MicroRNA-326-5p beschermt neuronen bij beroerte: onderdrukking van STAT3 vermindert apoptose en mitochondriale schade

Samenvatting

Studies hebben de rol van microRNA's (miRNA's) in cerebrale ischemie/herperfusieschade (CI/HS) uitgebreid onderzocht. Maar het specifieke mechanisme van miR-326-5p in CI/HS is nog onduidelijk. Daarom was deze studie bedoeld om het mechanisme van de miR-326-5p/signaaltransducer en activator van transcriptie-3 (STAT3) as in CI/HS te onthullen. Twee modellen (zuurstof- en glucose-deprivatie [OGD] in primaire rattencorticale neuronen en middenhersenarterie-occlusie [MCAO] in Sprague-Dawley ratten) werden ingesteld om CI/HS respectievelijk in vitro en in vivo na te bootsen. Verlies- en winst-van-functie assays werden uitgevoerd met OGD-behandelde neuronen en met MCAO ratten. Daarna werden levensvatbaarheid, apoptose, oxidatieve stress en mitochondriale membraanpotentieel in OGD-behandelde neuronen getest, evenals pathologische veranderingen, apoptose en mitochondriale membraanpotentieel in hersenweefsels van MCAO ratten. Mitofusine-2 (Mfn2), miR-326-5p en STAT3 expressie in OGD-behandelde neuronen en in hersenweefsels van MCAO ratten werden gedetecteerd. Mfn2 en miR-326-5p waren verlaagd, en STAT3 was verhoogd in OGD-behandelde neuronen en hersenweefsels van MCAO ratten. miR-326-5p targette en reguleerde STAT3 expressie negatief. Herstel van miR-326-5p of reductie van STAT3 versterkte levensvatbaarheid, remde apoptose en oxidatieve stress, verhoogde mitochondriale membraanpotentieel en verhoogde Mfn2 expressie in OGD-behandelde neuronen. Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 verlichtte pathologische veranderingen, remde apoptose en verhoogde mitochondriale membraanpotentieel en Mfn2 expressie in hersenweefsels van ratten met MCAO. Deze studie verduidelijkt dat up-gereguleerde miR-326-5p of down-gereguleerde STAT3 beschermt tegen CI/HS door Mfn2 expressie te verhogen.

Inleiding

Cerebrale ischemie/herperfusieschade (CI/HS) is een soort hersenschade gevolgd door ischemische beroerte [1]. Het meest kenmerkende kenmerk van cerebrale I/R is initiële transeunte cerebrale ischemie gevolgd door herperfusie [2]. CI/HS activeert neuronale apoptose en leidt tot hippocampus- en cortexschade [3]. Op dit moment is de meest voorkomende klinische toepassing trombolytisch voor CI/HS [4]. Echter, herperfusie zou de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) verhogen, leidend tot intracellulaire DNA-schade, oxidatieve stress-gerelateerde schade, proteïneoxidatie en lipideperoxidatie, wat de bloed-hersenbarrière en oedeem verder verergeren [5]. Daarom is de urgentie om nieuwe gerichte opties te zoeken de hoogste prioriteit voor CI/HS.

