C60 Fullereen effecten op difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat interactie met DNA in Silico en zijn cytotoxische activiteit tegen menselijke leukemische cellijn in vitro

Abstract

Nieuwe vertegenwoordiger van carbacylamidofosfaten - difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL), dat twee fenoxysubstituenten nabij de fosforylgroep bevat, werd gesynthetiseerd, geïdentificeerd door elementanalyse en IR- en NMR-spectroscopie, en getest als een cytotoxisch middel zelf en in combinatie met C₆₀ fullereen.

Volgens moleculaire simulatieresultaten, C₆₀ fullereen en HL kunnen een interactie aangaan met DNA en een rigide complex vormen dat wordt gestabiliseerd door stapelingsinteracties van HL-fenylgroepen met C₆₀ fullereen en DNA G-nucleotide, evenals door interacties van HL CCl₃ groeperen door ion-π bindingen met C₆₀ molecuul en door elektrostatische bindingen met DNA G-nucleotide.

Met het gebruik van MTT-test, de cytotoxische activiteit van HL tegen menselijke leukemische CCRF-CM-cellen met IC₅₀ waarde gedetecteerd bij een concentratie van 10 M na 72 uur celbehandeling werd getoond. Onder gecombineerde actie van 16 μM C₆₀ fullereen en HL, de waarde van IC₅₀ werd gedetecteerd bij een lagere 5 μM HL-concentratie en bij een eerdere incubatieperiode van 48 uur, naast het cytotoxische effect van HL werd waargenomen bij een lage 2,5 μM-concentratie waarbij HL op zichzelf geen invloed had op de levensvatbaarheid van de cellen. Binding van C₆₀ fullereen en HL met een kleine DNA-groef met vorming van een stabiel complex wordt verondersteld een van de mogelijke redenen te zijn van hun synergetische remming van de proliferatie van CCRF-CЕM-cellen.

Toepassing van C₆₀ fullereen in combinatie met 2,5 μM HL bleek geen schadelijk effect te hebben op de structurele stabiliteit van het membraan van bloederytrocyten. Dus gecombineerde actie van C₆₀ fullereen en HL in een lage concentratie versterkten het cytotoxische effect van HL tegen menselijke leukemische cellen en werden niet gevolgd door hemolytisch effect.

Achtergrond

De vertegenwoordiger van koolstof nanostructuur C₆₀ Van fullereen is aangetoond dat het unieke fysisch-chemische eigenschappen en biologische activiteit bezit, niet alleen als antioxidant of fotosensibilisator, maar ook als modificator van het toxische effect van geneesmiddelen tegen kanker vanwege het vermogen om de cel binnen te dringen en als medicijndrager te functioneren [1,2,3,4 ]. C₆₀ molecuul kan interageren met chemotherapeutische geneesmiddelen zoals doxorubicine, cisplatine en paclitaxel en kan er complexen mee vormen die het therapeutische effect versterken [5,6,7,8].

Carbacylamidofosfaten (CAPh) zijn organische moleculen die de aandacht hebben getrokken vanwege de specifieke structuur, biologische activiteit en perspectieven van biomedische toepassing [9,10,11,12]. De aanwezigheid van peptide- en fosforamidegroepen gecombineerd in het fragment C(O)N(H)P(O) van het molecuul bepaalt de interactie met biologische moleculen en celmembranen. Variatie van substituenten in de buurt van fosforyl- en carbonylgroepen geeft de mogelijkheid om CAPh stereochemische en farmacologische eigenschappen te moduleren. In het bijzonder werd aangetoond dat verschillende CAPh-vertegenwoordigers antineoplastische activiteit bezitten [13, 14].

