Autofagie-remmer (LY294002) en 5-fluorouracil (5-FU) combinatie-gebaseerd nanoliposoom voor verbeterde werkzaamheid tegen slokdarm-plaveiselcelcarcinoom

Resultaten en discussie

Kankercellen zijn vaak resistent tegen afzonderlijke geneesmiddelen tegen kanker en zullen van nature niet effectief zijn. In dit opzicht zal een combinatie van twee of meer geneesmiddelen op een synergetische manier werken door zich op verschillende cellulaire doelen te richten. Van de autofagieremmers is gemeld dat ze multidrug-resistentie (MDR) van kankercellen overwinnen. Verschillende onderzoeken hebben gemeld dat autofagieremmers het beste werken in combinatie met een geneesmiddel tegen kanker. In deze studie hebben we 5-fluorouracil (5-FU) geselecteerd als chemotherapeutisch middel en LY294002 (LY) als autofagieremmer. Om de problemen met de oplosbaarheid en stabiliteit van vrije geneesmiddelen aan te pakken, die op hun beurt resulteren in een korte plasmahalfwaardetijd en een ongewenst toxisch effect, hebben we 5-FU en LY stabiel opgenomen in het gePEGyleerde nanoliposoom (Fig. 1).

Schematische illustratie van de bereiding van 5-fluorouracil en LY-geladen PEGylated nanoliposomen

Voorbereiding en karakterisering van 5-FU en LY-geladen nanoliposomen

Het met twee geneesmiddelen beladen liposoom werd bereid door middel van een dunne-film-hydratatiemethode. De gemiddelde deeltjesgrootte van blanco liposoom bleek ~~110 nm te zijn met een uitstekende dispersiteitsindex. De deeltjesgrootte van dual drug-loaded liposoom (FLNP) nam toe tot ~ -150 nm met een goede polydispersiteitsindex (PDI ~ -150) (figuur 2a). De toename in deeltjesgrootte werd voornamelijk toegeschreven aan de opname van hydrofobe geneesmiddelen in het liposoom. Er is gemeld dat een deeltjesgrootte van ongeveer 200 nm de accumulatie van geneesmiddel in de tumorweefsels zal versterken dankzij het verbeterde permeatie- en retentie-effect (EPR). Het met geneesmiddelen beladen liposoom vertoonde een opslagvermogen op lange termijn dat wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van PEG op het oppervlak dat bijdroeg aan het aangroeiwerende effect. Bovendien vertoonde FLNP een gemiddelde oppervlaktelading van ~ -25 mV, wat wijst op de colloïdale stabiliteit. De negatieve oppervlaktelading vermijdt interacties in de systemische circulaties.

Fysisch-chemische karakteriseringen van FLNP. een Deeltjesgrootteverdeling van FLNP volgens de DLS-methode. b TEM-afbeelding van FLNP. c AFM-beeld van FLNP

De morfologie van FLNP werd voor het eerst waargenomen met behulp van TEM (figuur 2b). Zoals te zien was, waren de deeltjes typisch bolvormig en uniform verspreid in het koperen rooster. Een licht grijzige schil op de omtrek werd toegeschreven aan de aanwezigheid van PEG op het oppervlak. De deeltjesgrootte die werd waargenomen bij TEM was iets kleiner in vergelijking met die van DLS. De deeltjesgrootte van TEM was ~~130 nm vergeleken met ~~150 nm van DLS. Het verschil in grootte van deeltjes van twee technieken kan worden toegeschreven aan de meettoestand. De TEM meet het deeltje in gedroogde omstandigheden, terwijl DLS het deeltje meet in gehydrateerde omstandigheden en de PEG-ketenverlenging. De deeltjesmorfologie werd verder bevestigd door AFM (figuur 2c). De deeltjes waren cirkelvormig en aanwezig als een afgeplat object op het mica-oppervlak.

Drug laden en in vitro geneesmiddelafgifte

FLNP vertoonde een hoge invangefficiëntie voor beide geneesmiddelen (92,5% voor 5-FU en 86% voor LY) met een actieve geneesmiddelbelading van ongeveer ~-16% w /w . Het in vitro afgiftegedrag van 5-FU en LY van FLNP werd waargenomen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4). De twee componenten van FLNP komen op een gecontroleerde manier vrij onder pH 7,4 omstandigheden. Bijvoorbeeld, ~~30% van 5-FU en ~~40% van LY vrijgegeven uit het liposoom tegen het einde van 24 uur. De afgifte van medicijnen ging door tot 90 uur met ~~60% van 5-FU en ~~75% van LV vrijgegeven (Fig. 3). Opgemerkt moet worden dat de afgiftesnelheid aanzienlijk afnam na 24 uur tot 90 uur, wat wijst op de langzame diffusie van medicijnen uit het NP-systeem. Een dergelijke gecontroleerde afgifte van het medicijn zou gunstig zijn voor de kankergerichte toepassingen. Verder wijst een langzame afgifte van het geneesmiddel onder neutrale omstandigheden op minder bijwerkingen voor de normale weefsels. Het is vermeldenswaard dat LY relatief sneller wordt vrijgegeven in vergelijking met die van 5-FU. Het zal een gunstige situatie zijn omdat de LY de kankercellen gevoeliger zou maken voor 5-FU, wat resulteert in een versterkt cytotoxisch effect in de tumorweefsels.

