remmingspercentage (%) werd berekend als 1 (absorptie van monster − absorptie van blanco)/(absorptie van controle − absorptie van blanco) × 100%.

Statistieken

Elke experimenttest werd drie keer herhaald en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS 17.0-software. One-way ANOVA-test voor analyse van meerdere groepen en ongepaarde Student's t test voor analyse met twee groepen werden ter vergelijking gebruikt. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde en standaarddeviatie (SD), en de statistische significantie werd ingesteld op p <0,05.

Resultaten en discussie

Synthese van PEG-GO-PEI-FA

De expressie van FR werd eerst geanalyseerd in verschillende kankercellijnen op basis van de Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute.org/ccle) database [30] en verschillende eierstokweefsels op basis van de Gene Expression Profiling Interactive Analyse (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) database [31]. De resultaten waren consistent met eerder onderzoek (Figuur S1). Daarom hebben we FA gekozen als targeting-ligand voor genafgifte.

Grafeenoxide draagt zeker veel zuurstofbevattende groepen, waaronder carboxylen aan de rand, hydroxylen en epoxygroepen op het basale vlak geproduceerd door het oxidatieproces [32]. Om GO (NGO) op nanoschaal te verkrijgen, werd GO continu gekraakt door badsonicatie bij 50 W gedurende 2 h en vervolgens gevolgd door covalente koppeling van PEG/PEI/FA aan GO met behulp van EDC/NHS-chemie, zoals geïllustreerd in figuur S2(A). Figuur S2(B) toonde de behandelingsroute van het PEG-GO-PEI-FA/siRNA. De analyse van de chemische conjugatie werd uitgevoerd door FTIR differentiële spectra-technologie om de spectrale absorptiepieken te verkrijgen [33]. Zoals getoond in Fig. 1a, is het bestaan van OH (3425 cm⁻¹ ), C=O (1719 cm⁻¹ ), en C=H (1350 cm⁻¹ ) functionele groepen werden gevonden in GO en duidden op het bestaan van hydroxyl en carboxyl in het oppervlak van GO. CH (2885 cm⁻¹ ) uitrekkende vibratieband kon worden gevonden wanneer de PEG reageerde met GO via stabiele covalente bindingen; dit gaf aan dat PEG op GO was geënt en dat de PEG-conjugatie-efficiëntie ongeveer 6% was. Nadat PEI en FA hadden gereageerd met GO, werd de NH (1590 cm⁻¹ ), C–N (1420 cm⁻¹ ) werd een uitrekkende vibratieband waargenomen, wat aangeeft dat PEI en FA door verestering op GO waren geënt. Deze resultaten toonden aan dat de conjugatie PEG-GO-PEI-FA met succes was gesynthetiseerd.

De succesvolle synthetische analyse van PEG-GO-PEI-FA met behulp van Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) en UV-Vis-spectrofotometer. een De FTIR-spectra van GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA. b De UV-Vis-absorptiespectra van GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA

Figuur 1b toonde de UV-Vis-absorptiespectra van GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA. De GO had een absorptiepiek van 223 nm. De FA had een absorptiepiek van 275 nm. De GO-PEG vertoonde een vloeiende curve, wat aangeeft dat PEG was geconjugeerd met GO en de berg GO gladder had gemaakt. De PEG-GO-PEI had een absorptiepiek in 219 nm, wat illustreert dat PEI op het oppervlak van GO-PEG was geënt. De PEG-GO-PEI-FA had een absorptiepiek in 219 nm en 275 nm, waaruit bleek dat FA was geënt op de PEG-GO-PEI. Al deze resultaten demonstreerden verder de succesvolle synthese van PEG-GO-PEI-FA.

Karakterisering van PEG-GO-PEI-FA

De gegevens in tabel 1 toonden de deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de nanocomplexen. De deeltjesgrootte van nanocomplexen nam geleidelijk toe tot 218,4 nm, terwijl PEG, PEI en FA progressief op het oppervlak van GO werden geënt. De zeta-potentiaal veranderde van − 16.5 naar +17.5 mv wanneer PEI verbonden was met GO, wat het vermogen om negatief geladen DNA of RNA te adsorberen mogelijk maakte via elektrostatische interactie en cellulaire opname. De zeta-potentialen van PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA waren respectievelijk + 14,7 mv en + 14,5 mv. De zeta-potentialen onthulden dat PEG-GO-PEI-FA of PEG-GO-PEI-FA/siRNA kleiner waren dan PEG-GO-PEI vanwege de negatieve lading van FA en siRNA. Deze gaven aan dat PEG-GO-PEI-FA/siRNA zou kunnen worden geadsorbeerd aan het oppervlak van cellen door de ladingsinteractie en gebruikt kunnen worden door receptor-gemedieerde endocytose op het cytomembraan [34].