Onlangs hebben we bevestigd dat CAPh-representatief dimethyl-N-(benzoyl)-amidofosfaat gebruikt in millimolair concentratiebereik de levensvatbaarheid van leukemische L1210-cellen verminderde en dat het toxische effect ervan werd vergemakkelijkt door C₆₀ fullereen [15]. We hebben ook aangetoond dat de introductie van extra aromatische substituenten en elektronegatieve CCl₃ groep in de CAPh-structuur resulteerde in een verhoging van de toxiciteit ervan [16]. Er werd dus een significant toxisch effect van dimorfolido-N-trichlooracetylfosforamide aangetoond tegen menselijke leukemische cellen van verschillende oorsprong, maar de effectieve concentratie ervan was nog steeds hoog en er was geen verbetering van de toxiciteit na gecombineerde werking met C₆₀ fullereen werd waargenomen. Als voortzetting van deze onderzoeken hebben we een nieuwe vertegenwoordiger van CAPh-difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) gesynthetiseerd, die twee fenoxysubstituenten heeft in plaats van morfolidogroepen in de buurt van de fosforylgroep (figuur 1).

De structuur van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL)

Het doel van het onderzoek was om de biologische activiteit van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) alleen of in combinatie met C₆₀ te schatten fullereen met behulp van in silico-analyse van hun interactie met DNA en in vitro onderzoek van cytotoxische effecten tegen menselijke leukemische cellijn.

Methoden/experimenteel

Chemische stoffen

RPMI 1640 vloeibaar medium, foetaal runderserum (FBS), penicilline/streptomycine en L-gluthamine (Biochrom, Duitsland), dimethylsulfoxide (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Duitsland), MTT [3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., VS), HCl (Kharkivreachim, Oekraïne).

Karakterisatie van chemische verbinding

Om de oplosbaarheid te vergroten, hebben we het natriumzout van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) verkregen volgens de volgende reacties (Fig. 2).

Schema van de oplosbaarheid van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) in natriumzout

De trichloorfosfazotrichlooracetyloplossing (0,035 M) in 200 ml chloroform werd langzaam toegevoegd aan een goed geroerde natriumfenolaatsuspensie (0,106 M, 12,3 g) in 150 ml chloroform (Fig. 2; stap 1). De temperatuur van het mengsel mocht niet boven de 40-50 °C komen. Het roeren werd ongeveer 1 uur voortgezet en daarna werd de oplossing tot 70°C verwarmd en 20 minuten onder deze omstandigheden geroerd. Het resulterende product trifenoxyfosfazotrichlooracetyl werd afgedampt. Vervolgens werd 40 ml 1 M NaOH toegevoegd en 90 min onder terugvloeikoeling gekookt (Fig. 2; stap 2). Een resulterend mengsel werd ingedampt. Het vaste neerslag van natrium HL werd driemaal gewassen met diethylether en herkristalliseerd uit i -propanol als een wit kristallijn poeder (80% opbrengst). Kleurloze kristallen van NaL·3H₂ O geschikt voor röntgenanalyse werden verkregen door i -PrOH:H₂ O (9:1 v /v ) oplossing langzame verdamping. De verbinding is luchtstabiel, zeer oplosbaar in water en alcoholen. Smp. 215 °С.

HL werd geïdentificeerd door elementanalyse en IR- en NMR-spectroscopie:elementanalyses (C, H, N) werden uitgevoerd met behulp van de EL III Universal CHNOS-elementanalyser. IR-spectraalmetingen werden uitgevoerd voor monsters als KBr-pellets op een Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR-spectrometer met een resolutie van 2 cm^− 1 en opeenhopingen van 8 scans, die worden gecombineerd om willekeurige absorptie-artefacten in het spectrale bereik van 4000-400 cm^− 1 uit te middelen . ¹ H NMR-spectra in DMSO-d6-oplossingen werden opgenomen op een AVANCE 400Bruker NMR-spectrometer bij kamertemperatuur.

HL:IR (cm⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amide II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹ H-NMR (DMSO-d₆ ):7,05 (t, 2H, γ-CH₂ ); 7.205, 7.255 (dt, 8H, α- en β-CH₂ ).

Voor CCl₃ C(O)N(Na)P(O)(OC₆ H₅ )₂ de elementaire samenstelling werd bepaald, %:C 40,58, H 2,35, N 3,15; en berekend, %:C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Synthese en karakterisering van C₆₀ Fullereen

Een zeer stabiele waterige colloïdoplossing van C₆₀ fullereen (200 μM, zuiverheid> 99,5%, gemiddelde nanodeeltjesgrootte tot 50 nm) werd gesynthetiseerd in de Technische Universiteit van Ilmenau (Duitsland) zoals beschreven in [17, 18].