Afgifteprofielen van 5-FU en LY van FLNP in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). De hoeveelheid vrijgekomen geneesmiddel werd gekwantificeerd door HPLC-analyse

Onderzoek naar mobiele internalisatie

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) werd uitgevoerd om het subcellulaire patroon van FLNP te bepalen. De rhodamine B werd gebruikt als een fluorescerende sonde om de intracellulaire opname van de NP's in ESCC te volgen. Zoals te zien is (Fig. 4), werd een sterk rood fluorescentiesignaal waargenomen in het cellulaire cytoplasma op de omtrek van de kern, wat wijst op de typische endocytose-gemedieerde cellulaire opname. De receptor-gemedieerde cellulaire opname zal de geleidelijke afgifte van het geneesmiddel in de zure omgeving mogelijk maken. De nanogrootte van het deeltje maakte de gemakkelijke internalisatie van het NP-systeem mogelijk. De resultaten toonden duidelijk aan dat het medicijn de kankercellen binnenkwam via een specifieke route in plaats van de eenvoudige diffusie. De cellulaire opname werd verder gevolgd door FACS. Zoals te zien was, werd een opmerkelijke opname van NP waargenomen na 1 uur incubatie en de cellulaire opname nam toe met de toename van de incubatietijd (2 uur). De grotere cellulaire opname van NP zal de intracellulaire concentratie van ingekapselde geneesmiddelen tegen kanker verhogen, wat de therapeutische werkzaamheid in ESCC verder zal verhogen.

een Confocale laser scanning microscoop (CLSM) afbeelding van HT-29 kankercellen na incubatie met FLNP gedurende 2 uur. De kern werd gekleurd met DAPI en Rhodamine B werd gebruikt als een fluorescerende sonde. b Flowcytometeranalyse van FLNP na incubatie voor verschillende tijdstippen

In vitro antikankereffect

Het cytotoxische effect van individuele formuleringen werd bestudeerd met MTT-assay (Fig. 5). Zoals aangetoond, vertoonden zowel vrije medicijnen als combinatorische NP een typisch concentratieafhankelijk cytotoxisch effect in ESCC. De 5-FU vertoonde een relatief hoger antikankereffect vergeleken met dat van LY in de kankercellen. De combinatie van 5-FU en LY resulteerde in een hoger cytotoxisch effect in vergelijking met dat van individuele geneesmiddelen. Het belangrijkste was dat FLNP een significant hoger antikankereffect vertoonde in kankercellen in vergelijking met dat van gratis cocktailcombinaties. De IC50-waarde van 5-FU, LY, 5-FU + LY en FLNP bedroeg respectievelijk 2,68 g/ml, 5,98 g/ml, 1,54 μg/ml en 0,58 μg/ml. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat LY de autofagie in de kankercellen kan remmen en het beter kan laten reageren op 5-FU. Opgemerkt moet worden dat FLNP effectiever was dan gratis cocktailcombinaties vanwege een meer geprogrammeerde afgifte van geneesmiddelen op een gecontroleerde manier. De snellere afgifte van LY uit FLNP leidt tot autofagie-remming die de gevoeligheid van kankercellen voor 5-FU verbetert, wat resulteert in meer celdood [19]. Er is gemeld dat 5-FU na het binnendringen van de kankercellen wordt omgezet in fluorouridinetrifosfaat (FUTP) via fluorouridinemonofosfaat (FUMP) of wordt gemetaboliseerd tot fluorodeoxyuridinetrifosfaat (FdUTP) via twee verschillende routes. De FdUTP werkt als een substraat voor thymidylaatsynthase (TS) en blokkeert de nucleotidesynthese. De 5-FU-metaboliet bindt aan de nucleotide-bindingsplaats van TS en remt de nucleotidesynthese. Deze cyclus leidt tot de uitputting van deoxythymidinetrifosfaat (dTTP) dat de DNA-synthese zal voorkomen en resulteert in een verhoogde kankerceldood [20, 21].