De oppervlaktemorfologie en deeltjesgrootte van de nanodrager werden ook gemeten door AFM en DLS. Zoals getoond in Fig. 2a, vertoonde de GO een glad oppervlak en een bladstructuur met een deeltjesgrootte van 192,1 nm. Na PEG-, PEI- en FA-transplantatie op het oppervlak van GO, nam de deeltjesgrootte van PEG-GO-PEI-FA toe tot 216,1 nm en werden veel uitsteeksels waargenomen op het oppervlak van PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b ), wat suggereert dat een groot aantal versieringen op de GO-vellen waren geïmmobiliseerd. Tegelijkertijd was de hoogte van de PEG-GO-PEI-FA meer dan GO, wat voornamelijk te wijten is aan de bevestiging van PEG, PEI en FA op beide vlakken van het GO-blad.

De karakterisering van het leveringssysteem op nanoschaal. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) en dynamische lichtverstrooiing (DLS) werden gebruikt voor het karakteriseren van morfologie en grootteverdelingen:a GO en b PEG-GO-PEI-FA. Raman-spectra voor de analyse van het gegenereerde grafeenoxide-oppervlak van GO, GO-PEG en PEG-GO-PEI c

Raman-spectroscopie is een van de meest gebruikte om de karakterisering en structurele eigenschappen van nanokoolstofmaterialen te meten [35]. Zoals getoond in Fig. 2c, toonde het Raman-spectrum van GO de trillingsband op 1600 cm⁻¹ (G-band) en 1354 cm⁻¹ (D-band), en de oppervlakteverhouding van ID/IG was 1,0385, wat aangeeft dat het deel SP² hybridisatie van GO was verbroken en vormde hydroxyl en carboxyl. GO-PEG en PEG-GO-PEI toonden de trillingsband op 1595 cm⁻¹ (G-band) en 1352 cm⁻¹ (D-band), en de oppervlakteverhouding van ID/IG waren 0,7737 en 0,5238. De oppervlakteverhouding van ID/IG nam geleidelijk af na de PEG- en PEI-reactie met de GO; dit gaf aan dat de PEG en PEI op het oppervlak van de GO waren geënt.

In vitro biosecurity-analyse van de verschillende functionele NGO's

De bioveiligheidskwestie van niet-virale genvectoren is een grote uitdaging gebleven voor klinische toepassingen. De hoge positieve ladingen zorgden niet alleen voor een uitstekend vermogen om genen te condenseren en te beschermen, maar leidden ook tot ernstige cytotoxiciteit [36, 37]. Om de cytotoxiciteit van vrije siRNA-nanocomplexen te testen, werd de CCK-8-test uitgevoerd met SKOV3-cellen die gedurende 4, 8, 12 en 24 h waren geïncubeerd met vrije nanocomplexen in verschillende concentraties (van 10 tot 1000 g / ml). Zoals weergegeven in figuur S3, hadden de nanocomplexen nog steeds een hoge levensvatbaarheid van de cellen bij eierstokkanker bij 1000 g / ml en 24 h. De cytotoxiciteit van alle nanocomplexen vertoonde een tijd- en concentratieafhankelijke manier (levensvatbaarheid van SKOV3-cellen:groter dan of gelijk aan 84,38% voor alle nanocomplexen in 1000 g/ml, en groter dan of gelijk aan 94,21% voor alle nanocomplexen bij 24 h met SKOV3-cellen). Deze resultaten suggereerden dat de nanocomplexen een verwaarloosbare cytotoxiciteit vertoonden en zouden kunnen dienen als een biocompatibele genvector.