Сell Culture

De experimenten werden gedaan op humane acute T-cel leukemische CCRF-CM-cellijn. Cellijn werd gekocht van het Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Micro-organismen en celculturen:CCRF-CM (ACC 240). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 2 mM glutamine, met 25 cm² kolven bij 37 °C met 5% CO₂ in bevochtigde broedstoof.

Cellen in RPMI 1640-medium werden geïncubeerd met C₆₀ fullereen (16 M) of HL (2,5, 5 en 10 μM) afzonderlijk en samen gedurende 24, 48 en 72 uur. Celoverleving zonder toevoeging van HL of C₆₀ fullereen werd ontvangen als 100% (controlemonster bevatte 0,05 M DMSO).

Cell Viability (MTT) Assay

De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld door de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide]-reductietest [19]. Op aangegeven tijdstippen van incubatie, 100 μl aliquots (0,5 × 10⁴ cellen) werden in de Sarstedt-microplaten met 96 putjes (Nümbrecht, Duitsland) geplaatst, 10 μl MTT-oplossing (5 mg/ml in PBS) werd aan elk putje toegevoegd en de platen werden nog 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Het kweekmedium werd vervolgens vervangen door 100 μl DMSO; de vorming van diformazan werd bepaald door de absorptie bij 570 nm te meten met een microplaatlezer Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Zwitserland).

Dieren

De studie werd uitgevoerd op witte mannelijke ratten van de "Wistar" -lijn met een gewicht van 170 ± 5 g. De dieren werden onder standaardomstandigheden gehouden in het vivarium van het ESC "Institute of Biology and Medicine", Taras Shevchenko National University of Kiev. Dieren hadden vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale principes van de Europese Conventie voor de bescherming van gewervelde dieren onder toezicht van de Bio-Ethics Committee van de bovengenoemde instelling.

Schatting van de hemolyse van erytrocyten

Erytrocyten werden verkregen uit gehepariniseerd bloed van de "Wistar"-lijnrat en verdund in 0,85% NaCl-oplossing tot 0,700 o.u. bij 630 nm op de Scinco-spectrofotometer (Duitsland). Hemolyse van erytrocyten werd veroorzaakt door 0,001 N HCl. De kinetiek van hemolyse werd spectrofotometrisch gemeten (λ = 630 nm) elke 10 s gedurende 2 min. Het percentage gehemolyseerde erytrocyten werd berekend zoals weergegeven in [20]. Erytrocyten werden geïncubeerd in 0,85% NaCl-oplossing met C₆₀ fullereen (16 M) of HL (2,5 en 10 μM) afzonderlijk en samen gedurende 1 uur. Erytrocyten zonder toevoeging van HL of C₆₀ fullereen werd ontvangen als 100% (controlemonster bevatte 0,05 M DMSO).

In Silico-onderzoek

Het DNA-molecuul met dubbele helix werd gebruikt als een matrijs van PDB (Protein Data Bank)-base. De interactie van DNA-molecuul met HL afzonderlijk en in combinatie met C₆₀ fullereen is onderzocht. We hebben rekening gehouden met de volgende structuren van het DNA-molecuul:2MIW (CCATCGCTACC - intercalatie van verbinding in een kleine groef van DNA-helix), 1XRW (CCTCGTCC - intercalatie van verbinding in een kleine groef van DNA-helix) en 2M2C (GCCGCATGCTACGCG - binding van verbinding met grote en kleine groeven van DNA-helix). We hebben het algoritme van systematische docking (SDOCK+) toegepast, ingebouwd in het QXP-pakket (deze methode demonstreert alle mogelijke conformaties van de bestudeerde structuren met de minimale waarde van Root mean square deviatie (RMSD)) [21]. We genereerden 300 potentieel mogelijke complexen met DNA, waarvan de tien beste werden geselecteerd voor de volgende fase, met behulp van een scorefunctie, ingebouwd in het QXP-pakket [22].

De interacties van het DNA-molecuul met HL afzonderlijk en in combinatie met de C₆₀ fullereen werden gekenmerkt door de volgende parameters:(1) het aantal waterstofbruggen, (2) het gebied van contactoppervlakken van DNA en de bijbehorende structuur, (3) de afstand tussen het DNA en de gedockte structuur, en (4) de totale energie van de bindingsstructuur.