Levensvatbaarheid van de cellen van HT-29-kankercellen na incubatie met respectievelijk vrij 5-FU, LY, 5-FU + LY en FLNP. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door MTT-assay

Apoptose-essay

Het apoptose-effect van de formulering werd geëvalueerd met de Annexin-V / PI-kleuringsmethode (Fig. 6a, b). Dit zal het mogelijk maken om het apoptose-effect van zowel het individuele als het combinatiegeneesmiddelsysteem te bepalen. In overeenstemming met de MTT-assay resulteerde 5-FU (~~20%) in een grotere apoptose van kankercellen vergeleken met die van LY (~~12%), terwijl de combinatie van 5-FU + LY een grotere apoptotische celdood induceerde (~~30%). In vergelijking met elke andere groep induceerde FLNP een grotere apoptose (~   48%) van kankercellen, wat suggereert dat receptor-gemedieerde cellulaire opname de intracellulaire concentratie van geneesmiddelen tegen kanker aanzienlijk verhoogde, wat resulteerde in een hoger therapeutisch effect. Een belangrijke reden voor het hogere antikankereffect van FLNP werd voornamelijk toegeschreven aan de opeenvolgende afgifte van ingekapselde geneesmiddelen waarbij LY de tumorcellen zal sensibiliseren en 5-FU de krachtige cytotoxische effecten ervan zal induceren. Antikankertherapieën werken door apoptose in kankercellen te induceren zonder de omringende normale cellen te beschadigen. De merkbare apoptotische activiteit van FLNP werd voornamelijk toegeschreven aan de hogere accumulatie van nanodeeltjes in de cellen via endocytose-opname en de opeenvolgende afgifte van geneesmiddelen in de intracellulaire omgeving die resulteerde in een synergetisch therapeutisch effect. Er werd verwacht dat een vroege afgifte van de autofagieremmer (LY) het beschermende mechanisme van kankercellen zal verstoren en dat 5-FU daarna sterker zal werken in de kankercellen.

Representatieve flowcytometrische analyseresultaten van celapoptose van HT-29-kankercellen na incubatie met respectievelijk vrij 5-FU, LY, 5-FU + LY en FLNP. Linksonder, levende cellen; rechtsonder, vroege apoptotische cellen; rechtsboven, laat-apoptotische cellen; en linksboven, necrotische cellen

Western Blot-analyse

Het werkingsmechanisme van formuleringen wordt bepaald door Western-blot-analyse (Fig. 7). De expressie van pro-apoptotische en anti-apoptose-eiwitniveaus bij blootstelling aan respectieve formuleringen wordt weergegeven in Fig. 8. p53 is een van de belangrijke regulatoren van de celcyclus en de neerwaartse regulatie ervan wordt geassocieerd met de verhoogde overleving van kankercellen. Er kan worden gezien dat formuleringen de expressieniveaus van p53 significant naar beneden reguleerden, wat wijst op het opmerkelijke effect op de ESCC-cellen. Er is gemeld dat DNA-schade resulteert in de activering van caspase-cascade, wat resulteert in de splitsing van PARP-1, wat wordt beschouwd als een kenmerk van celapoptose [22, 23]. Onze resultaten toonden duidelijk aan dat 5-FU en LY afzonderlijk de expressie van caspase-3 en PARP verhoogden, terwijl zoals verwacht FLNP een opmerkelijke expressie van deze eiwitmarkers induceerde, wat wijst op het superieure antikankereffect. Consequent verlaagde FLNP de expressie van het anti-apoptotische eiwit (Bcl-2) aanzienlijk, wat wijst op de efficiëntie ervan om de therapeutische werkzaamheid in ESCC te verbeteren.

Western-blot-analyse van HT-29-kankercellen na incubatie met respectievelijk vrij 5-FU, LY, 5-FU + LY en FLNP. Western-blot-analyse van gesplitst caspase-3, PARP, Bcl-2 en p53 werd bepaald

In vivo antitumorwerkzaamheidsonderzoek op diermodel. De formuleringen, respectievelijk 5-FU, LY, 5-FU + LY en FLNP, werden toegediend aan tumormuizen en de werkzaamheid werd gedurende 20 dagen bestudeerd

In vivo analyse van tumorgroeiremming

De muizen werden met respectieve formuleringen in muizen geïnjecteerd en het tumorvolume werd tot 20 dagen genoteerd. Zoals te zien is (Fig. 8), vertoonde de controlegroep een gestage toename van het tumorvolume met elk tijdstip tot dag 18. Vergeleken met de controle, regelden vrije geneesmiddelen de groei van de tumor; het was echter niet bevredigend. Het cocktailmengsel van twee geneesmiddelen was relatief effectiever dan de afzonderlijke geneesmiddelen bij het beheersen van het tumorvolume. Belangrijk is dat FLNP significant (p < 0,05; p < 0,0001) hogere antitumorwerking in vergelijking met elke andere groep. Het uiteindelijke tumorvolume was ~ 500 mm ³ vergeleken met ~ 1400 mm ³ voor onbehandelde muizen. Het significant hogere antitumoreffect in het tumormodel werd toegeschreven aan de nanodeeltjes die zich in de tumorweefsels zouden kunnen ophopen vanwege het verbeterde permeatie- en retentie-effect. De gecontroleerde afgifte van medicijnen in de tumorweefsels droeg ook bij aan de hogere werkzaamheid ervan [24].