De analyse van nanocomplexen gecombineerd met siRNA

Cellulaire opname van vrije RNA-moleculen is meestal lastig vanwege de aanzienlijke negatieve ladingen die ze dragen [38]. Het laden van de negatief geladen biomoleculen door kationische polymeren wordt algemeen toegepast om het probleem op te lossen [39]. In dit artikel werd het laden van siRNA op de PEG-GO-PEI-FA-vector bereikt door siRNA en PEG-GO-PEI-FA in een waterige oplossing te mengen. Zoals weergegeven in tabel 1, was de zeta-potentiaal van PEG-GO-PEI-FA + 14,7 mV, wat aangeeft dat siRNA door elektrostatische interactie aan het oppervlak van PEG-GO-PEI-FA kan worden geadsorbeerd. In deze studie werd het gencondensatievermogen van de nanocomplexen beoordeeld door agarosegelelektroforese [40]. Figuur 3a toonde aan dat PEG-GO-PEI duidelijk condensatievermogen had naar siRNA bij een gewichtsverhouding van 10, terwijl de PEG-GO-PEI-FA volledige vertraging van siRNA-migratie werd waargenomen toen de gewichtsverhouding 20 bereikte (Fig. 3b). Dus PEG-GO-PEI-FA zou siRNA kunnen beschermen tegen afbraak, maar heeft tegelijkertijd een beetje meer nanocomplex nodig om een goed bindingsvermogen aan te tonen. Dit kan worden geassocieerd met de zeta-potentialen van PEG-GO-PEI-FA die niet zo hoog waren. Deze resultaten gaven aan dat PEG-GO-PEI en PEG-GO-PEI-FA voldoende leveringscapaciteit hadden, vooral PEG-GO-PEI-FA, dat verder zijn potentieel als een geldige vector voor de efficiënte en veilige levering van genen vertoonde.

Het siRNA-laadvermogen bij verschillende gewichtsverhoudingen. Agarosegelvertragingstest werd uitgevoerd om de interactie tussen siRNA en nanodrager te evalueren. een PEG-GO-PEI en b PEG-GO-PEI-FA bij de verschillende gewichtsverhoudingen (materialen/siRNA)

Analyse van cellulaire opname

Het is zo cruciaal als de dragers zich specifiek op tumoren kunnen richten voor genafgifte. Om te bevestigen of PEG-GO-PEI-FA-drager gemakkelijk cellen zou kunnen binnendringen, gebruikten we FITC als een fluorescerende sonde voor intracellulaire beeldvorming. Tegelijkertijd werden de kernen gekleurd met DAPI en werd het cytomembraan gekleurd met Dil. Zoals getoond in Fig. 4 vertoonden de controlegroep en PEG-GO-PEI-groep geen groene fluorescentiesignalen rond de kernen en het cytomembraan. Het impliceerde dat PEG-GO-PEI de cellen niet binnenkwam. De PEI 25K en PEG-GO-PEI-FA/siRNA verschenen als groen fluorescentiesignaal rond de kern, wat duidelijk aantoonde dat PEG-GO-PEI-FA celmembranen kon binnendringen en cellen kon binnendringen. De PEG-GO-PEI-FA-nanocomplexen vertoonden de meest actieve cellulaire opname, misschien kan het toeschrijven aan de FA specifiek FR binden dat tot overexpressie wordt gebracht in het oppervlak van SKOV3-cellen. Deze resultaten suggereerden dat FA een cruciale rol speelde bij het bemiddelen van de efficiënte cellulaire opname van PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA-nanocomplexen. Wat nog belangrijker is, het vermogen van FA om zijn receptor te binden werd niet beïnvloed door de covalente amidebinding en de receptor-gemedieerde endocytose was ongehinderd.

Cellulaire opname van verschillende nanocomplexen. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beelden van de cellulaire opname van FITC-gelabelde verschillende nanocomplexen in menselijke eierstokkanker SKOV3-cellen na incubatie gedurende 4 h. Blauw, kernen (DAPI-gelabeld); rood, cytomembraan (Dil-gelabeld); groen, nanocomplexen (FITC-gelabeld). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 m, maar de schaalbalk is 10 m in een enkele cel

Lysosomale ontsnappingsanalyse

Voor het siRNA-afgiftesysteem moeten ze ontsnappen uit het endosoom of gevormde lysosoom. Als dit echter niet het geval is, zal het siRNA degraderen of uit de cel wegvloeien [41,42,43]. We evalueren het endosomale ontsnappingsvermogen door intracellulaire lokalisatie van de nanocomplexen met behulp van CLSM. Omdat veel rapporten hebben aangetoond dat PEI 25K endosomale of lysosomale ontsnapping kan bevorderen door "protonsponseffect" [44], werd de PEI 25K als controle gebruikt. In deze studie werden de nanocomplexen gelabeld met FITC. Ten eerste schatten we dat de nanocomplexen het lysosomale binnenkomen door het gele signaal dat het groene fluorescerende signaal van FITC overlapt met het rode fluorescerende signaal van Lyto Tracker Red. De PEI 25K verscheen als het gele signaal na incubatie gedurende 4 uur met cellen en andere materialen verschenen als het gele signaal na incubatie gedurende 2 uur met cellen, wat impliceert dat de materialen de cellen waren binnengegaan (Fig. 5). Of de nanocomplexen nu wel of niet uit lysosomaal ontsnappen door het heldere cyaansignaal, het groene fluorescerende signaal van FITC combineert met het blauwe fluorescerende signaal van DAPI. Zoals getoond in Fig. 5a, werd het groene signaal waargenomen in de accumulatie in de kernen, en er was een helder cyaan signaal na PEI / siRNA-incubatie gedurende 8 h met cellen, wat aangeeft dat PEI / siRNA uit het lysosoom was ontsnapt. PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA / siRNA hadden echter een zwak groen signaal om de kernen al na 2 uur te penetreren, en een groener signaal verzamelde zich in de kernen samen met de toename van de incubatietijd. En er was een helder cyaansignaal toen het PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA / siRNA gedurende 4 uur met cellen werden geïncubeerd (Fig. 5b, c). Deze gaven aan dat de materialen zo vroeg uit het lysosoom waren ontsnapt. Kortom, deze resultaten toonden aan dat PEG-GO-PEI-FA en PEG-GO-PEI-FA/siRNA een uitstekend endosomaal of lysosomaal ontsnappingsvermogen bleven en lysosomale ontsnapping en gentransfectie in vitro efficiënt kunnen vergemakkelijken.