Om de stabiliteit van de complexen van chemische verbindingen met C₆₀ . te beoordelen fullereen hebben we de korte moleculaire dynamica (MD, 100 ps) uitgevoerd met behulp van de Gromacs-softwaretool [23] volgens een Nosé-Poincaré-Anderson-algoritme (NPA) [24, 25] op basis van het OPLS-AA-krachtveld [26, 27] .

De berekeningen werden uitgevoerd op de volgende parameters:temperatuur (in Kelvin) - 300; druk (in kilopascal) - 100; binding met het waterstofatoom of ligand werd beperkt door het algoritme [25].

Statistische analyse

De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD van meer dan vier onafhankelijke experimenten. Gemiddelde (M) en standaarddeviatie (SD) werden berekend voor elke groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van tweeweg-ANOVA gevolgd door post-Bonferroni-tests. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Gegevensverwerking en plotten werden uitgevoerd door IBM PC met behulp van gespecialiseerde toepassingen GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., VS).

Resultaten en discussies

In Silico-onderzoek

Interactie van HL met DNA

Er werd aangetoond dat HL in DNA kan intercaleren en een stabiel complex kan vormen wanneer het wordt gebonden in een kleine DNA-groef via AGC-GCTA-nucleotiden (figuur 3a). In dit geval is de stapelinteractie tussen de stikstofbase van A-nucleotide en HL-fenylgroep evenals elektrostatische interactie tussen CCl₃ groep en C-nucleotide werd gevormd. Na MD-simulatie bleken de RMSD-waarden voor dubbele DNA-helix en HL respectievelijk 3,3 en 1,62 te zijn. Nucleotide-omgeving van HL (GCA-CTA) was gedeeltelijk veranderd en stapelinteractie ging verloren, terwijl een waterstofbinding werd gevormd tussen G-nucleotide en CO-groep van HL.

Interactie van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) met DNA-molecuul:a , b binding met kleine en grote groeven; c intercalatie in een kleine groef. De gebruikte DNA-structuur uit de PDB-database:a , b —2M2C en c —1XRW

Binding van HL met een belangrijke DNA-groef vond plaats via TCG-AT-nucleotiden (figuur 3b). In dit geval werd een waterstofbinding tussen de CO-groep van HL en stikstofbase van A-nucleotide gevormd en vond stapelinteractie plaats tussen zowel HL-fenylen als stikstofbasen van C- en G-nucleotiden. Trouwens, een kans op elektrostatische binding tussen HL CCl₃ groep en stikstofbasen van AT-nucleotiden verschenen.

Na MD-simulatie werden geen veranderingen in de nucleotide-omgeving van HL gedetecteerd. De RMSD-waarden voor DNA en HL waren respectievelijk 2,77 en 1,58 Å. Hierdoor verdween de stapelinteractie tussen C-nucleotide en fenylgroep.

In het geval van HL-intercalatie in DNA, bestond de omgeving uit CG-CG-nucleotiden (figuur 3c). De stapelinteractie met CG-nucleotiden verscheen:de ene fenylgroep werd tussen de stikstofbasen geklemd en de andere vormde een stapelinteractie met C-nucleotide.

Na MD-simulatie waren de RMSD-waarden voor DNA-dubbele helix en HL respectievelijk 1,71 en 1,89 . De nucleotide-omgeving van HL was niet veranderd. Een van de fenylgroepen vormde een ion-π-interactie met de stikstofbase van G-nucleotide, die leek te zijn verschoven met 1,12 Å.

De verkregen energieparameters getuigden dat de energie van sterische botsingen tussen DNA en HL en binnen HL zelf onbeduidend was (tabel 1).

We hebben de vergelijkende analyse gedaan van energieparameters van HL-binding met kleine en grote DNA-groeven of de intercalatie ervan in kleine DNA-groef. Bumpwaarden bleken 6,2 kJ/mol te zijn in het geval van HL-intercalatie in DNA en 2,5 kJ/mol in het geval van binding met kleine en grote DNA-groeven (tabel 1). Int-waarden waren 8,7 kJ/mol in het geval van HL-intercalatie in DNA, 6,3 kJ/mol in het geval van binding met een grote DNA-groef en 3,6 kJ/mol in het geval van binding met een kleine DNA-groef. Deze gegevens toonden aan dat HL-binding met een kleine groef van DNA het meest stabiel was.

