Hersteld microRNA-326-5p remt neuronale apoptose en vermindert mitochondriale schade door STAT3 te onderdrukken bij cerebrale ischemie/reperfusieletsel

Materialen en methoden

Ethische verklaring

De experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van het Affiliated Hospital van de Yangzhou University; Yangzhou University, en het werd uitgevoerd met de Guide to the Care and Use of Experimental Rats of Affiliated Hospital of Yangzhou University; Universiteit van Yangzhou.

Experimentele dieren

Mannelijke volwassen Sprague-Dawley-ratten (6-8 weken oud, 250 ±   30 g) van het Center of Comparative Medicine, Yangzhou University (Yangzhou, China), werden gehouden in een specifieke pathogeenvrije omgeving met vrije toegang tot voedsel en water, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% vochtigheid en 12-uur licht/donker cyclus.

Celisolatie en identificatie

De ratten werden geëuthanaseerd door onthoofding en hun hersenen werden in 1 mm ³ gesneden om celsuspensies te configureren, die werden gemengd met 0,4% trypaanblauw-oplossing bij 9:1 (de uiteindelijke concentratie van trypaanblauw was 0,04%) en de celdichtheid en overlevingspercentage werden berekend met een hemocytometer. De cellen (1 × 10 ⁶ cellen/ml) werden gezaaid in een celkweekkolf die vooraf was gecoat met L-polylysine (0,1 mg/ml) bij 5 × 10 ⁶ cellen per fles. Toen de cellen aan de wanden hechtten, werden ze geïncubeerd met het vernieuwde medium (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) en continu 6-7 dagen gekweekt, waarbij het medium elke 2-3 dagen werd gehalveerd.

Celidentificatie:Corticale neuronen van ratten werden gebruikt om neuron-glaasjes te bereiden die werden geïncubeerd met het primaire konijnen-anti-rat Nestin (NES) polyklonale antilichaam (1:200), evenals het met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabelde geit-anti-konijn-immunoglobuline G (1:50, beide van Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS). Daarna werden de cellen afgesloten met een anti-fluorescentiedover en geobserveerd met een fluorescentiemicroscopie.

Oprichting OGD-model

Neuronen werden gekweekt in een glucosevrije Earle-oplossing en blootgesteld aan een gemengd gas van 95% N₂ en 5% CO₂ . Na 30 minuten positieve drukventilatie werd een hypoxische omgeving gevormd waarin de cellen werden geïncubeerd (ischemiesimulatie door OGD in vitro). Na 90 minuten incubatie werden de cellen geïncubeerd met het onderhoudscelmedium nadat de glucosevrije Earle-oplossing was verwijderd. De cellen werden routinematig gekweekt voor daaropvolgende experimenten (reperfusiesimulatie door zuurstof-glucose-reperfusie in vitro). Het normale medium onder normoxia diende als controle.

Neuronen werden verdeeld in de controlegroep; de OGD-groep, de negatieve controlegroep (NC) (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met gecodeerde oligonucleotiden), de miR-326-5p agomir-groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met miR-326-5p agomir), de sh-STAT3-groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met STAT3-shRNA) en de miR-326-5p agomir + overexpressie (oe)-STAT3-groep (OGD-behandelde neuronen getransfecteerd met miR-326-5p agomir en pcDNA-STAT3-vector). Oligonucleotiden en vectoren werden allemaal geleverd door GenePharma (Shanghai, China).

Met behulp van lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific) werden gecodeerde oligonucleotiden, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA of miR-326-5p agomir en pcDNA-STAT3 getransfecteerd in primaire rattenneuronen en de transfectie-efficiëntie werd getest door kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-qPCR) of Western-blot na 48 uur.

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay

Neuronen werden tot een suspensie gemaakt bij 1 × 10 ⁶ cellen/mL en gekweekt voor respectievelijk 0, 24 en 48 uur. In een steriele omgeving werden neuronen 2-4 uur geïncubeerd in 10% MTT-oplossing en toegevoegd met 150 μL opgeloste Formanzan-oplossing (dimethylsulfoxide) totdat het kristal voldoende was opgelost. De waarde van de optische dichtheid (OD) werd gemeten op een microplaatlezer bij 570 nm.