MicroRNA's (miRNA's) worden uitgebreid beschouwd als potentiële en prognostische rollen in CI/HS [6, 7]. Bijvoorbeeld, een artikel heeft aangetoond dat miR-202-5p neuronale schade en neurologische deficiten verlicht, evenals zuurstof- en glucose-deprivatie (OGD)-geïnduceerde celschade in middenhersenarterie-occlusie (MCAO) modelratten bij ischemische schade [8]. Daarnaast is gevonden dat up-regulatie van miR-98 neurologische uitkomsten verbetert in muizen met I/R beroerte [9] en overexpressie van miR-451 ischemische cerebrale apoptose verlicht in muizen met CI/HS [10]. Specifiek heeft miR-326-5p pro-angiogene capaciteit voor endotheliale progenitorcellen en kan de hartfunctie verbeteren na acute myocardinfarct [11]. Echter, de studie gericht op miR-326-5p in CI/HS is nog in de kinderschoenen. Signaaltransductors en transcriptieactivatoren (STAT) zijn een unieke familie van eiwritten die geactiveerd worden door CI/HS [12]. STAT3 werd voorspeld als een doelwit van miR-326-5p op de bio-informatica website; dus bestudeerden we de rol van miR-326-5p-gemedieerde STAT3 in CI/HS. STAT3 verergeren ischemische neuro-inflammatoire processen en secundaire hersenschade door het vrijmaken van pro-inflammatoire mediatoren [13, 14]. Specifiek speelt de Janus-geactiveerde kinase 2 (JAK2)/STAT3 pathway een functionele rol in het blokkeren van celdood geïnduceerd door CI/HS [15]. Mitofusine-2 (Mfn2) is een mitochondriale fusiefactor die kan beschermen tegen cardio-cerebrovasculaire I/HS [16] en hypoxie-geïnduceerde neuronale apoptose in ischemische hersenschade kan verlichten [17]. Het is ook vastgelegd dat Mfn2 een beschermend effect uitoefent op CI/HS [18].

Kortom, minder diepgaand onderzoek heeft de gecombineerde rol van miR-326-5p en STAT3 in CI/HS ontdekt. Gezien dit, is deze studie gestart met de hypothese dat miR-326-5p CI/HS verlicht via targeting van STAT3.

Materialen en methoden

Ethiekverklaring

De experimenten werden goedgekeurd door het Dierenverzorgings- en Gebruikscomité van het Geaffilieerde Ziekenhuis van Yangzhou Universiteit; Yangzhou Universiteit, en werd uitgevoerd conform de Richtlijn voor de Verzorging en Gebruik van Experimentele Ratten van het Geaffilieerde Ziekenhuis van Yangzhou Universiteit; Yangzhou Universiteit.

Experimentele dieren

Volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (6–8 weken oud, 250 ± 30 g) van het Centrum voor Vergelijkende Geneeskunde, Yangzhou Universiteit (Yangzhou, China), werden gehuisvest in een specifieke pathogen-vrije omgeving met vrije toegang tot voedsel en water, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% vochtigheid en 12-uurs licht/donker cyclus.

Celisolatie en identificatie

De ratten werden gedood door decapitatie, en hun hersenen werden in 1 mm³ gesneden om celsuspensies te configureren, die gemengd werden met 0,4% tryphaan blauw oplossing bij 9:1 (de eindconcentratie van tryphaan blauw was 0,04%) en de celdichtheid en overlevingspercentage werden berekend door een hemocytometer. De cellen (1 × 10⁶ cellen/mL) wurden gezaaid in een celkweekflesje vooraf gecoat met L-polylysin (0,1 mg/mL) bij 5 × 10⁶ cellen per flesje. Wanneer de cellen aan de wanden gehecht waren, werden geïncludeerd met het vernieuwde medium (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) en continu gekweekt gedurende 6–7 d met het medium elke 2–3 d half vernieuwd.

Celidentificatie: Rattencorticale neuronen werden gebruikt om neuronen-slides te prepareren die geïncludeerd werden met de primaire konijnen anti-rat Nestin (NES) polyclonale antilichaam (1:200), evenals de fluoresceïne isothiocyanate (FITC)-gelabelde geit anti-konijn immunoglobuline G (1:50, beide van Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Daarna werden de cellen afgedicht met een anti-fluorescent quencher en waargenomen door een fluorescentiemicroscopie.

OGD-modelopstelling

Neuronen werden gekweekt in een glucose-vrije Earle's oplossing en blootgesteld aan een menggas van 95% N₂ en 5% CO₂. Na 30 min positieve drukventilatie werd een hypoxische omgeving gevormd waarin de cellen geïncludeerd werden (ischemiesimulatie door OGD in vitro). Na 90 min incubatie werden de cellen geïncludeerd met het onderhoudscelmedium nadat de glucose-vrije Earle's oplossing was verwijderd. De cellen werden routinematig gekweekt voor opeenvolgende experimenten (herperfusiesimulatie door zuurstof-glucose herperfusie in vitro). Het normale medium onder normoxie diende als controle.

Neuronen werden verdeeld in de controlegroep; de OGD-groep, de negatieve controle (NC) groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met gescrambelde oligonucleotide), de miR-326-5p agomir groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met miR-326-5p agomir), de sh-STAT3 groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met STAT3 shRNA) en de miR-326-5p agomir + overexpressie (oe)-STAT3 groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met miR-326-5p agomir en pcDNA-STAT3 vector). Oligonucleotiden en vectoren werden allemaal geleverd door GenePharma (Shanghai, China).

Met behulp van lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), werden gescrambelde oligonucleotide, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA of miR-326-5p agomir en pcDNA-STAT3 getransfecteerd in primaire rattenneuronen en de transfector-efficiëntie getest door reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) of Western blot na 48 uur.

3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Difenyltetrazolium Bromide (MTT) Assay

Neuronen werden gemaakt tot een suspensie bij 1 × 10⁶ cellen/mL en gekweekt voor 0, 24 en 48 uur, respectievelijk. In een steriele omgeving werden neuronen geïncludeerd gedurende 2–4 uur in 10% MTT-oplossing en 150 μL Formazanoplossing (Dimethylsulfoxide) toegevoegd tot de kristal voldoende was opgelost. De optische dichtheid (OD) waarde werd gemeten op een microplaatlezer bij 570 nm.

Stroomcytometrie Apoptose Assay

Neuronen werden losgemaakt met 0,25% trypsine, gecentrifugeerd bij 2000 rpm en heropgelost in PBS. Vervolgens werden neuronen gecentrifugeerd bij 2000 rpm, en het pellet werd heropgelost door bindingsbuffer en achtereenvolgens geïncludeerd met 5 μL Annexine V-FITC en 5 μL propidium iodide (PI). Een stroomcytometer werd toegepast om de apoptosegraad te detecteren.

JC-1 Mitochondriale Membraanpotentieel Detectie

Cellen in de 6-puttenplaat werden afgespoeld met PBS, toegevoegd met 1 mL celkweekmedium en 1 mL JC-1 kleurwerkoplossing (50 μL JC-1, 8 mL ultrazuiver water en 2 mL JC-1 kleurb buffer) (SolarbioScience, Beijing, China) en geïncludeerd gedurende 15 min. De 1 × JC-1 kleurbuffer werd geconfigureerd door 4 mL gedestilleerd water en 1 mL JC-1 kleurbuffer. Na incubatie werden cellen trypsinisatie, heropgelost in JC-1 buffer, en getest op een stroomcytometer. De relatieve verhouding van groene fluorescentie werd berekend.

Oxidatieve Stress Detectie

Intracellulaire ROS-niveaus werden gemeten door 2,7-dichlorofluoresceïne diacetaat (DCF-DA) Detectie Kit (Abcam). Kortweg, neuronen werden losgemaakt met 0,25% trypsine, heropgelost en geïncludeerd met 10 µm DCF-DA gedurende 30 min. Daarna werd DCF fluorescentie met excitatie/emissie licht bij 495 nm/529 nm gemeten door fluorescentiespectroscopie (BD Biosciences).

Detectie van intracellulaire malondialdehyde (MDA), glutathion (GSH) inhoud en superoxidedismutase (SOD) activiteit werd gedetecteerd door chemische colorimetrie met behulp van commerciële assay kits (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China). OD waarde werd gemeten door een microplaatlezer.

Rattenmodel Opstelling

Ratten werden geanestheseerd door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (50 µg/kg). Een middenincisie werd gemaakt op de hals, de externe halsslagader werd afgebonden, en de gemeenschappelijke halsslagader werd geblokkeerd met een arteriële klem. Een 3–0 silicone-gecoate monofilament nylon naald werd zorgvuldig in de interne halsslagader ingebracht tot lichte weerstand. Na 90 min transeunte cerebrale ischemie, werd de naald teruggetrokken, en herperfusie uitgevoerd voor nog eens 24 uur. De sham-groep ontving dezelfde behandeling, behalve dat de naald niet de interne halsslagader binnenkwam. Tijdens de operatie werd een thermostatische bed gebruikt om de rektale temperatuur te handhaven op 37 ± 0,5 °C [19].

Ratten werden toegewezen aan 6 groepen (n = 6) en geïnjecteerd met plasmid of miR in de laterale cerebroventrikel vóór de opstelling van MCAO-modellen, inclusief de sham-groep, de MCAO-groep (gemodelleerde ratten), de NC-groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventrikel injectie van 5 µL gescrambelde oligonucleotide [100 µM]), de miR-326-5p agomir groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventrikel injectie van 5 µL miR-326-5p agomir [100 µM]), de sh-STAT3 groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventrikel injectie van 5 µL STAT3 interferentie vector [100 µM]) en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventrikel injectie van 5 µL miR-326-5p agomir [100 µM] en 5 µL STAT3 overexpressie vector [100 µM]) [20, 21].

Monsterverzameling

Ratten werden gedood door anesthesie, de harten werden geperfuseerd, en de gehele hersenen verkregen. De beschadigde hersenweefsels werden in 1 × 1 × 1 mm³ weefselmassa's gesneden voor paraffine coupes preparatie, RT-qPCR, western blot analyse en mitochondriale membraanpotentieel detectie.

Detectie van Mitochondriale Membraanpotentieel in Cerebrale Cortex

Cerebrale cortex van SD ratten werd gescheiden en in 1 mm³ gesneden. De weefselblokken werden op een 300 mesh nylon net geplaatst en toegevoegd met PBS. Vervolgens werd de celsuspensie gecentrifugeerd bij 1000 r/min, toegevoegd met 70% ethanol en gecentrifugeerd bij 1000 r/min opnieuw. Daarna werd het monster heropgelost in 1 mL PBS, en de suspensie (1 × 10⁶ cellen, 100 µL) werd gereageerd met Rhodamine123 kleurstofoplossing (10 µL, 5 µg/mL) en geanalyseerd op een stroomcytometer bij 488 nm.

HE Kleuring

Het rattenhersenweefsel werd gedompeld in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, en paraffine coupes werden geprepareerd, in 4 µm gesneden, verspreid in 40 °C water en gebakken bij 60 °C. Routinematig ontwas en gehydrateerd, werden de paraffine coupes gekleurd door HE kleurstofoplossing. Na HE kleuring vertoonden de beschadigde neuronen krimp van de kern, cellulaire oedeem, vacuolisatie en verduisterde kernen. De lichtmicroscoop (Nikon, Japan) werd gebruikt om het beeld te verkrijgen, en het aantal overlevende neuronen (mm²) van de ischemische cortex geteld.

TUNEL Kleuring

De paraffine coupes werden ontwas en gedeshydrateerd met 100%, 95%, 80% en 70% alcohol. Vervolgens werden de coupes gedompeld in 4% paraformaldehyde wat gevolgd werd door incubatie met 0,1% Triton X-100 natriumcitraatbuffer gedurende 20 min en TUNEL reactiemengsel gedurende 1–1,5 uur. Vervolgens werden de coupes ontwikkeld door peroxidaseoplossing en diaminobenzidine (DAB), tegengekleurd door hematoxyline, gedeshydrateerd door gradient alcohol, gepermeabiliseerd, en geseald in neutrale gom. De coupes werden waargenomen onder een lichtmicroscoop om TUNEL-positieve cellen te tellen. Bruin-gele deeltjes in de kern werden gedefinieerd als TUNEL-positieve cellen (apoptotische cellen).

Immunohistochemie

De coupes werden ontwas, gehydrateerd en opgehaald door citraatantigeen, en de endogene katalase werd geblokkeerd door 3% H₂O₂. Elke coupe werd toegevoegd met geitenzuurum (50 µL), geïncludeerd met de primaire antilichaam (50 µL) en gereageerd met de secundaire antilichaam (50 µL) en perioxidase-gelabelde streptavidine (50 µL). De coupes werden ontwikkeld door DAB en tegengekleurd door hematoxyline, wat gevolgd werd door gradient alcohol dehydratie, xyleen permeabilisatie en neutrale gom verzegeling. De coupes werden waargenomen door een microscoop (cytoplasma of kern van ischemische hersenweefsels was geel of bruin-gele deeltjes). OD waarden werden gemeten en gemiddeld.