Gecombineerde interactie van HL en C₆₀ Fullereen met DNA

Eerder hebben we met behulp van computersimulatie aangetoond dat C₆₀ molecuul zou kunnen interageren met DNA en een stabiele C₆₀ . vormen +DNA-complex bij binding met DNA minor groove [15]. Zoals te zien is in Afb. 4, C₆₀ fullereen kan ook ion-π-bindingen vormen met CCl₃ groepen HL-molecuul.

Gecombineerde interactie van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) en C₆₀ fullereen met DNA (HL+C₆₀ of C₆₀ +HL-versies):a , b binding met kleine en grote groeven, c , d intercalatie in kleine en grote groeven. De gebruikte DNA-structuren van de PDB-database:a , b —2M2C, c —1XRW, en d —2MIW

We hebben twee versies van moleculaire modellering van HL gebruikt, C₆₀ fullereen en DNA-interactie, die werden voorgesteld in [16] en nuttig bleken te zijn voor de interpretatie van MD-simulatieresultaten. We hebben de 1XRW PDB-structuur van het DNA-molecuul gebruikt in de versie, toen aanvankelijk HL en vervolgens C₆₀ molecuul intercaleren in DNA (HL+C₆₀ ) en 2MIW PDB-structuur van DNA-molecuul - in de versie, toen aanvankelijk C₆₀ molecuul en vervolgens intercaleren HL in DNA (C₆₀ +HL).

De binding met een kleine DNA-groef in het geval van HL+C₆₀ versie vond plaats via GCTA-GCAT-nucleotiden (Fig. 4a). Fenylgroepen vulden een kleine groef en gingen stapelinteracties aan:één groep met C₆₀ fullereen en de andere met de stikstofbase van G-nucleotide. De elektrostatische interacties ontstonden tussen CCl₃ groep van HL en zowel de stikstofbase van G-nucleotide als C₆₀ fullereen.

Volgens MD-simulatieresultaten werd een dubbele DNA-helix in dit geval gekenmerkt door aanzienlijke mobiliteit (RMSD-waarde is 3,08 Å), RMSD-waarde voor HL was 2,04 Å, terwijl C₆₀ fullereen bleef vrijwel onbeweeglijk. Als resultaat is de nucleotide-omgeving van HL+C₆₀ structuur werd gewijzigd door TGC-GCATG. Bovendien, een waterstofbinding tussen de aminogroep van HL en DNA en stapelinteracties tussen de nucleotiden van stikstofhoudende GC-basen en C₆₀ fullereen verscheen.

De binding van HL+C₆₀ met een grote DNA-groef vond plaats via C-ATCC-nucleotiden (figuur 4b). Waterstofbindingen werden gevormd tussen de HL CO-groep en de stikstofbase van A-nucleotide. Fenylgroepen vulden een grote DNA-groef en gingen een stapelinteractie aan met C₆₀ fullereen.

Volgens MD-simulatieresultaten is de nucleotide-omgeving van HL+C₆₀ structuur is niet gewijzigd:de waarden van RMSD voor DNA en HL waren respectievelijk 3,14 en 2,24 Å, C₆₀ fullereen bleef vrijwel onbeweeglijk. In dit geval zijn alle interacties tussen HL en C₆₀ fullereen verdween en HL interageerde alleen sterisch met DNA. Er wordt verondersteld dat als resultaat C₆₀ zowel fullereen als HL zouden uit de grote DNA-groef worden geduwd.

Wanneer HL+C₆₀ werden geïntercaleerd in een kleine DNA-groef (Fig. 4c), de binding met CGT-GAG-nucleotiden vond plaats. C₆₀ fullereen bleek in een kleine DNA-groef te worden ingebouwd en er sterisch mee te interageren. HL-fenylgroepen vormden stapelinteracties met de stikstofbasen van CG-CG-nucleotiden. Volgens MD-simulatie waren de waarden van RMSD voor DNA en HL respectievelijk 2,29 en 2,13 Å, C₆₀ fullereen bleef vrijwel onbeweeglijk, en CC1₃ groep HL ging elektrostatische interactie aan met de stikstofbase van G-nucleotide.