Flowcytometrie-apoptose-assay

Neuronen werden losgemaakt met 0,25% trypsine, gecentrifugeerd bij 2000 rpm en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Vervolgens werden neuronen gecentrifugeerd bij 2000 rpm en werd de pellet opnieuw gesuspendeerd door bindingsbuffer en achtereenvolgens geïncubeerd met 5 L Annexine V-FITC en 5 μL propidiumjodide (PI). Er werd een flowcytometer toegepast om de snelheid van apoptose te detecteren.

JC-1 mitochondriaal membraan potentiële detectie

Cellen in de plaat met 6 putjes werden gespoeld met PBS, toegevoegd met 1 ml celkweekmedium en 1 ml JC-1-kleuringswerkoplossing (50 μL JC-1, 8 ml ultrapuur water en 2 ml JC-1-kleuringsbuffer) (SolarbioScience , Peking, China) en gedurende 15 minuten geïncubeerd. De 1 × JC-1 kleurbuffer werd geconfigureerd met 4 ml gedestilleerd water en 1 ml JC-1 kleurbuffer. Na incubatie werden cellen getrypsiniseerd, opnieuw gesuspendeerd in JC-1-buffer en getest op een flowcytometer. Het relatieve aandeel groene fluorescentie werd berekend.

Detectie van oxidatieve stress

Intracellulaire ROS-niveaus werden gemeten met 2,7-dichloorfluoresceïnediacetaat (DCF-DA) Detection Kit (Abcam). Kortom, neuronen werden losgemaakt met 0, 25% trypsine, geresuspendeerd en 30 minuten geïncubeerd met 10 m DCF-DA. Daarna werd DCF-fluorescentie met excitatie-/emissielicht bij 495 nm/529 nm gemeten met fluorescentiespectroscopie (BD Biosciences).

Detectie van intracellulaire malondialchehyche (MDA), glutathion (GSH) -inhoud en superoxide-dismutase (SOD) -activiteit werd gedetecteerd door chemische colorimetrie met behulp van commerciële testkits (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China). OD-waarde werd gemeten door een microplaatlezer.

Oprichting van rattenmodel

Ratten werden verdoofd door intraperitoneale injectie van pentobarbital-natrium (50 g/kg). Een incisie in de middellijn werd gemaakt in de nek, de externe halsslagader werd afgebonden en de gemeenschappelijke halsslagader werd geblokkeerd met een arteriële clip. Een 3-0 siliconen gecoate monofilament nylon hechtdraad werd voorzichtig in de interne halsslagader ingebracht tot lichte weerstand. Na 90 minuten van voorbijgaande cerebrale ischemie, werd de hechting teruggetrokken en werd reperfusie gedurende nog eens 24 uur uitgevoerd. De schijngroep kreeg dezelfde behandeling, behalve dat de hechtdraad niet in de interne halsslagader kwam. Tijdens de operatie werd een thermostatisch bed gebruikt om de rectale temperatuur op 37 ± 0.5 °C [19] te houden.

Ratten werden verdeeld in 6 groepen (n = 6) en geïnjecteerd met plasmide of miR in laterale cerebroventriculaire vóór de oprichting van MCAO-modellen, waaronder de sham-groep, de MCAO-groep (gemodelleerde ratten), de NC-groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventriculaire injectie van 5 μL gecodeerde oligonucleotiden [100 M]), de miR-326-5p agomir-groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventriculaire injectie van 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM]), de sh-STAT3-groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventriculaire injectie van 5 L STAT3-interferentievector [100 μM]) en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep (gemodelleerde ratten met laterale cerebroventriculaire injectie van 5 μL miR-326-5p agomir [100 μM] en 5 μL STAT3-overexpressievector [100 M]) [20, 21].

Specimenverzameling

Ratten werden geëuthanaseerd door anesthesie, de harten werden geperfuseerd en de hele hersenen werden verkregen. De hersenletselweefsels werden gesneden in 1 × 1 × 1 mm ³ weefselmassa's voor de voorbereiding van paraffinecoupes, RT-qPCR, western blot-analyse en detectie van mitochondriaal membraanpotentieel.

Detectie van mitochondriaal membraanpotentieel in cerebrale cortex

De hersenschors van SD-ratten werd gescheiden en in 1 mm ³ . gesneden . De tissueblokken werden op een 300 mesh nylon net geplaatst en PBS toegevoegd. Vervolgens werd de celsuspensie gecentrifugeerd met 1000 omw/min, toegevoegd met 70% ethanol en opnieuw gecentrifugeerd met 1000 omw/min. Daarna werd het monster opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS en de suspensie (1 × 10 ⁶ cellen, 100 L) werd gereageerd met Rhodamine123-kleurstofoplossing (10 L, 5 μg/ml) en geanalyseerd op een flowcytometer bij 488 nm.

HE-kleuring

Het hersenweefsel van de rat werd 24 uur ondergedompeld in 4% paraformaldehyde en paraffinecoupes werden bereid, in 4 m gesneden, uitgespreid in water van 40 ° C en gebakken bij 60 ° C. Routinematig van was ontdaan en gehydrateerd, werden de paraffinecoupes gekleurd met HE-kleuroplossing. Na HE-kleuring vertoonden de beschadigde neuronen contractie van de kern, cellulair oedeem, vacuolisatie en verdonkerde kernen. De lichtmicroscoop (Nikon, Japan) werd gebruikt om het beeld te verkrijgen, en het aantal overlevende neuronen (mm ² ) van de ischemische cortex werd geteld.

TUNEL-kleuring

De paraffinecoupes werden van was ontdaan en gedehydrateerd met 100%, 95%, 80% en 70% alcohol. Vervolgens werden de secties ondergedompeld in 4% paraformaldehyde, gevolgd door incubatie met 0, 1% Triton X-100 natriumcitraatbuffer gedurende 20 minuten en TUNEL-reactiemengsel gedurende 1-1,5 uur. Vervolgens werden de coupes ontwikkeld met peroxidase-oplossing en diaminobenzidine (DAB), tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd met gradiëntalcohol, gepermeabiliseerd en verzegeld in neutrale gom. De coupes werden onder een lichtmicroscoop bekeken om TUNEL-positieve cellen te tellen. Bruingele deeltjes in de kern werden gedefinieerd als TUNEL-positieve cellen (apoptotische cellen).

Immunohistochemie

De coupes werden van was ontdaan, gehydrateerd en teruggewonnen door citraatantigeen, en de endogene katalase werd geblokkeerd door 3% H₂ O₂ . Elke sectie werd toegevoegd met geitenserum (50 L), geïncubeerd met het primaire antilichaam (50 L) en gereageerd met het secundaire antilichaam (50 L) en mierikswortelperoxidase-gelabeld streptavidine (50 L). De coupes werden ontwikkeld door DAB en tegengekleurd met hematoxyline, gevolgd door gradiëntalcoholdehydratatie, xyleenpermeabilisatie en neutrale gomafdichting. De secties werden waargenomen door een microscoop (cytoplasma of kern van ischemische hersenweefsels was gele of bruingele deeltjes). OD-waarden werden gemeten en gemiddeld.

RT-qPCR

Totale RNA-extractie uit weefsels en cellen werd uitgevoerd door Trizol (Invitrogen). mRNA-expressie werd geanalyseerd via qPCR met behulp van SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, VS) en QuantStudio TM 6Flex real-time PCR-systeem (Applied Biosystems). Specifieke stam-loop reverse transcriptie-primers en forward / reverse primers (BioTNT, Shanghai, China) werden ontworpen om miRNA-niveaus te analyseren. Tabel 1 vermeldde alle primers. De 2 ^−△△CT methode werd toegepast om miRNA- of mRNA-niveaus te berekenen.

Western Blot-analyse

De eiwitmonsters werden gescheiden door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en geëlektroblot op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. Daarna werd het PVDF-membraan geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in Tris-bevattende zoutoplossing, onderzocht met de primaire antilichamen en opnieuw onderzocht met het secundaire antilichaam gedurende 2 uur. Vervolgens werden de eiwitbanden geanalyseerd met alkalische fosfatasebuffer die nitroblue-tetrazoliumchloride en 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat bevat en gekwantificeerd door ImageJ-software (NIH, Bethesda, MD, VS). De belangrijkste antilichamen waren STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, VS) en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS).

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

De STAT3 3'UTR die miR-326-5p wildtype (WT) of mutante (Mut) bindingsplaatsen bevat, werd gekloond in pmirGLO-vector (Promega, WI, VS), genaamd STAT3-WT en STAT3-Mut. Cellen werden gezaaid in een plaat met 24 putjes bij 2 × 10 ⁴ cellen / putje en gecotransfecteerd met 100 ng STAT3-WT of STAT3-Mut luciferase vector en 50 nM miR-326-5p agomir of agomir NC bij 70% confluentie. Luciferase-activiteit werd gemeten met behulp van het Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corporation, WI, VS).

Statistische analyse

SPSS 21.0 (IBM, NY, VS) statistische software werd gebruikt voor gegevensanalyse. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde   ±   standaarddeviatie (SD). Het verschil tussen twee groepen werd geanalyseerd door Student's t-test, terwijl meerdere vergelijkingen werden geanalyseerd door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's post hoc-test. P tweezijdige test vertegenwoordigde, en P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 verzwakt apoptose van OGD-behandelde corticale neuronen

De corticale neuronen van de rat werden een week gekweekt en gedifferentieerd en gerijpt. Microscopisch vertoonden de neuronen grotere neuronlichamen, transparanter cytoplasma, grote kern met lage dichtheid en sterke brekingsindex. De neuronlichamen waren conisch of rond en de dendrieten waren verspringend en gehecht aan wanden (figuur 1a, b). NES was een specifieke chemische marker van cerebrale neuronen om neuronen met hoge specificiteit te lokaliseren door middel van een immunofluorescentietest. Neuronen bleken specifiek te binden aan NES en vertoonden groene fluorescentie (Fig. 1c).

Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 verzwakt apoptose van OGD-behandelde corticale neuronen. een Cerebrale neuronen met 2-d aanhangcultuur (schaalbalk:100 m); b Cerebrale neuronen met 7-d aanhangcultuur (schaalbalk:100 m); c Cerebrale neuronen met 7-d hechtende cultuur gekleurd door NES-immunofluorescentietest (schaalbalk:50 m); d Levensvatbaarheid van met OGD behandelde corticale neuronen door MTT-assay; e Apoptose van OGD-behandelde corticale neuronen gedetecteerd door flowcytometrie; v Apoptosesnelheid van met OGD behandelde corticale neuronen; g Bcl-2 en Bax mRNA-expressie in met OGD behandelde corticale neuronen; *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P < 0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep

MTT-assay werd toegepast om de levensvatbaarheid van corticale neuronen te detecteren (figuur 1d). De resultaten toonden aan dat de levensvatbaarheid van corticale neuronen van ratten was aangetast in de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep versus de controlegroep en de miR-326-5p agomir-groep, maar verbeterd in de miR-326-5p agomir-groep en sh-STAT3-groep versus de NC-groep (allemaal P < 0.05).

Rat corticale neuron apoptose werd bepaald door flowcytometrie, terwijl Bcl-2 en Bax mRNA-expressie door RT-qPCR (Fig. 1e-g). De resultaten verklaarden dat in vergelijking met de controlegroep en de miR-326-5p agomir-groep, de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep verhoogde apoptosesnelheid, verminderde Bcl-2-expressie en verhoogde Bax-expressie vertoonden (alle P < 0.05). Met de NC-groepen daarentegen werd de apoptose-snelheid verlaagd, het Bcl-2-niveau verhoogd en het Bax-niveau onderdrukt in de miR-326-5p agomir-groep en de sh-STAT3-groep (alle P < 0.05).

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 verhoogt Mfn2- en mitochondriaal membraanpotentieel niveau in corticale neuronen na OGD-letsel

Mfn2-expressie in met OGD behandelde corticale neuronen werd gedetecteerd door Western-blot-analyse (Fig. 2a, b). Met betrekking tot de controlegroep en de miR-326-5p agomir-groep, nam de Mfn2-eiwitexpressie af in de OGD-groep en miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep, terwijl deze toenam in de miR-326-5p agomir-groep en -STAT3-groep versus de NC-groep (alle P < 0.05).

Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 verhoogt Mfn2- en mitochondriaal membraanpotentiaalniveau in OGD-behandelde corticale neuronen. een , b Mfn2-eiwitexpressie in met OGD behandelde corticale neuronen; c JC-1 flowcytometrie van mitochondriaal membraanpotentiaalniveau in OGD-behandelde corticale neuronen; d ROS-gehalte in met OGD behandelde corticale neuronen na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; e GSH-activiteit in met OGD behandelde corticale neuronen na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; v MDA-gehalte in met OGD behandelde corticale neuronen na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; g SOD-activiteit in neuronen na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P < 0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep

Mitochondriaal membraanpotentieel gedetecteerd door JC-1 ontdekte dat (Fig. 2c, d) met betrekking tot de controlegroep en miR-326-5p agomir-groep, het mitochondriale membraanpotentiaalniveau daalde in de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep (alle P < 0.05). Ten opzichte van de NC-groepen nam het mitochondriale membraanpotentiaalniveau toe in de miR-326-5p agomir-groep en sh-STAT3-groep (alle P < 0.05).