RT-qPCR

Totale RNA extractie uit weefsels en cellen werd uitgevoerd door Trizol (Invitrogen). mRNA expressie werd geanalyseerd door qPCR met behulp van SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) en QuantStudio TM 6Flex real-time PCR systeem (Applied Biosystems). Specifieke stam-lus reverse transcriptie primers en forward/reverse primers (BioTNT, Shanghai, China) werden ontworpen om miRNA niveaus te analyseren. Tabel 1 liet alle primers zien. De 2^−ΔΔCT methode werd toegepast om miRNA of mRNA niveaus te berekenen.

Western Blot Analyse

De eiwitsamples werden gescheiden door 10% natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese en geëlectroblot op een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan. Daarna werd het PVDF membraan geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in Tris-bevattend zout, geprobed met de primaire antilichamen en opnieuw geprobed met de secundaire antilichaam gedurende 2 uur. Vervolgens werden de eiwitbanden geanalyseerd met alkalische fosfataat buffer bevattende nitroblauw tetrazolium chloride en 5-broom-4-chloro-3-indolyl fosfaat en gekwantificeerd door ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). De hoofdeiwitten waren STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

De STAT3 3′UTR bevattende miR-326-5p wild-type (WT) of mutante (Mut) bindingsplaatsen werd gekloond in pmirGLO vector (Promega, WI, USA), genaamd als STAT3-WT en STAT3-Mut. Cellen werden gezaaid in een 24-puttenplaat bij 2 × 10⁴ cellen/put en co-getransfecteerd met 100 ng van STAT3-WT of STAT3-Mut luciferase vector en 50 nM miR-326-5p agomir of het agomir NC bij 70% confluente. Luciferase activiteit werd gemeten met behulp van het Dual-Luciferase Reporter Assay Systeem (Promega Corporation, WI, USA).

Statistische Analyse

SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) statistische software werd gebruikt voor data-analyse. De data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Het verschil tussen twee groepen werd geanalyseerd door Student's t-toets, terwijl meervoudige vergelijkingen geanalyseerd werden door eénrichtings variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's post-hoc toets. P vertegenwoordigde twee-zijdige toets, en P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 verlicht apoptose van OGD-behandelde corticale neuronen

Na een week kweken, waren de rattencorticale neuronen gedifferentieerd en gerijpt. Microscopisch vertoonden de neuronen grotere neuronale lichamen, meer transparant cytoplasma, grote kern met lage dichtheid, en sterke brekingsindex. De neuronale lichamen waren kegelvormig of rond, en de dendrites waren gestaggerd en gehecht aan wanden (Fig. 1a, b). NES was een specifieke chemische marker van cerebrale neuronen om neuronen met hoge specificiteit te lokaliseren door immunofluorescentie-assay. Neuronen vonden specifiek binding aan NES en vertoonden groene fluorescentie (Fig. 1c).

MTT assay werd toegepast om corticaneuron levensvatbaarheid te detecteren (Fig. 1d). De resultaten toonden aan dat rattencorticale neuron levensvatbaarheid was aangetast in de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep vergeleken met de controlegroep en de miR-326-5p agomir groep, maar verbeterd in de miR-326-5p agomir groep en sh-STAT3 groep vergeleken met de NC-groep (alle P < 0,05).

Rattencorticale neuron apoptose werd bepaald door stroomcytometrie, terwijl Bcl-2 en Bax mRNA expressie door RT-qPCR (Fig. 1e–g). De resultaten verklaarden dat in vergelijking met de controlegroep en de miR-326-5p agomir groep, de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep verhoogde apoptosegraad, verlaagde Bcl-2 expressie en verhoogde Bax expressie vertoonden (alle P < 0,05). Met de NC-groepen in vergelijking, was de apoptosegraad verlaagd, Bcl-2 niveau verhoogd en Bax niveau onderdrukt in de miR-326-5p agomir groep en de sh-STAT3 groep (alle P < 0,05).

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 verhoogt Mfn2 en mitochondriale membraanpotentieel in corticaneuronen na OGD-schade

Mfn2 expressie in OGD-behandelde corticaneuronen werd gedetecteerd door western blot analyse (Fig. 2a, b). Met betrekking tot de controlegroep en de miR-326-5p agomir groep, verminderde Mfn2 eiwitexpressie in de OGD-groep en miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep, terwijl toegenomen in de miR-326-5p agomir groep en sh-STAT3 groep vergeleken met de NC-groep (alle P < 0,05).

Mitochondriale membraanpotentieel gedetecteerd door JC-1 werd gevonden dat (Fig. 2c, d) met betrekking tot de controlegroep en miR-326-5p agomir groep, het mitochondriale membraanpotentieel niveau daalde in de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep (alle P < 0,05). Relatief tot de NC-groepen, steeg het mitochondriale membraanpotentieel niveau in de miR-326-5p agomir groep en sh-STAT3 groep (alle P < 0,05).

ROS en MDA inhoud, en GSH en SOD activiteiten in OGD-behandelde corticaneuronen werden bepaald en de resultaten gaven aan dat vergeleken met de controlegroep en de miR-326-5p agomir groep, de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep verhoogde ROS en MDA inhoud en verstoorde GSH en SOD activiteiten vertoonden (alle P < 0,05). In vergelijking met de NC-groepen, vertoonden de miR-326-5p agomir groep en sh-STAT3 groep verlaagde ROS en MDA inhoud en versterkte GSH en SOD activiteiten (alle P < 0,05) (Fig. 2e–g).

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 belemmert pathologische schade van corticaneuronen en remt apoptose in ratten met CI/HS

HE kleuring werd toegepast om de pathologische schade van hersenweefsels te observeren (Fig. 3a, b), wat toonde dat in de sham-groep, de neuronen normaal in structuur en netjes gerangschikt waren met bleekrode cytoplasma, blauwe kern en duidelijke nucleolus. In de MCAO-groep, de NC-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep, behalve necrose, werd waargenomen dat neuronen onordelijk gerangschikt en donkerder gekleurd waren, met kernmembraanruptuur, celstructuur verdwijning, karyopyknose, diep gekleurde kern en lyse in grote hoeveelheid. In de miR-326-5p agomir groep en de sh-STAT3 groep, was neuronen zwelling verlicht en neuronen waren ordelijk gerangschikt, en de necrotische cellen waren verminderd, wat een betere status aangeeft in relatie tot de MCAO-groep en de NC-groep.

TUNEL kleuring werd gebruikt voor detectie van neuronale apoptose en RT-qPCR voor Bcl-2 en Bax mRNA expressie in hersenweefsels. De resultaten toonden aan dat (Fig. 3c–e) in vergelijking met de sham-groep en de miR-326-5p agomir groep, het TUNEL-positieve percentage toegenomen, Bcl-2 mRNA expressie afgenomen en Bax mRNA expressie toegenomen in de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep (alle P < 0,05). Lager TUNEL-positief percentage en Bax mRNA expressie, en hogere Bcl-2 mRNA expressie vertoonden in de miR-326-5p agomir en de sh-STAT3 groep dan de NC-groep (alle P < 0,05).

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 verhoogt mitochondriale membraanpotentieel in hersenweefsels in ratten met CI/HS

Mfn2 eiwitexpressie detectie in rattenhersenweefsel werd uitgevoerd door immunohistochemie, en de resultaten toonden aan dat (Fig. 4a, b) lagere Mfn2 eiwitexpressie getest werd in de sham-groep en de miR-326-5p agomir groep vergeleken met de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep, terwijl hogere Mfn2 eiwitexpressie gemeten werd in de miR-326-5p agomir groep en de sh-STAT3 groep in plaats van de NC-groep (alle P < 0,05).