Cellulaire internalisatie en lysosomale ontsnapping van PEG-GO-PEI-FA waargenomen door CLSM. SKOV3 eierstokkankercellen geïncubeerd met a PEI, b PEG-GO-PEI-FA en c PEG-GO-PEI-FA voor 0,5, 1, 2, 4 en 8 h. Die in blauw waren kernen gekleurd met DAPI, groen waren nanocomplexen gelabeld met FITC, en die in rood vertegenwoordigden endosomen en lysosoomfluorescentie na kleuring met LysoTracker-rood. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 m, maar de schaalbalk is 10 m in een enkele cel

Celremmende evaluatie van de PEG-GO-PEI-FA/siRNA

In het huidige geval werd het therapeutische effect van PEG-GO-PEI-FA/siRNA onderzocht met een CCK-8-assay op SKOV3-cellen in vitro. Zoals getoond in Fig. 6a, vonden we geen significante invloed op de overlevingskans van tumorcellen bij verschillende concentraties (10-100 g / ml) en verschillende tijdstippen (12 en 24 h) in de PEG-GO-PEI- FA groep. Hoewel de concentratie meer dan 100 g/ml was, was het overlevingspercentage van tumorcellen nog steeds meer dan 80%. Dus kozen we 100 g / ml voor de volgende cellulaire remmende studie. Een zwakkere cytotoxiciteit werd vertoond in de PEG-GO-PEI/siRNA- en Lipo2000/siRNA-groep (de remmingsgraad van minder dan 20%). Vergeleken met PEG-GO-PEI/siRNA en Lipo2000/siRNA had PEG-GO-PEI-FA/siRNA een significant remmend effect op de groei van SKOV3-tumorcellen. PEG-GO-PEI-FA / siRNA remde SKOV3-cellen op een tijdafhankelijke manier (figuur 6b). Deze resultaten gaven aan dat PEG-GO-PEI-FA/siRNA het beste remmende effect had op de toename van tumorcellen en dat we PEG-GO-PEI-FA konden gebruiken als een ideale nanodrager voor genafgifte.

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. een SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)

Conclusions

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en de aanvullende informatiebestanden.

Afkortingen

AFM:: Atoomkrachtmicroscoop
CCK-8:: Cell counting kit8
CCLE:: Cancer cell line encyclopedia
CLSM:: Confocal laser scanning microscope
DAPI:: 4′-6-Diamidino-2-phenylindole
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
DMSO:: Dimethylsulfoxide
DPBS:: Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EB:: Ethidium bromide
EDC∙HCL:: 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride
FA:: Folic acid
FBS:: Foetaal runderserum
FITC:: Fluorescein isothiocyanate
FITR:: Fourier transform infrared spectroscopy
FR:: Folate receptor
GEPIA:: Gene expression profiling interactive analysis
GO:: Grafeenoxide
MWCO:: Molecular weight cutoff
NGO:: Nanoscale graphene oxide
NHS:: N -hydroxysuccinimide
NP's:: Nanodeeltjes
PBS:: Phosphate-buffered solution
PDI:: Polydispersiteitsindex
PEG:: Polyethyleenglycol
PEI:: Polyethyleneimine
siRNA:: Small interfering RNA

Wrinkle Structured Network van zilvergecoate koolstofnanobuisjes voor draagbare sensoren HOT grafeen en HOT grafeen nanobuizen:nieuwe laagdimensionale halfmetalen en halfgeleiders

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal