Verbeterde antitumorale effectiviteit van Cisplatina-Tetradrine therapie via biocompatibele nanodeeltjes levering

Samenvatting

Combinatietherapie is een standaard strategie in de klinische tumorbehandeling. We hebben aangetoond dat de combinatie van Tetradrine (Tet) en Cisplatina (CDDP) een duidelijke synergistische antikanker activiteit vertoonde, maar onvermijdelijke bijwerkingen beperken hun therapeutische concentratie. Gezien de verschillende fysico-chemische en farmacokinetische eigenschappen van de twee geneesmiddelen, laidden we ze samen in een nanovoertuig door de verbeterde dubbele emulsie methode. De nanodeeltjes (NPs) werden bereid uit het mengsel van poly(ethyleenglycol)–polycaprolacton (PEG–PCL) en polycaprolacton (HO-PCL), zodat CDDP en Tet gelijktijdig in de NPs gelokaliseerd kunnen worden, wat resulteert in een lage interferentie en hoge stabiliteit. Beelden van fluorescemticroskopie onthulden de cellulaire opname van zowel hydrofiele als hydrofobe agenten afgeleverd door de NPs. In vitro studies op verschillende tumorcellen en tumorgeweven onthulden verhoogde tumorinhibitie en apoptose ratios. Wat de in vivo studies betreft, werden superieure antitumorale effectiviteit en verminderde bijwerkingen waargenomen in de NPs groep. Verder toonde ¹⁸FDG-PET/CT imaging aan dat NPs de metabole activiteiten van tumoren prominenter reduceren. Onze resultaten suggereren dat PEG–PCL blokcopolymer NPs een veelbelovende drager kunnen zijn voor gecombineerde chemotherapie met solide effectiviteit en geringe bijwerkingen.

Inleiding

Met de ontwikkeling van tumor comprehensieve therapie, spelen platina verbindingen een belangrijke rol in de behandeling van verschillende kankers, waaronder cisplatina (CDDP) breed klinisch gebruikt wordt. Tegenwoordig is CDDP nog steeds significant wanneer gecombineerd met tumor immunotherapie, met een gunstig effect op maligne tumoren zoals niet-kleincellige longkanker (NSCLC). Echter, deze chemotherapeutische agenten bereiken altijd antitumorale activiteit ten koste van ongewenste toxiciteit, dus therapeutische agenten die toxiciteit kunnen reduceren en de effectiviteit van chemotherapie kunnen verbeteren, zijn onophoudelijk verkend. Tetradrine (Tet) is een lid van de bis-benzylisoquinoline alkaloïde, met een bevredigend effect in sensibilisatie voor chemotherapie. Ons eerdere werk heeft aangetoond dat de combinatie van Tet en CDDP wel een duidelijke synergistische antikanker activiteit heeft door de expressie van chemotherapeutische agent geassocieerde genen te remmen, waaronder de excisie herstel cross-complementatie groep 1 (ERCC1), Thymidylate Synthase (TS), β-tubuline III, etc. Echter, de klinische toepassing van Tet lijdt onder zijn slechte wateroplosbaarheid en lage orale biobeschikbaarheid. Bovendien distribueert hydrofiel CDDP zich gemakkelijkst in de extracellulaire matrix (ECM), terwijl hydrofoob Tet lipide membranen kan penetreren en door cellen getransporteerd kan worden, dus kunnen de twee geneesmiddelen niet echt samenwerken. Daarom is het essentieel een manier te vinden die de twee geneesmiddelen effectief gelijktijdig kan afleveren, de antineoplastische effect verbetert met verminderde bijwerkingen.

Recente vooruitgang in het veld van nanotechnologie beheert nieuwe benaderingen voor diagnose en behandeling van kanker. Nanodeeltjes (NPs) geconstrueerd met amphiphiele copolymers, met name polyethyleenglycol (PEG), zijn bekend om hun vermogen om de adhesie van serumproteïnen te reduceren en opname door het reticulo-endotheliale systeem (RES) te voorkomen. Als gebruikt om hydrofobe geneesmiddelen te dragen, verhogen de nanodragers de oplosbaarheid tactvol en verlengen en verhogen de medicijn residentie in bloedsomloop en tumor. Met het klinische gebruik van copolymeer NPs, trekt de biocompatibiliteit van de NPs steeds meer aandacht. Recent onderzoek onthulde bijvoorbeeld dat sommige geïnjiceerde titaniumdioxide, silica en goud nanodeeltjes de intravasatie en extravasatie van kankercellen in diermodellen versnellen. NPs bereid van nanomaterialen met goede biocompatibiliteit en veiligheid, met name die goedgekeurd door FDA, zijn betere kandidaten voor geneesmiddelendragers.

Preliminair hebben we CDDP-geladen NPs en Tet-geladen NPs met behulp van polyethyleenglycol–poly(caprolacton) (PCL–PEG) weten te construeren, wier in vivo antitumorale effecten beide gedemonstreerd zijn. In deze studie gebruikten we PEG-PCL voor de co-levering van CDDP en Tet. Met een bijna neutrale lading vormt PEG de hydrofiele schil van een nanodeeltje, wat antigene epitopen verbergt en immunologische reactie voorkomt. Beelden van fluorescemticroskopie toonden aan dat de cellen zowel hydrofiele als hydrofobe agenten afgeleverd door de NPs kunnen opnemen. De resultaten van in vitro studies, niet alleen op verschillende tumorcellen, maar ook op tumorgeweven, onthulden dat CDDP-Tet NPs tumorgroei effectiever remmen dan de vrije geneesmiddelen. Bij in vivo onderzoek werden verhoogde antitumorale effectiviteit en verminderde bijwerkingen waargenomen in de NPs groep. Bovendien toonde ¹⁸FDG-PET/CT imaging de slechtste metabolisme snelheid van de tumor in de NPs groep, en daarmee de capaciteit van CDDP-Tet NPs om tumorgroei te vertragen.

Methoden

Materialen

Reagentia en Cellen

CDDP (moleculaire formule PtCl₂(NH₃)₂) werd gekocht van Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China). Tetradrine (moleculaire formule C₃₈H₄₂N₂O₆) werd verkregen als een poeder met een zuiverheid van > 98% van Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China). Methoxypolyethyleenglycol [MePEG; gewichtsgemiddelde molecuulgewicht (Mw = 4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] werd gedeshydrateerd door azeotrope destillatie met tolueen en daarna vacuüm gedroogd bij 50 °C gedurende 12 uur voor gebruik. ε-Caprolacton (ε-CL; Aldrich, VS) werd gezuiverd door drogen over CaH₂ bij kamertemperatuur gevolgd door destillatie onder verminderde druk. Polyvinylalcohol (PVA; polymerisatiegraad = 500, alcoholisatiegraad = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) en stannous octoaet (moleculaire formule SnCl2) (Sigma) werden zoals ontvangen gebruikt. RPMI 1640 medium (Gibco, VS), kalfserum (Lanzhou Minhai Bioengineering, China), en dimethylthiazoly-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT; Amersco, VS) werden zoals ontvangen gebruikt.

Humane goed gedifferentieerde maagkankercellijnen MKN₂₈, humane colorectale adenoomcellijnen LoVo, humane baarmoederhalskankercellijnen Hela, en muur hepatoma cellijn H₂₂ werden verkregen van Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China). Alle cellijnen werden gekweekt in RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% runderserum, penicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 g/mL), pyruvaat, glutaminen, en insuline bij 37 °C in een waterverzadigde atmosfeer met 5% CO₂.

Synthese van de Copolymeren

Zoals we eerder beschreven, werden mPEG–PCL en HO-PCL copolymeren gesynthetiseerd door een ringopening copolyme risatie. Kort gezegd, een vooraf bepaalde hoeveelheid ε-CL werd toegevoegd aan een polymerisatiebuis met PEG en een kleine hoeveelheid stannous octoaet (0,1% wt/wt). De buis werd vervolgens aangesloten op een vacuümsysteem, afgedicht, en in een oliebad bij 130 °C gedurende 48 uur geplaatst. Voor de synthese van HO-PCL copolymeren, werden een vooraf bepaalde hoeveelheid ε-CL en stannous octoaet toegevoegd aan een polymerisatiebuis zonder drogen. Na voltooiing van de polymerisatie, werden de ruwe copolymeren opgelost in chlorofoom en geprecipiteerd in een overmaat koud methanol om het ongereageerde monomeer en oligomeer te verwijderen. De neerslagen werden vervolgens gefiltreerd en meerdere keren met water gewassen voor volledig gedroogd bij verminderde druk.

Bereiding van CDDP-Tet-Geladen Nanodeeltjes

Een vooraf bepaalde hoeveelheid CDDP en Tet-geladen nanodeeltjes werden bereid door de dubbele emulsie (DE) methode. CDDP en Tet geëmulsioneerd met 1 mL dichloormethaan (DCM) oplossing bevattende 5 mg mPEG–PCL en 15 mg HO-PCL, door sonicatie gedurende 15 s (15 W) in een ijsbad (oplossing W1). Vervolgens werd 4 mL 3% (w/v) PVA oplossing W2 toegevoegd en 30 s gesonicteerd om een W1/O/W2 emulsie te maken. De dubbele emulsie werd verdeeld in 50 mL 0,3% (w/v) PVA waterige oplossing en DCM werd onder vacuüm verdampt. De verkregen nanodeeltjes werden verzameld, gewassen, en vriesgedroogd (Fig. 1).