ROS- en MDA-inhoud, en GSH- en SOD-activiteiten in met OGD behandelde corticale neuronen werden bepaald en de resultaten gaven aan dat versus de controlegroep en de miR-326-5p agomir-groep, de OGD-groep en de miR-326-5p agomir + oe -STAT3-groep vertoonde verhoogde ROS- en MDA-inhoud en verminderde GSH- en SOD-activiteiten (alle P < 0.05). In vergelijking met de NC-groepen vertoonden de miR-326-5p agomir-groep en sh-STAT3-groep verminderde ROS- en MDA-inhoud en versterkte GSH- en SOD-activiteiten (alle P < 0.05) (Fig. 2e–g).

Up-regulatie van miR-326-5p of Down-regulatie van STAT3 belemmert pathologische schade aan corticale neuronen en remt apoptose bij ratten met CI/RI

HE-kleuring werd toegepast om de pathologische schade van hersenweefsels te observeren (Fig. 3a, b), wat aantoont dat in de schijngroep de neuronen normaal van structuur waren en netjes gerangschikt met lichtrood cytoplasma, blauwe kern en heldere nucleolus. In de MCAO-groep, de NC-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep, behalve necrose, werd waargenomen dat neuronen wanordelijk waren gerangschikt en donkerder gekleurd waren, met breuk van het kernmembraan, verdwijning van de celstructuur, karyopyknosis, diepe gekleurde kern en lysis in een grote hoeveelheid. In de miR-326-5p agomir-groep en de sh-STAT3-groep werd de zwelling van de neuronen verlicht en werden de neuronen ordelijk gerangschikt en werden de necrotische cellen verminderd, wat wijst op een betere status ten opzichte van de MCAO-groep en de NC-groep.

Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 belemmert pathologische schade van corticale neuronen en remt apoptose bij ratten met CI/RI. een Pathologische schade van hersenweefsel bij MCAO-ratten waargenomen door HE-kleuring (schaalbalk:50 m); b Het aantal intacte neuronen van MCAO-hersenweefsels van ratten na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; c Neuronale apoptose in MCAO-hersenweefsels van ratten gedetecteerd door TUNEL-kleuring (schaalbalk:50 m); d TUNEL-positieve percentages in MCAO-hersenweefsels van ratten na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; e Bcl-2- en Bax-mRNA-expressie in MCAO-hersenweefsels van ratten na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; *P <-0,05 vergeleken met de schijngroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P < 0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep

TUNEL-kleuring werd gebruikt voor de detectie van neuronale apoptose en RT-qPCR voor Bcl-2- en Bax-mRNA-expressie in hersenweefsels. De resultaten toonden aan dat (Fig. 3c-e) in vergelijking met de sham-groep en de miR-326-5p agomir-groep, de TUNEL-positieve snelheid toenam, Bcl-2-mRNA-expressie afnam en Bax-mRNA-expressie toenam in de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep (alle P < 0.05). Lagere TUNEL-positieve snelheid en Bax-mRNA-expressie, en hogere Bcl-2-mRNA-expressie vertoonden in de miR-326-5p agomir en de sh-STAT3-groep dan de NC-groep (alle P < 0.05).

Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 verhoogt mitochondriaal membraanpotentieel niveau in hersenweefsel bij ratten met CI/RI

Detectie van Mfn2-eiwitexpressie in hersenweefsel van ratten werd uitgevoerd door immunohistochemie en de resultaten toonden aan dat (Fig. 4a, b) lagere Mfn2-eiwitexpressie werd getest in de sham-groep en de miR-326-5p agomir-groep versus de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep, terwijl hogere Mfn2-eiwitexpressie werd gemeten in de miR-326-5p agomir-groep en de sh-STAT3-groep in plaats van de NC-groep (alle P < 0.05).

Up-regulatie van miR-326-5p of down-regulatie van STAT3 verhoogt het mitochondriale membraanpotentiaalniveau in hersenweefsel bij ratten met CI/RI. een Mfn2-expressie gedetecteerd door immunohistochemie in hersenweefsel van ratten (schaalbalk:50 m); b Aantal Mfn2-positieve cellen in MCAO-hersenweefsels van ratten na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; c Mitochondriale transmembraanpotentialen in neuronen van MCAO-hersenweefsels van ratten na opwaartse regulering van miR-326-5p of neerwaartse regulering van STAT3; *P <-0,05 vergeleken met de schijngroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P < 0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep

Detectie van mitochondriaal membraanpotentiaalniveau ontdekte dat (Fig. 4c) in vergelijking met de sham-groep en de miR-326-5p agomir-groep, het mitochondriale membraanpotentiaalniveau daalde in de MCAO-groep en de miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groep, terwijl het toenam in de miR-326-5p agomir-groep en de sh-STAT3-groep in tegenstelling tot de NC-groep (alle P < 0.05).

miR-326-5p richt zich op STAT3

miR-326-5p- en STAT3-expressie in corticale neuronen en hersenweefsels werden gedetecteerd door RT-qPCR en western blot-analyse. In corticale neuronen in vitro werd een afname gesuggereerd in de miR-326-5p-expressie en een toename van de STAT3-expressie in de OGD-groep ten opzichte van de controlegroep (beide P < 0.05). Met betrekking tot de NC-groep was de miR-326-5p-expressie verhoogd en de STAT3-expressie verlaagd in de miR-326-5p agomir-groep (beide P < 0,05); STAT3-expressie verlaagd (P <-0.05) in de sh-STAT3-groep. In tegenstelling tot de miR-326-5p agomir-groep, werd STAT3-expressie verhoogd in de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep (P < 0.05) (Fig. 5a–c).

miR-326-5p richt zich op STAT3. een miR-326-5p en STAT3-mRNA-expressie in met OGD behandelde corticale neuronen in vitro; b , c STAT3-eiwitexpressie in met OGD behandelde corticale neuronen in vitro; d miR-326-5p en STAT3-mRNA-expressie in MCAO-hersenweefsels van ratten; e , v STAT3-eiwitexpressie in MCAO-hersenweefsels van ratten; g Voorspelde bindingsplaats van miR-326-5p en STAT3 door bioinformatica-software; u De targeting-relatie tussen miR-326-5p en STAT3 gevalideerd door dubbele luciferase-reportergentest; In figuur a –c , *P < 0,05 vergeleken met de controlegroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P <-0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep. In figuur d –f , *P <-0,05 vergeleken met de schijngroep; #P < 0,05 vergeleken met de NC-groep; &P < 0,05 vergeleken met de miR-326-5p agomir-groep

In hersenweefsels in vivo, in relatie tot de sham-groep, verschenen lagere miR-326-5p en hogere STAT3 in de MCAO-groep (beide P < 0.05). Ten opzichte van de NC-groep nam de miR-326-5p-expressie toe, terwijl de STAT3-expressie afnam in de miR-326-5p agomir-groep (beide P < 0.05). STAT3-expressie nam af in de sh-STAT3-groep (P < 0.05). Met de miR-326-5p agomir-groep daarentegen was de STAT3-expressie verhoogd in de miR-326-5p agomir + oe-STAT3-groep (P < 0.05) (Fig. 5d-f).

De potentiële miR-326-5p-targetingsites op STAT3 3'UTR werden gevonden door DIANA en miRDB-software (Fig. 5g). STAT3 3'UTR met de WT miR-326-5p-bindingsplaats en Mut-bindingsplaats werden geconstrueerd en ingevoegd in het pmirGLO-plasmide. De binding van miR-326-5p aan STAT3 3'UTR werd verder gevalideerd door luciferase-reportertest. Luciferase-reportertest onthulde dat miR-326-5p agomir de relatieve luciferase-activiteit van STAT3-WT verminderde, maar niet STAT3-Mut (Fig. 5h), wat impliceert dat STAT3 een direct doelwitgen was van miR-326-5p.

Discussie

CI/RI is de belangrijkste oorzaak van cerebrovasculaire sterfte [22]. Van miRNA's is aangegeven dat ze betrokken zijn bij CI/RI [23]. Het uitgebreide begrip van het miR-326-5p-gerelateerde mechanisme is echter nog steeds onvoldoende in CI/RI. Deze studie is dus gericht op het blootleggen van de concrete rollen van miR-326-5p in CI / RI met de nadruk op het gecombineerde omgekeerde van miR-326-5p en STAT3. Productief heeft deze studie verklaard dat up-regulatie van miR-326-5p CI/RI verzwakte en Mfn2-expressie verhoogde via STAT3-remming.

In het begin werd vastgesteld dat miR-326-5p-expressie in CI / RI in vivo en in vitro zou verminderen. Vervolgens hebben we een reeks assays geregeld en ontdekten dat het opreguleren van miR-326-5p de levensvatbaarheid van neuronen en de mitochondriale functie verbeterde, de Mfn2-expressie verhoogde en oxidatieve stress en apoptose in bedwang hield. Verder verifieerden in vivo experimenten bij ratten de functionele rollen van herstelde miR-326-5p in CI/RI. In feite is bewezen dat een hoge miR-326 correleert met een lange algehele overleving van patiënten met glioblastoom, het veel voorkomende type hersentumor [24]. Also, miR-326 expression has been further evidenced to reduce in Parkinson's disease and miR-326 could suppress apoptosis of dopaminergic neurons and reduce inflammatory response [25]. Except for that, the reduction in miR-326-5p is manifested in endothelial progenitor cells in the course of myocardial infarction, and introduction of endothelial progenitor cells overexpressing could promote cardiac function recovery [11]. There has been a study illustrating that up-regulation of miR-326 improves the behavioral function, enhances neuronal viability and depresses neuronal apoptosis in mice with Alzheimer's disease [26]. Furthermore, it is documented that up-regulation of miR-326 by miR-326 mimic could suppress inducible nitric oxide synthase in dopaminergic neurons in Parkinson's disease [27].

In this study, we found that STAT3 was a target gene of miR-326-5p. Supported by an advanced study, it is indicated that STAT3 expression is negatively regulated by miR-326 in human endometrial carcinoma stem cells [28]. In the present study, we measured that STAT3 expression was enhanced in CI/RI. Currently, it has been found that I/R injury and OGD would induce STAT3 expression to increase [29]. Intriguingly, STAT3 mRNA expression trends to an increment in I/R animals [30]. Additionally, STAT3 protein expression is reported to up-regulate in CI/RI [31]. Next, our study revealed that down-regulating STAT3 had the therapeutic effects on CI/RI rats and OGD-treated neurons. As supported by a study, it is concluded that miR-31 induction discourages oxidative stress by inactivation of JAK/STAT3 pathway in ischemic stroke [32]. Also, inhibition of JAK2/STAT3 pathway is beneficial to oxidative stress impairment in CI/RI [31]. Furthermore, knockdown of JAK/STAT3 pathway is identified to enhance cell viability, and reduce oxidative stress and neuron apoptosis in ischemic brain injury [33]. Lately, inhibited JAK/STAT3 signaling pathway is witnessed to relieve myocardial infarction in myocardial I/R injury [34]. As demonstrated, depleted STAT3 undermines neuronal apoptosis in rats with white matter injury [35]. Moreover, the suppression of neuronal apoptosis, and alleviation of cerebral infarct size are attributed to JAK2/STAT3 inhibition in rats with CI/RI [36].

Finally, we focused on the effects of miR-326-5p and STAT3 on Mfn2 expression and discovered that the reduced level Mfn2 in rats with CI/RI and OGD-treated neurons could be elevated by either restoring miR-326-5p or silencing STAT3. As implicated by a previous study, it is documented that Mfn2 is decreased in the lately phase of reperfusion and poorly expressed of Mfn2 exacerbates CI/RI via restrained autophagosome formation and autophagosome and lysosome fusion [18]. Additionally, Mfn2 is implied to reduce even disappear in I/R injury in old hepatocytes [37]. However, few researches have discussed the regulatory mechanism of miR-326-5p and STAT3 for Mfn2.

Conclusion

In general, this study has elucidated the mechanisms that elevated miR-326-5p inhibits neuronal apoptosis, attenuates pathological damage of neurons and increases the expression of Mfn2 via STAT3 downregulation in CI/RI. The study may update the potential mechanism of miR-326-5p and STAT3 in CI/RI. However, more studies are still needed for further development of the molecular mechanism in CI/RI.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal transducer and activator of transcription-3

OGD:

Oxygen and glucose deprivation

MCAO:

Middle cerebral artery occlusion

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

STAT:

Signal transducers and transcriptional activator

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluoresceïne isothiocyanaat

NES:

Nestin

NC:

Negative control

Oe:

Overexpression

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

OD:

Optische dichtheid

PI:

Propidium iodide

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutathion

SOD:

Superoxide dismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF:

Polyvinylideenfluoride

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

SD:

Standard deviation

ANOVA:

One-way analysis of variance