Detectie van mitochondriale membraanpotentieel niveau ontdekte dat (Fig. 4c) in vergelijking met de sham-groep en de miR-326-5p agomir groep, mitochondriale membraanpotentieel niveau daalde in de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep, terwijl het steeg in de miR-326-5p agomir groep en de sh-STAT3 groep in contrast met de NC-groep (alle P < 0,05).

miR-326-5p targetteert STAT3

miR-326-5p en STAT3 expressie in corticaneuronen en hersenweefsels werden gedetecteerd door RT-qPCR en western blot analyse. In corticaneuronen in vitro, werd een afname gesuggereerd in de miR-326-5p expressie en een toename in de STAT3 expressie in de OGD-groep relatief tot de controlegroep (beide P < 0,05). Met betrekking tot de NC-groep, steeg miR-326-5p expressie en daalde STAT3 expressie in de miR-326-5p agomir groep (beide P < 0,05); STAT3 expressie daalde (P < 0,05) in de sh-STAT3 groep. In contrast met de miR-326-5p agomir groep, werd STAT3 expressie verhoogd in de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep (P < 0,05) (Fig. 5a–c).

In hersenweefsels in vivo, in relatie tot de sham-groep, lagere miR-326-5p en hogere STAT3 verschenen in de MCAO-groep (beide P < 0,05). Relatief tot de NC-groep, steeg miR-326-5p expressie terwijl STAT3 expressie daalde in de miR-326-5p agomir groep (beide P < 0,05). STAT3 expressie daalde in de sh-STAT3 groep (P < 0,05). Met de miR-326-5p agomir groep in contrast, steeg STAT3 expressie in de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep (P < 0,05) (Fig. 5d–f).

De potentiële miR-326-5p targetplaatsen op STAT3 3′UTR werden gevonden door DIANA en miRDB software (Fig. 5g). STAT3 3′UTR bevattende de WT miR-326-5p bindingsplaats en Mut bindingsplaats werden geconstrueerd en in de pmirGLO plasmid ingebracht. De binding van miR-326-5p aan STAT3 3′UTR werd verder gevalideerd door luciferase reporter assay. Luciferase reporter assay onthulde dat miR-326-5p agomir de relatieve luciferase activiteit van STAT3-WT verlaagde, maar niet STAT3-Mut (Fig. 5h), wat impliceert dat STAT3 een direct doelgen was van miR-326-5p.

Discussie

CI/HS is de leidende oorzaak van cerebrovasculaire sterfte [22]. miRNA's worden aangegeven als betrokken bij CI/HS [23]. Echter, het begrip van miR-326-5p-gerelateerd mechanisme is nog onvoldoende in CI/HS. Dus is deze studie gericht om de concrete rollen van miR-326-5p in CI/HS te ontdekken met de nadruk op de gecombineerde wederkerigheid van miR-326-5p en STAT3. Productief heeft deze studie verklaard dat up-regulatie van miR-326-5p CI/HS verlichtte en Mfn2 expressie verhoogde via STAT3-inhibitie.

In het begin werd miR-326-5p expressie bepaald om te dalen in CI/HS in vivo en in vitro. Vervolgens rangschikten we een reeks assays en vonden dat up-regulatie van miR-326-5p neuronale levensvatbaarheid en mitochondriale functie verbeterde, Mfn2 expressie verhoogde en oxidatieve stress en apoptose remde. Verder verifieerden in vivo experimenten in ratten de functionele rollen van herstelde miR-326-5p in CI/HS. Als kwestie van feit, is hoog miR-326 bewijzen te correleren met lange algehele overleving van patiënten met glioblastoma, de meest voorkomende hersentumor [24]. Ook is miR-326 expressie verder bewezen om te dalen in de ziekte van Parkinson en miR-326 kon apoptose van dopaminerge neuronen onderdrukken en inflammatoire reactie verminderen [25]. Behalve dat, is de reductie in miR-326-5p ge manifesterd in endotheliale progenitorcellen in het verloop van myocardinfarct, en introductie van endotheliale progenitorcellen overexpresserend kon de herstel van de hartfunctie bevorderen [11]. Er is een studie die illustreert dat up-regulatie van miR-326 het gedragsfunctie verbetert, neuronale levensvatbaarheid verhoogt en neuronale apoptose onderdrukt in muizen met de ziekte van Alzheimer [26]. Verder is gedocumenteerd dat up-regulatie van miR-326 door miR-326 mimic kon inducerbare nitrique oxide synthase in dopaminerge neuronen in de ziekte van Parkinson onderdrukken [27].