In het geval van C₆₀ +HL-versie vond de binding met een kleine DNA-groef (Fig. 4d) plaats via CGC-GCC-nucleotiden. Een van de HL-fenylgroepen vormde een stapeling met C₆₀ fullereen en de andere met G-nucleotide. De CC1₃ groep van HL bleek een elektrostatische binding te vormen met de stikstofbase van C-nucleotide. Volgens MD-analyse waren de waarden van RMSD voor DNA en HL in dit geval respectievelijk 2,35 en 2,75 Å, C₆₀ fullereen bleef onbeweeglijk, en de nucleotide-omgeving van C₆₀ +HL-structuur werd gewijzigd door CGCT-GC. Bovendien is de C₆₀ molecuul drong dieper door in het DNA en vormde een stapelende interactie met de stikstofbase van C-nucleotide.

Volgens de berekende energieparameters werd het complex gevormd in het geval van C₆₀ +HL-intercalatie in een kleine DNA-groef was het meest rigide (de Bump-waarde 20,0 kJ/mol) (Tabel 1). In tegenstelling tot HL+C₆₀ interactie met DNA, deze parameter was slechts 6,2 kJ/mol wanneer HL+C₆₀ werd geïntercaleerd in een kleine DNA-groef, 7,8 kJ/mol wanneer het was gebonden met een kleine DNA-groef en 8,8 kJ/mol wanneer het was gebonden met een grote DNA-groef. Bovendien toonden de energieparameters aan dat vorming van sterke waterstofbruggen binnen HL+C₆₀ +DNA-complex was alleen mogelijk in het geval van binding met een grote DNA-groef, wanneer de waarde van Hbnd -2,3 kJ/mol was, bij andere soorten interactie gelijk aan nul of -1,0 kJ/mol (tabel 1). Bovendien, volgens MD resultaten in dit geval zowel C₆₀ fullereen en HL leken verdrongen te zijn uit een grote DNA-groef.

Daarom, C₆₀ +HL-binding met een kleine DNA-groef wordt gesuggereerd als de meest waarschijnlijke versie van C₆₀ fullereen, HL en DNA gecombineerde interactie.

In vitro onderzoek naar biologische effecten van HL

Levensvatbaarheid van CCRF-CЕM-cellen

In in vitro-experimenten werd de langetermijninvloed van difenyl-N (trichlooracetyl) -amidofosfaat (HL) in het bereik van 2, 5-10 μM op de levensvatbaarheid van menselijke leukemische CCRF-CЕM-cellen geschat met behulp van de MTT-test. Cellen werden 24, 48 en 72 uur geïncubeerd in RPMI 1640-medium met ofwel 16 μM C₆₀ fullereen of HL alleen of hun combinatie. Levensvatbaarheid van cellen die zijn geïncubeerd zonder C₆₀ of HL werd als 100% beschouwd.

Na 24 uur incubatie werd geen effect van HL op de levensvatbaarheid van CCRF-CЕM-cellen waargenomen (Fig. 5). Bij nog langere incubatie werd de cytotoxische activiteit van HL in een concentratie van 5 en 10 μM duidelijk, de levensvatbaarheid van de cellen na 48 uur werd geremd met respectievelijk 25 en 33% en bleef dalen na 72 uur.

Levensvatbaarheid van CCRF-CEM-cellen geïncubeerd met difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) in verschillende concentraties. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 vergeleken met controlecellen

Opgemerkt moet worden dat 50% afname van de levensvatbaarheid van CCRF-CЕM-cellen (IC₅₀ ) werd na 72 uur gedetecteerd onder invloed van HL in een concentratie van 10 μM (figuur 5). Onlangs hebben we aangetoond dat een andere CAPh-vertegenwoordiger dimorfolido-N-trichlooracetylfosforylamide een afname van 50% van de levensvatbaarheid van CCRF-CЕM-cellen veroorzaakte bij 72 uur in een concentratie van 1 mM [16]. De vergelijkende analyse van deze gegevens toont aan dat introductie van fenoxy in plaats van morfolidogroepen in de structuur van CAPh-derivaat het mogelijk maakte om de effectieve toxische concentratie tegen leukemische cellen met twee orden te verlagen. We nemen aan dat conformationele flexibiliteit van –P(O)(OC₆ H₅ ) kern zorgde voor een effectievere interactie van deze verbinding met DNA.

