Biocompatibele nanodeeltjes als platform voor het verbeteren van de antitumorwerking van de combinatie van cisplatine en tetradrine

Abstract

Combinatietherapie is een standaardstrategie geweest in de klinische tumorbehandeling. We hebben aangetoond dat de combinatie van tetradrine (Tet) en cisplatine (CDDP) een duidelijke synergetische antikankeractiviteit vertoonde, maar onvermijdelijke bijwerkingen beperken hun therapeutische concentratie. Gezien de verschillende fysisch-chemische en farmacokinetische eigenschappen van de twee geneesmiddelen, hebben we ze samen in een nanovoertuig geladen door de verbeterde dubbele emulsiemethode. De nanodeeltjes (NP's) werden bereid uit het mengsel van poly(ethyleenglycol)-polycaprolacton (PEG-PCL) en polycarprolacton (HO-PCL), zodat CDDP en Tet gelijktijdig in de NP's kunnen worden gelokaliseerd, wat resulteert in een laag interfererend effect en hoge stabiliteit . Afbeeldingen van een fluorescentiemicroscoop onthulden de cellulaire opname van zowel hydrofiele als hydrofobe middelen geleverd door de NP's. In vitro-onderzoeken op verschillende tumorcellijnen en tumorweefsel lieten verhoogde tumorremming en apoptosepercentages zien. Wat de in-vivo-onderzoeken betreft, werden superieure antitumorwerking en verminderde bijwerkingen waargenomen in de NP's-groep. Bovendien, ¹⁸ FDG-PET/CT-beeldvorming toonde aan dat NP's de metabole activiteiten van tumoren prominenter verminderden. Onze resultaten suggereren dat PEG-PCL-blokcopolymere NP's een veelbelovende drager kunnen zijn voor gecombineerde chemotherapie met solide werkzaamheid en kleine bijwerkingen.

Inleiding

Met de ontwikkeling van uitgebreide tumortherapie spelen platinaverbindingen een belangrijke rol bij de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder cisplatine (CDDP) dat veel wordt gebruikt in de kliniek [1, 2]. Tegenwoordig is CDDP nog steeds significant in combinatie met tumorimmunotherapie, met een gunstig effect op kwaadaardige tumoren zoals niet-kleincellige longkanker (NSCLC) [3]. Deze chemotherapeutische middelen bereiken echter altijd antitumoractiviteit ten koste van ongewenste toxiciteit [4], dus therapeutische middelen die de toxiciteit kunnen verminderen en de werkzaamheid van chemotherapie kunnen verbeteren, zijn onophoudelijk onderzocht [5, 6]. Tetrandrine (Tet) is een lid van de bis-benzylisochinoline-alkaloïde [7] en vertoont een bevredigend effect bij sensibilisatie voor chemotherapie. Ons eerdere werk heeft aangetoond dat de combinatie van Tet en CDDP een duidelijke synergetische antikankeractiviteit heeft door remming van de expressie van met chemotherapeutica geassocieerde genen, waaronder de excisieherstel-kruiscomplementatiegroep 1 (ERCC1), thymidylaatsynthase (TS), - tubuline III, enz. [8]. De klinische toepassing van Tet lijdt echter onder de slechte oplosbaarheid in water en de lage orale biologische beschikbaarheid [7]. Bovendien verdeelt hydrofiel CDDP zich het gemakkelijkst in de extracellulaire matrix (ECM), terwijl hydrofobe Tet-penetrerende lipidemembranen door cellen kunnen worden getransporteerd, zodat de twee geneesmiddelen niet echt kunnen samenwerken. Daarom is het essentieel om een manier te vinden die de twee geneesmiddelen tegelijkertijd effectief kan afgeven, waardoor het antineoplastische effect wordt verbeterd met minder bijwerkingen.

Recente ontwikkelingen op het gebied van nanotechnologie zorgen voor nieuwe benaderingen voor diagnose en behandeling van kanker [9, 10]. Nanodeeltjes (NP's) geconstrueerd met amfifiele copolymeren, vooral polyethyleenglycol (PEG), staan bekend om hun vermogen om de aanhechting van serumeiwit te verminderen en opname door het reticulo-endotheliale systeem (RES) te voorkomen [11]. Als ze worden gebruikt om hydrofobe geneesmiddelen te vervoeren, verhogen de nanodragers de oplosbaarheid tactvol en verlengen ze de verblijfsduur van het geneesmiddel in de bloedcirculatie en de tumor [12]. Met het klinische gebruik van copolymere NP's trekt de biocompatibiliteit van de NP's steeds meer aandacht. Recente bevindingen onthulden bijvoorbeeld dat sommige geïnjecteerde titaniumdioxide, silica en gouden nanodeeltjes de intravasatie en extravasatie van kankercellen in diermodellen versnellen [13]. De NP's die zijn bereid uit nanomaterialen met een goede biocompatibiliteit en veiligheid, vooral die welke zijn goedgekeurd door de FDA, zijn betere kandidaten voor medicijndragers.

Voorlopig zijn we erin geslaagd CDDP-geladen NP's [14, 15] en Tet-geladen NP's te construeren met behulp van polyethyleenglycol-poly(caprolacton) (PCL-PEG) [16], waarvan beide in vivo antitumoreffecten zijn aangetoond. In deze studie hebben we PEG-PCL gebruikt voor de gezamenlijke levering van CDDP en Tet. Met een bijna neutrale lading vormt PEG de hydrofiele schil van een nanodeeltje, dat antigene epitopen verbergt en immunologische reactie voorkomt [14]. Afbeeldingen van een fluorescentiemicroscoop toonden aan dat de cel zowel hydrofiele als hydrofobe middelen kan opnemen die door de NP's worden geleverd. De resultaten van in vitro-onderzoeken, niet alleen op verschillende tumorcellijnen, maar ook op tumorweefsels, onthulden dat CDDP-Tet NP's de tumorgroei effectiever remmen dan de gratis geneesmiddelen. Bij onderzoek in vivo werden verhoogde antitumorwerking en verminderde bijwerkingen waargenomen in de NP's-groep. Bovendien, ¹⁸ FDG-PET/CT-beeldvorming toonde de laagste stofwisselingssnelheid van de tumor in de NP's-groep, en daarmee het vermogen van CDDP-Tet NP's om tumorgroei te vertragen.

Methoden

Materialen

Reagentia en cellen

CDDP (moleculaire formule PtCl₂ (NH₃ )₂ ) werd gekocht van Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China) [15]. Tetrandrine (moleculaire formule C₃₈ H₄₂ N₂ O₆ ) werd verkregen als een poeder met een zuiverheid van> 98% van Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16]. Methoxypolyethyleenglycol [MePEG; gewichtsgemiddeld molecuulgewicht (Mw = 4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] werd gedehydrateerd door azeotropische destillatie met tolueen en vervolgens voor gebruik 12 uur vacuümgedroogd bij 50 °C. , VS) werd gezuiverd door drogen over CaH₂ bij kamertemperatuur gevolgd door destillatie onder verminderde druk. Polyvinylalcohol (PVA; polymerisatiegraad = 500, alcoholisatiegraad = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) en stanno-octoaat (moleculaire formule SnCl2) (Sigma) werden gebruikt zoals ontvangen. RPMI 1640-medium (Gibco, VS), kalfsbloedserum (Lanzhou Minhai Bioengineering, China) en dimethylthiazoly-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT; Amersco, VS) werden gebruikt zoals ontvangen.

Menselijke goed gedifferentieerde maagkankercellijn MKN₂₈ , menselijke colorectale adenocarcinoomcellijn LoVo, menselijke baarmoederhalskankercellijn Hela en muizenhepatoomcellijn H₂₂ werden verkregen van het Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China). Alle cellijnen werden vermeerderd in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% runderserum, penicilline (100 E/mL)-streptomycine (100 g/ml), pyruvaat, glutamine en insuline bij 37 °C in een met water verzadigde atmosfeer met 5% CO₂ .

Synthese van de copolymeren

Zoals we eerder beschreven [16, 17], werden mPEG-PCL- en HO-PCL-copolymeren gesynthetiseerd door een ringopening-copolymerisatie. In het kort werd een vooraf bepaalde hoeveelheid a-CL toegevoegd aan een polymerisatiebuis die PEG en een kleine hoeveelheid tin(II)octoaat (0,1% wt/wt) bevatte. De buis werd vervolgens aangesloten op een vacuümsysteem, afgesloten en 48 uur in een oliebad van 130°C geplaatst. Voor de synthese van HO-PCL-copolymeren werd een vooraf bepaalde hoeveelheid ε-CL en tin(II)octoaat toegevoegd aan een polymerisatiebuis zonder droog te zijn. Nadat de polymerisatie voltooid was, werden de ruwe copolymeren opgelost met chloroform en neergeslagen in een overmaat koude methanol om het niet-gereageerde monomeer en oligomeer te verwijderen. De precipitaten werden vervolgens gefiltreerd en verschillende keren gewassen met water voordat ze grondig werden gedroogd onder verminderde druk.

Voorbereiding van CDDP-Tet-geladen nanodeeltjes

Vooraf bepaalde hoeveelheid CDDP en Tet-geladen nanodeeltjes werden bereid door dubbele emulsie (DE) methode [14, 18]. CDDP en Tet werden geëmulgeerd met 1 ml dichloormethaan (DCM) -oplossing die 5 mg mPEG-PCL en 15 mg HO-PCL bevatte, door sonicatie gedurende 15 s (15 W) in een ijsbad (oplossing W1). Vervolgens werd 4 ml 3% (w/v) PVA-oplossing W2 toegevoegd en gedurende 30 seconden gesoniceerd om een W1/O/W2-emulsie te maken. De dubbele emulsie werd verdund in 50 ml 0,3% (w/v) waterige PVA-oplossing en DCM werd onder vacuüm verdampt. De verkregen nanodeeltjes werden verzameld, gewassen en gevriesdroogd (Fig. 1).

Het schema van de voorbereiding van CDDP-Tet NP's

Inhoud laden van medicijnen en efficiëntie van inkapseling

Om het gehalte aan geneesmiddellading te bepalen, werd het gevriesdroogde met CDDP-Tet beladen NP-poeder opgelost in dimethylformamide (DMF) en 30 l van deze oplossing werd gemengd met 30 l 2 mmol/L HCL gevolgd door de toevoeging van 2,94 ml van 0,2 mmol/L SnCl₂ oplossing in 2 mmol/L HCL. De absorptie bij 403 nm werd gemeten na 1 uur met verwijzing naar een kalibratiecurve met behulp van een Shimadzu UV-1205-spectrofotometer (Kyoto, Japan). Vervolgens kon de totale hoeveelheid van het geneesmiddel in de NP's worden berekend. De inhoud van de geneesmiddelbelading en de inkapselingsefficiëntie werden respectievelijk verkregen door Vgl. (1) en (2):

$${\text{Drug loading content}}\, (\% ) =\frac{{{\text{Gewicht van het geneesmiddel in nanodeeltjes}}}}{{{\text{Gewicht van de nanodeeltjes}}}} \times 100\,(\% )$$ (1) $${\text{Inkapselingsefficiëntie }}\,(\% ) =\frac{{{\text{Gewicht van het medicijn in nanodeeltjes}}}}{ {{\text{Gewicht van het voedingsmiddel}}}} \times 100\,(\% )$$ (2)

In vitro cytotoxiciteit van de nanodeeltjes en de biocompatibiliteitsstudie

Cellulaire opnamestudies

Op basis van ons eerdere werk [15] werden LoVo-cellen op het deksel van een plaat met 6 poriën geplaatst met ongeveer 5 × 10⁵ cellen in elke porie en werden 24 uur geïncubeerd (37 °C, 5% CO₂ ). NP's met rhodamine B (21 μg / ml) werden in de poriën toegevoegd. Na incubatie gedurende 2 uur werd de paté elk 3-4 keer gewassen met 4 ° C en 37 ° C PBS. LoVo-cellen op dekglaasjes werden vervolgens onderworpen aan een fluorescentiemicroscoop.

Cytotoxiciteitstest

De in vitro cytotoxiciteit van de geneesmiddelen werd bepaald door standaard MTT-assays met MKN28 en H₂₂ cel lijnen. In het kort werden cellen 24 uur voorafgaand aan de test gezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 5000 cellen per putje. Vervolgens werden cellen blootgesteld aan een reeks doses vrij CDDP, vrij Tet, vrij CDDP plus Tet en met CDDP-Tet geladen nanodeeltjes. Na incubatie werd 20 μL 5 mg/ml MTT-oplossing aan elk putje toegevoegd en de plaat werd 4 uur geïncubeerd, waardoor de levensvatbare cellen de gele MTT konden transformeren in donkerblauwe formazankristallen, die werden opgelost in 200 μL dimethyl sulfoxide (DMSO). De optische dichtheid (OD) van elk putje werd gemeten met een ELISA-lezer (ELX800 Biotek, VS) met test- en referentiegolflengten van respectievelijk 490 en 630 nm. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door de volgende formule:

$${\text{Cell levensvatbaarheid}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD (testput)}}}}{{{\text{OD (referentieput)}}}} \ maal 100\,(\% )$$ (3)

De in vitro compatibiliteit van de blanco nanodeeltjes werd ook bepaald door MTT-assays met MKN₂₈ en H₂₂ cel lijnen. Alle resultaten van MTT-assays werden bevestigd door het experiment bij ten minste drie onafhankelijke gelegenheden te herhalen en elke keer in drievoud te testen.

Apoptose-assay

Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystem, VS) werd aangenomen om de verandering van celapoptosepercentages te onderzoeken. MKN₂₈ cellen werden gedurende 24 uur onderworpen aan een kweekschaal van 6 cm. Kweekmedia werden vervangen door respectievelijk 1 g / ml gratis CDDP, 1 μg / ml CDDP-geladen NP's en 200 μg / ml blanco NP's. De controlegroep werd vervangen door kweekmedia zonder medicijnen. Enzym werd toegevoegd na 48 uur kweken. De cellen werden vervolgens verzameld, 2 keer gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in 100 L buffer. Annexine V 5 L en PI 1 L werden achtereenvolgens toegevoegd, gemengd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zonder blootstelling aan licht gestaan. Er is 400 ml buffer toegevoegd en deze is onderworpen aan het FCM-proces (BD FACS CantoTM, VS) voor analyse van de celapoptose-snelheid.

Histoculture Drug Response Assay (HDRA)

De HDRA werd uitgevoerd volgens onze eerdere studies [14, 19]. In het kort, mannelijke ICR-muizen werden subcutaan geïnjecteerd in beide okselruimten met 4-6 × 10⁶ H₂₂ cellen in zoutoplossing. Toen de tumoren 400-600 mm bereikten³ in volume werden de muizen opgeofferd door cervicale dislocatie, en verse monsters werden bemonsterd, tweemaal gewassen in zoutoplossing, ondergedompeld in Hank's oplossing en verdeeld in stukken met een gewicht van ongeveer 15 mg. De weefselmonsters werden in een plaat met 24 putjes geplaatst waarin vierkante gelatinesponzen met afmetingen van 1 cm waren ondergedompeld in RPMI 1640-medium aangevuld met 20% foetaal kalfsserum en amikacinesulfaat (100 IE/ml) dat vrij CDDP of CDDP- geladen NP's in twee verschillende concentraties. Vier tumorspecimens werden geïncubeerd zonder enig geneesmiddel als controle. De weefsels werden vervolgens 7 dagen gekweekt bij 37 °C 5% CO₂ . Een gemengde oplossing van Type I collagenase (100 L, 0,6 mg/ml) en MTT (100 L, 5 mg/ml) in 100 mg/ml natriumsuccinaat werd toegevoegd. Na nog eens 24 uur incubatie werd MTT-formazan geëxtraheerd met 1 ml DMSO en 100 L oplossing van elk putje werd overgebracht naar de putjes van een microtiterplaat met 96 putjes. De OD van elk putje in de microplaat werd gemeten met behulp van de ELISA-lezer met test- en referentiegolflengten van respectievelijk 490 en 630 nm. De levensvatbaarheid van de weefsels werd berekend volgens de volgende formule (4):

$${\text{Weefsellevensvatbaarheid}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD (test)}}/{\text{Gewicht (test)/mg}}}}{{{\ text{OD (controle)}}/{\text{Gewicht (controle)/mg}}}} \times 100\,(\% )$$ (4)

In vivo antitumorwerking

Tumorvolumemeting

Mannelijke ICR-muizen met een gewicht tussen 18 en 20 g werden geïmplanteerd met muizenhepatoomcellijn H₂₂ en gebruikt om de relatieve werkzaamheid van met CDDP-Tet geladen NP's te kwalificeren. Opgegroeid onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden, werden de muizen uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de Animal Care Committee in Drum Tower Hospital. 0,2 ml celsuspensie met 4–6 × 10⁶ H₂₂ cellen werden subcutaan in de linker okselruimte van de muizen geïnjecteerd. De muizen werden verdeeld in 6 groepen:controlegroep (zoutoplossing), blanco NPs-groep, vrije CDDP-groep (3 mg/kg), vrije CDDP plus Tet-groep (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) en CDDP- Tet-geladen NP's (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) groep. Elke groep bestond uit 6 muizen. De behandelingen werden gestart na 7-8 dagen implantatie en de dag werd aangeduid als 'Dag 0'. Elk dier werd op het moment van de behandeling gewogen, zodat de doseringen konden worden aangepast om de gerapporteerde mg/kg-doses te bereiken. De dieren werden tijdens het experiment ook om de dag gewogen.

Immunofluorescentietest

De tumorweefsels van de muizen in de controlegroep en die gratis CDDP plus Tet en CDDP-Tet NP's kregen, werden geselecteerd voor histologische observatie op de 21e dag na de behandeling. De tumoren werden ontleed en gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, routinematig verwerkt tot paraffine, in coupes met een dikte van 5 mm. De weefselcoupes werden waargenomen onder een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop nadat de monsters waren gekleurd met (40,6-diamidino-2-fenylindole) (DAPI, blauw) en terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL, groen) [20] .

¹⁸ FDG-PET/CT-beeldvorming

Muizen van vrije CDDP plus Tet-groep en CDDP-Tet-geladen NP's-groep kregen vervolgens PET / CT-beeldvorming op dag 6 na behandeling. 4 uur vasten werd uitgevoerd vóór injectie van de tracer. 14,8 MBq (400 lCi) van ¹⁸ F-FDG werd als radiotracer via de staartader geïnjecteerd. De beelden zijn gemaakt met een gecombineerde PET/CT-scanner (Jemini JXL, Philips, VS). PET-beelden met hoge resolutie en hetzelfde CT-beeldveld werden 45 min na de toediening van ¹⁸ met de muizen verkregen F-FDG. Op basis van de CT-gegevens zijn PET-beelden gecorrigeerd voor verzwakking en verstrooiing. De beeldfusie werd uitgevoerd door een automatisch beeldfusiesysteem, met behulp van door de leverancier geleverde software. Maximale FDG-opnamewaarden in de tumor werden verkregen voor de standaardopnamewaarde (SUV)-berekeningen, waarbij correcties werden toegepast voor lichaamsgewicht en geïnjecteerde activiteit.

Statistische methoden

Statistische analyses van gegevens werden gedaan met behulp van Student's t test. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en waarden van P < 0,05 werden geaccepteerd als een statistisch significant verschil.

Resultaten

Copolymeersynthese en karakterisering

Volgens onze eerdere studie hebben we de NP's gesynthetiseerd met PEG-PCL en HO-PCL (de optimale verhouding was 1:3) [14]. De diameter, polydispersiteit, aantalgemiddeld molecuulgewicht (Mn) en gewichtsgemiddeld molecuulgewicht (Mw) van de optimale PEG-PCL-copolymere NP's worden weergegeven in aanvullend bestand 1:Tabel S1. Wanneer geladen met CDDP en Tet, werden ook de inhoud van het geneesmiddel en de inkapselingsefficiëntie gemeten (aanvullend bestand 1:tabel S2), die vergelijkbaar zijn met die van met CDDP geladen PEG-PCL-copolymere NP's. Het gehalte aan geneesmiddellading en de laadefficiëntie van Tet zijn echter minder dan die van met Tet geladen PEG-PCL-copolymere NP's, wat mogelijk iets te maken heeft met HO-PCL-componenten.

Door dynamische lichtverstrooiing (DLS) was de diameter van CDDP-Tet-geladen PEG-PCL-copolymere NP's 359,1 ± 5,3 nm met een polydispersiteit van ongeveer 0, 231. Wanneer waargenomen door TEM en AFM (aanvullend bestand 1:Fig S1a en S1b), vertoonden de NP's een regelmatige bolvorm en vergelijkbare afmetingen die samenviel met de gegevens van DLS. Ook zijn er kleine druppeltjes verspreid in de nanodeeltjes, wat bevestigt dat nanodeeltjes inderdaad de structuur van dubbele emulsie zijn.

Cellulaire opname van CDDP-Tet-geladen NP's

Deeltjes die worden geladen met fluorescerende kleurstoffen zijn toegepast als een gebruikelijke methode om cellulaire opname te onderzoeken, wat visuele en realtime detectie mogelijk maakt. We hebben aangetoond dat de met kleurstof beladen NP's de cellen kunnen binnendringen via endocytose. In deze studie is rhodamine-B hydrofiel en kan het worden gedetecteerd in PI-fluorescentiekanalen, die worden gebruikt om CDDP te simuleren. Als de simulatie van Tet is coumarine-6 hydrofoob, waarvan het signaal kan worden ontvangen in het FITC-fluorescentiekanaal. Na co-geïncubeerd te zijn met NP's geladen met coumarine-6 en rhodamine-B gedurende 2 uur, werden LoVo-cellen gedetecteerd door middel van fluorescentiemicroscopie en optische lens (200 ×). Zoals te zien is in figuur 2, kunnen fluorescentiesignalen worden gedetecteerd in het PI-fluorescentiekanaal, het FITC-fluorescentiekanaal en het dubbele PI/FITC-fluorescentiekanaal. De resultaten bevestigden dat de NP's zowel coumarine-6 als rhodamine-B tegelijkertijd naar tumorcellen kunnen vervoeren, op basis waarvan we kunnen concluderen dat CDDP en Tet tegelijkertijd in de NP's kunnen worden geladen en door tumorcellen kunnen worden geabsorbeerd.

Foto's van LoVo-cellen na 2 uur kleuring met NP's geladen met rhodamine B en coumarine-6 (200 ×; bar:50 m). een Celmorfologie onder de lichtmicroscopie, b celmorfologie onder fluorescentiemicroscoop (PI-fluorescentiekanaal), c celmorfologie onder fluorescentiemicroscoop (FITC-fluorescentiekanaal), en d celmorfologie onder fluorescentiemicroscoop (PI/FITC dubbel fluorescentiekanaal)

In vitro cytotoxiciteit van de nanodeeltjes

De cytotoxiciteit van vrij CDDP, vrij Tet, vrij CDDP plus Tet en met CDDP-Tet geladen NP's werden vergeleken in maagcellijn MKN28. De concentratie van Tet was 2,4 keer zo hoog als de concentratie van CDDP. Zoals weergegeven in figuur 3, was de cytotoxiciteit van met CDDP-Tet geladen NP's het krachtigst van de vier groepen. Het verschil in cytotoxiciteit tussen vrij Tet en de NPs-groep en drie andere vrije-drugs-groepen werd prominent naarmate de concentratie toenam. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in menselijke baarmoederhalskankercellen Hela en hepatocellulaire carcinoomcellen H₂₂ (Aanvullend bestand 1:Fig S2a, S2b).

In vitro cytotoxiciteit van de nanodeeltjes. een Levensvatbaarheid van de cellen van MKN28 na 48 uur samen met medicijnen te zijn gekweekt. De concentratie van Tet was 2,4 keer zo hoog als de concentratie van CDDP. b Foto's van MKN28-cellen onder de lichtmicroscopie (200 ×) na 48 uur samen met medicijnen gekweekt te zijn

Toxiciteitsonderzoek van blanco NP's is uitgevoerd in ons vorige werk. In de vorige studie had de blanco NP's weinig toxiciteit op tumorcellijnen, wat erop wees dat blanco NP's een bevredigende biocompatibiliteit hebben [14, 16].

In vitro-apoptose-analyse van CDDP-Tet-geladen NP's

We hebben de impact gemeten van 1 g/ml gratis CDDP, 2,4 μg/ml gratis Tet, gratis CDDP plus Tet (1 μg/mL + 2,4 μg/ml) en CDDP-Tet-geladen NP's (1 μg/mL + 2,4 μg / ml) op apoptotische snelheid van MKN28-cellen na 48 uur samen te zijn gekweekt. Celapoptotische snelheid werd berekend als Q2 + Q4 (getoond in Fig. 4). De wijziging van de apoptotische snelheden van cellen was vergelijkbaar tussen vrije CDDP plus Tet-, vrije CDDP- en vrije Tet-groepen (Fig. 4a-c). De apoptosesnelheid van MKN28-cellen geïnduceerd door CDDP-Tet-geladen NP's was echter significant hoger dan die van drie andere groepen (Fig. 4d).

In vitro apoptose-analyse door flowcytometrie a gratis CDDP, b gratis Tet, c gratis CDDP + Tet en d CDDP-Tet NP's

Histoculture Drug Response Assay (HDRA)

Om de antitumoreffectiviteit van de NP's uitgebreider te evalueren, evalueerden we de antitumoreffecten van vrije CDDP, vrije CDDP plus Tet en CDDP-Tet-geladen NP's op H₂₂ cellijnen met HDRA. Als een klinische methode om chemosensitiviteit te voorspellen, simuleert HDRA de praktische omstandigheden van tumorweefsels authentieker dan een cytologisch experiment [19], waarvan de resultaten kunnen worden beïnvloed door de micro-omgeving en microstructuur van het tumorweefsel, zoals penetratie van het geneesmiddel, de extracellulaire pH-waarden, interstitiële vloeistofdruk, enz.

De concentratie van Tet is 2,4 keer zo hoog als de concentratie van CDDP. Zoals getoond in Fig. 5, was bij de laagste concentratie het antitumoreffect van de vrije CDDP- en Tet-groep beter dan dat van CDDP, maar de effecten waren vergelijkbaar met de toename van de geneesmiddelconcentratie. In overeenstemming met apoptose-analyse hadden CDDP-Tet-geladen NP's een aanzienlijk beter antitumoreffect bij drie groepen bij alle geteste concentraties.

Histocultuur geneesmiddelresponstest

In vivo antitumor-werkzaamheidsanalyse

Evaluatie van de werkzaamheid en bijwerkingen

Muizenmodellen gevormd door H₂₂ cellijnimplantatie werd behandeld met 3 mg/kg vrij CDDP, vrij CDDP samen met Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), CDDP-Tet-geladen NP's (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/ kg), respectievelijk. Tumor werd 12 dagen na medicamenteuze behandeling verkregen. Tumorgroottes werden om de 2 dagen gedetecteerd om de meest optimale inhoud van medicijnafgifte te bepalen. Zoals getoond in de tumorgroeicurve (Fig. 6), waren de tumorgroeitrend van zowel de controlegroep als de groep met blanco nanodeeltjes vergelijkbaar, maar er bestond een prominente remming van de tumor in andere drie groepen met medicijnafgifte. Vergeleken met de vrije CDDP-groep vertoonde de vrije CDDP plus Tet-groep een betere antitumorwerking gedurende de eerste 6 dagen. Na 6 dagen begon het verschil in tumorremmingssnelheid tussen de twee groepen echter kleiner te worden en na 10 dagen had gratis CDDP plus Tet een nog slechter antitumoreffect.

Tumorvolume van vastgesteld H₂₂ xenotransplantaten in ICR-muizen tijdens therapie onder verschillende behandelingen. Muizen werden op dag 0 met verschillende strategieën behandeld, zoals weergegeven in de afbeelding:3 mg/kg gratis CDDP, gratis CDDP samen met Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) en CDDP-Tet-geladen NP's ( CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), respectievelijk. Gemiddelde ± SD (n = 6) van elke groep werd gemeten

Gedurende de eerste 6 dagen waren de antitumoreffecten van de groepen met vrije CDDP plus Tet en CDDP Tet-geladen NP's vergelijkbaar. Daarom vertoonden muizen die CDDP-Tet-geladen NP's ontvingen een betere antitumorwerking sinds dag 6 na de behandeling. Aanvullend bestand 1:figuur S3a toont verschillende tumorgroottes van elke groep. Het tumorvolume van de met CDDP-Tet beladen NP's-groep was het kleinst, wat kan worden beschouwd als de directe weerspiegeling van het prominente antitumoreffect. Naast het tumorremmingsvermogen waren er, vergeleken met de vrije CDDP- of de vrije CDDP plus Tet-groep, minder bloedvaten op het oppervlak van de tumor). Evenzo, zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Figuur S3b, was de vasculaire dichtheid het laagst in de NP's-groep ten opzichte van de controlegroep en de vrije CDDP plus Tet-groep.

Om de verhouding van apoptotische cellen in tumorweefsel in vivo verder te onderzoeken, werd TUNEL-assay uitgevoerd voor de detectie van apoptotische cellen. Zoals weergegeven in figuur 7, kunnen de apoptotische cellen in tumoren worden gekleurd met groene fluorescentie om apoptose aan te geven. De samengevoegde afbeeldingen tonen minder groene fluorescerende gebieden in de controlegroep en de Free CDDP plus Tet-groep, wat wijst op de aanwezigheid van minder apoptotische cellen. Bovendien werd een groot aantal groene fluorescerende gebieden waargenomen in de groep die werd behandeld met CDDP-Tet NP's, wat wijst op een grote hoeveelheid apoptotische cellen. De resultaten bevestigden dat CDDP-Tet NP's tumorapoptose in vivo kunnen bevorderen.

Apoptotische cellen werden gedetecteerd door een TUNEL-assay (groen) en mede gekleurd door nucleaire kleuring DAPI (blauw)

Naast een betere antitumorwerking dan de vrije CDDP en de vrije CDDP plus Tet-groep, vertoonden de met CDDP-Tet geladen NP's ook minder bijwerkingen. Zoals getoond in figuur 8a, veroorzaakten vrij CDDP en vrij CDDP plus Tet aanzienlijk gewichtsverlies in vergelijking met de controlegroep, wat wijst op de toxiciteit bij directe medicijnafgifte. De gewichtsveranderingscurve van de blanco NP's-groep was vergelijkbaar met die van de controlegroep, wat suggereert dat de toxiciteit van de blanco NP's buiten beschouwing kon worden gelaten. Het gewichtsverlies veroorzaakt door CDDP-Tet-geladen NP's en controlegroepen was vergelijkbaar gedurende de eerste 6 dagen. Van dag 6 tot dag 12 waren de muriene gewichtsniveaus in de NPs-groep iets lager dan die in de controlegroep, maar hoger dan de vrije CDDP- of vrije CDDP plus Tet-groep. Het is opmerkelijk dat de gratis CDDP plus Tet-groep bijdroeg aan duidelijk gewichtsverlies en de eetlust van muizen verminderde gedurende de eerste 4 dagen, wat aangeeft dat de opname van medicijnen schadelijk was voor het hele lichaam. Daarentegen kunnen CDDP-Tet-geladen NP's langzaam in weefsels worden afgegeven en de concentratie stabiel houden; daarom waren de bijwerkingen duidelijk verminderd in vergelijking met directe medicijnafgifte. Vervolgens werden de bijwerkingen van de behandeling ook geëvalueerd door middel van een leverbiopsie (Fig. 8b). Vergeleken met de controlegroep, is de grens tussen de levercellen van de groep met naakte geneesmiddelen met dubbel geneesmiddel vervaagd, hebben sommige levercellen snelle veranderingen ondergaan, krimpen cellichamen, nucleaire pyknosis en verhoogde eosinofilie (gele pijl), terwijl de dubbelgeneesmiddel nanodeeltjes groep. De structuur van stamcellen is normaal, de intercellulaire ruimte is duidelijk en er is geen duidelijke pathologische verandering. Deze resultaten suggereerden dat er weinig verslechtering was veroorzaakt door de levering van NP's.

Evaluatie van bijwerkingen a lichaamsgewichten van vastgestelde H₂₂ xenotransplantaten in ICR-muizen tijdens therapie onder verschillende behandelingen. b Leverspecimens gekleurd HE waren op lichtmicroscopische observatie (400 ×)

PET–CT

Om het in vivo therapeutische effect van elke groep beter te kunnen vergelijken, ondergingen muizen CT, PET/CT-scan op dag 6 na behandeling. De fusiebeelden van CT en PET-scan worden weergegeven in Fig. 9. PET/CT is een efficiënte methode voor het weergeven van metabolische veranderingen tot en met ¹⁸ FDG-opnamedetectie [21]. As shown in CT scan (Fig. 9), the tumor volume of free CDDP plus Tet group and CDDP-Tet-loaded NPs group were comparable (Fig. 9a) but the tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group was significantly higher than NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Discussie

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.