In deze studie vonden we dat STAT3 een doelgen was van miR-326-5p. Ondersteund door een gevorderde studie, wordt aangegeven dat STAT3 expressie negatief gereguleerd wordt door miR-326 in humane endometriumcarcinoom stamcellen [28]. In de huidige studie maatten we dat STAT3 expressie was verhoogd in CI/HS. Op dit moment is gevonden dat I/R schade en OGD zou STAT3 expressie induceren om te stijgen [29]. Intrigerend, STAT3 mRNA expressie neigt naar een toename in I/R dieren [30]. Daarnaast wordt gerapporteerd dat STAT3 eiwitexpressie up-gereguleerd is in CI/HS [31]. Vervolgens onthulde onze studie dat down-regulatie van STAT3 therapeutische effecten had op CI/HS ratten en OGD-behandelde neuronen. Ondersteund door een studie, wordt geconcludeerd dat miR-326 inductie oxidatieve stress ontmoedigt door inactivatie van JAK/STAT3 pathway in ischemische beroerte [32]. Ook is inhibitie van JAK2/STAT3 pathway gunstig voor oxidatieve stressbelemmering in CI/HS [31]. Verder is knockdown van JAK/STAT3 pathway geïdentificeerd om cel levensvatbaarheid te verbeteren, en oxidatieve stress en neuronale apoptose te verminderen in ischemische hersenschade [33]. Onlangs werd geïnhibeerde JAK/STAT3 signaleringspathway getuigen om myocardinfarct te verlichten in myocardiale I/R schade [34]. Zoals gedemonstreerd, ondermijnt uitgedunde STAT3 neuronale apoptose in ratten met witmaterieschade [35]. Bovendien worden de onderdrukking van neuronale apoptose, en verlichting van cerebrale infarctgrootte toegeschreven aan JAK2/STAT3 inhibitie in ratten met CI/HS [36].

Ten slotte focusden we op de effecten van miR-326-5p en STAT3 op Mfn2 expressie en ontdekten dat het verlaagde niveau Mfn2 in ratten met CI/HS en OGD-behandelde neuronen kon worden verhoogd door het herstellen van miR-326-5p of het dempen van STAT3. Geïmpliceerd door een eerdere studie, is gedocumenteerd dat Mfn2 afneemt in de late fase van herperfusie en slecht geëxprimeerd Mfn2 verergerd CI/HS via geremde autofagosomvorming en autofagosom en lysosoom fusie [18]. Bovendien wordt Mfn2 geïmpliceerd om te reduceren zelfs te verdwijnen in I/R schade in oude hepatocyten [37]. Echter, weinig onderzoeken hebben het regulerende mechanisme van miR-326-5p en STAT3 voor Mfn2 besproken.

Conclusie

In het algemeen heeft deze studie de mechanismen verduidelijkt dat verhoogde miR-326-5p neuronale apoptose remt, pathologische schade van neuronen verlicht en de expressie van Mfn2 verhoogt via STAT3-downregulatie in CI/HS. De studie kan het potentiële mechanisme van miR-326-5p en STAT3 in CI/HS bijwerken. Echter, meer studies zijn nog nodig voor verdere ontwikkeling van het moleculaire mechanisme in CI/HS.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

miRNAs:

MicroRNA's

STAT3:

Signaaltransducer en activator van transcriptie-3

OGD:

Zuurstof- en glucose-deprivatie

MCAO:

Middenhersenarterie-occlusie

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

STAT:

Signaaltransductors en transcriptieactivatoren

Mfn2:

Mitofusine-2

FITC:

Fluoresceïne isothiocyanate

NES:

Nestin

NC:

Negatieve controle

Oe:

Overexpressie

RT-qPCR:

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie

OD:

Optische dichtheid

PI:

Propidium iodide

MDA:

Malondialdehyde

GSH:

Glutathion

SOD:

Superoxidedismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF:

Polyvinylidene fluoride

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

SD:

Standaarddeviatie

ANOVA:

Eénrichtings variantieanalyse