Geen invloed van C₆₀ fullereen dat alleen werd gebruikt voor de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de incubatieperiode werd gedetecteerd (gegevens niet gepresenteerd). Tegelijkertijd laten de resultaten in Fig. 6 zien dat C₆₀ fullereen versterkte HL-cytotoxische activiteit tegen CCRF-CЕM-cellen. Onder gecombineerde actie van C₆₀ fullereen en HL, werd een afname van 50% van de levensvatbaarheid van de cellen waargenomen bij een lagere HL-concentratie (5 M) en in een eerdere periode (48 uur) van incubatie dan onder de werking van HL alleen. Bovendien na 72 h gecombineerde actie van C₆₀ fullereen en HL, werd het cytotoxische effect van HL gedetecteerd in een lage 2,5 μM-concentratie waarbij HL op zichzelf geen invloed had op de levensvatbaarheid van de cellen (Fig. 6).

Levensvatbaarheid van CCRF-CEM-cellen geïncubeerd met difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) alleen of in combinatie met 16 μM C₆₀ fullereen. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 vergeleken met controlecellen; ^# p < 0,05 vergeleken met HL

Dus, C₆₀ Van fullereen werd aangetoond dat het de cytotoxische effecten van HL versterkt en de gevoeligheid van leukemische cellen voor de werking ervan in een lage concentratie significant verhoogt. Rekening houdend met het feit dat C₆₀ fullereen kan accumuleren in leukemische cellen gedurende 24 uur [28] en lokaliseren in intracellulaire compartimenten [29,30,31], met name in de kern [32, 33], de interactie met nucleair DNA van actief geprolifereerde kankercellen zou niet mogen worden uitgesloten.

De in vitro verkregen gegevens zijn dus in overeenstemming met de resultaten van in silico-onderzoek en tonen aan dat de initiële binding van C₆₀ molecuul en vervolgens van HL met een kleine DNA-groef met vorming van een stabiel complex zou een van de mogelijke redenen kunnen zijn van hun synergetische remming van de proliferatie van CCRF-CЕM-cellen.

Erytrocytenresistentie tegen hemolyse

Bij schatting van het antikankerpotentieel van HL en C₆₀ fullereen-combinatie, is het belangrijk om rekening te houden met de mogelijke effecten op niet-kwaadaardige cellen, in het bijzonder op bloedcellen.

Studie van de resistentie van erytrocyten tegen zure hemolyse maakt het mogelijk om de invloed van farmacologische agens op membraanniveau op te helderen. Dynamiek van hemolyse weerspiegelt de dynamiek van de verstoring van het plasmamembraan van erytrocyten en daarmee de stabiliteit van de structurele organisatie ervan. In Fig. 7 werd de afhankelijkheid van het percentage hemolyse-erytrocyten gedurende 1 uur geïncubeerd in NaCl-oplossing zonder toevoegingen (controle) en met HL of C₆₀ fullereen alleen of in combinatie. Geen invloed van 16 μM C₆₀ fullereen op erytrocyten hemolyse werd gedetecteerd (niet getoond). HL in 2,5 μM concentratie alleen of in combinatie met C₆₀ aangetaste erytrocyten weerstand tegen hemolyse (Fig. 7). Ondertussen werd onder invloed van HL in een concentratie van 10 M een versnelling van hemolyse met een maximum van 20 s gedetecteerd. Gecombineerde actie van 10 μM HL en C₆₀ fullereen werd gevolgd door verdere intensivering van de hemolyse met 60% van de gehemolyseerde erytrocyten na 20 s.

Erytrocyten resistentie tegen hemolyse in aanwezigheid van difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) afzonderlijk en in combinatie met 16 μM C₆₀ fullereen. (M ± m, n = 8)

Uit de verkregen gegevens bleek dat toepassing van C₆₀ fullereen in combinatie met 2,5 μM HL had geen schadelijk effect op de structurele stabiliteit van het membraan van de bloederytrocyten en liet tegelijkertijd toe om de cytotoxische activiteit van HL in deze lage concentratie tegen leukemische cellen aanzienlijk te verhogen. Ondanks het synergetische cytotoxische effect van C₆₀ fullereen en HL in een concentratie van 10 μM tegen leukemische cellen, bleek de toepassing van hun combinatie beperkt te zijn door intensivering van het hemolytische effect.

Ten slotte is het in de context van het bovenstaande in vitro-onderzoek belangrijk om te benadrukken dat een water/vast grensvlak beperkt water heeft dat ook zowel het transport als de thermodynamische eigenschappen van nanostructuren [34, 35] en hun interactie met celmembranen kan beïnvloeden. [36].

Er zijn literatuurgegevens over de intracellulaire lokalisatie van carbacylamidofosfatenderivaten, in het bijzonder de penetratie van fosforamidaten in de cellen. Zo kunnen fosforamidaatderivaten het membraan van MDA-231-borstkanker- en longkankercellijnen (H460, H383 en H2009) binnendringen [37]. Van nitrobenzylfosforamide-mosterds werd aangetoond dat ze door celmembranen dringen en gelokaliseerd zijn in mitochondriën van NTR⁺ zoogdiercellen [10]. Het is niet uitgesloten dat C₆₀ fullereen, dat het membraan van de kankercel kan binnendringen door passieve diffusie of endocytose [28, 30, 32] met accumulatie in de kern en mitochondriën [30, 32, 33], zou een transporter kunnen zijn van kleine antitumormoleculen [ 38,39,40].

Conclusies

Een nieuwe vertegenwoordiger van carbacylamidofosfatenderivaten met twee fenoxysubstituenten nabij de fosforylgroep difenyl-N-(trichlooracetyl)-amidofosfaat (HL) werd gesynthetiseerd en getest als een cytotoxisch middel zelf en in combinatie met C₆₀ fullereen. Volgens moleculaire simulatieresultaten, wanneer C₆₀ fullereen en vervolgens HL werden gebonden met een kleine DNA-groef, een rigide complex werd gevormd gestabiliseerd door stapelingsinteracties van HL-fenylgroepen met C₆₀ fullereen en DNA G-nucleotide, evenals door interacties van HL CCl₃ groeperen door ion-π bindingen met C₆₀ molecuul en door elektrostatische bindingen met DNA G-nucleotide.

Met behulp van de MTT-test hebben we de cytotoxische activiteit van HL aangetoond tegen menselijke leukemische CCRF-CM-cellen met IC₅₀ value detected at 10 μM concentration at 72 h of cells treatment. The cytotoxic effect of HL was facilitated by C₆₀ fullerene. Under combined action of 16 μM C₆₀ fullerene and HL, the value of IC₅₀ was detected at lower 5 μM HL concentration and at earlier 48 h period of incubation and besides the cytotoxic effect of HL was observed at a low 2.5 μM concentration at which HL by itself had no influence on cell viability.

Previously, we have shown a significant toxic effect of dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide against human leukemic cells of different origin, but its effective concentration was high and no enhancement of toxicity after combined action with C₆₀ fullerene was observed [16]. We assume that introduction of flexible of –P(O)(OC₆ H₅ ) groups instead of morfolido groups into CAPh derivative contributed to lowering of its toxic concentration against human leukemic cells ensuring its effective interaction with C₆₀ molecule and DNA. Binding of C₆₀ fullerene and HL with minor DNA groove with formation of a stable complex is assumed to be one of the possible reasons of their synergistic inhibition of CCRF-CЕM cells proliferation.

We have revealed that application of C₆₀ fullerene in combination with 2.5 μM HL had no harmful effect on structural stability of blood erythrocytes membrane, while combination of C₆₀ fullerene with 10 μM HL appeared to be limited by intensification of hemolytic effect.

Thus, C₆₀ fullerene was shown to potentiate cytotoxic effect of HL and to increase significantly human leukemic cells sensitivity to its action in a low concentration. A combination of C₆₀ fullerene with HL in a low concentration 2.5 μM may be promising for further biomedical studies.