Verbeterde antitumorale effectiviteit van Cisplatina-Tetradrine therapie via biocompatibele nanodeeltjes levering — Het schema van CDDP-Tet NPs bereiding

Geneesmiddel Laden Inhoud en Encapsulatie Efficiëntie

Om de geneesmiddel lading inhoud te bepalen, werd het vriesgedroogde CDDP–Tet-geladen NP poeder opgelost in dimethylformamide (DMF), en 30 L van deze oplossing werd gemengd met 30 L 2 mmol/L HCL gevolgd door de toevoeging van 2,94 mL 0,2 mmol/L SnCl₂ oplossing in 2 mmol/L HCL. De absorbantie bij 403 nm werd na 1 uur gemeten met referentie aan een calibratiecurve met behulp van een Shimadzu UV-1205 Spectrofotometer (Kyoto, Japan). Het totale bedrag van het geneesmiddel in de NPs kon dan berekend worden. De geneesmiddel lading inhoud en encapsulatie efficiëntie werden respectievelijk verkregen door Vergelijkingen (1) en (2):

$${\text{Geneesmiddel lading inhoud}}\, (\% ) = \frac{{{\text{Gewicht van het geneesmiddel in nanodeeltjes}}}}{{{\text{Gewicht van de nanodeeltjes}}}} \times 100\,(\% )$$ (1) $${\text{Encapsulatie efficiëntie }}\,(\% ) = \frac{{{\text{Gewicht van het geneesmiddel in nanodeeltjes}}}}{{{\text{Gewicht van het toevoegde geneesmiddel}}}} \times 100\,(\% )$$ (2)

In Vitro Cytotoxiciteit van de Nanodeeltjes en de Biocompatibiliteit Studie

Cellulaire Opname Studies

Op basis van ons eerdere werk, werden LoVo cellen geplaatst op het deksel van 6-porenplaat met ongeveer 5 × 10⁵ cellen per poort en geïncludeerd voor 24 uur (37 °C, 5% CO₂). NPs met rhodamine B (21 μg/mL) werden in de poren toegevoegd. Na incubatie gedurende 2 uur, werd de plaat gewassen met 4 °C en 37 °C PBS voor 3–4 keer elk. LoVo cellen op dekkerslipjes werden vervolgens onderwerp van fluorescemticroskopie.

Cytotoxiciteit Assay

De in vitro cytotoxiciteit van de geneesmiddelen werd bepaald door standaard MTT assays met behulp van MKN28 en H₂₂ cellijnen. Kort gezegd, cellen wurden gezaaid in een 96-puttenplaat bij een dichtheid van 5000 cellen per put 24 uur voor de assay. Vervolgens werden cellen blootgesteld aan een reeks doses van vrije CDDP, vrije Tet, vrije CDDP plus Tet en CDDP-Tet-geladen nanodeeltjes. Na incubatie, werd 20 μL 5 mg/mL MTT oplossing aan elke put toegevoegd en de plaat geïncludeerd voor 4 uur, waardoor de levende cellen de gele MTT in donkerblauwe formazan kristallen transformeren, die opgelost werden in 200 μL dimethylsulfoxide (DMSO). De optische dichtheid (OD) van elke put werd gemeten door een ELISA lezer (ELX800 Biotek, VS) met test en referentie golflengtes van 490 en 630 nm, respectievelijk. Cellevendbaarheid werd bepaald door de volgende formule:

$${\text{Cellevendbaarheid}}\,(\% ) = \frac{{{\text{OD (test put)}}}}{{{\text{OD (referentie put)}}}} \times 100\,(\% )$$ (3)

De in vitro compatibiliteit van de lege nanodeeltjes werd ook bepaald door MTT assays met behulp van MKN₂₈ en H₂₂ cellijnen. Alle resultaten verkregen uit MTT assays werden bevestigd door het experiment ten minste op drie onafhankelijke occasions te herhalen en driemaal te testen elke keer.

Apoptose Assay

Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystem, VS) werd gebruikt om de verandering van cel apoptose ratios te onderzoeken. MKN₂₈ cellen werden onderwerp van een 6 cm cultuurschaal voor 24 uur. Cultuurmedia werden vervangen door 1 μg/mL vrije CDDP, 1 μg/mL CDDP-geladen NPs, en 200 μg/mL lege NPs, respectievelijk. De controle groep werd vervangen door cultuurmedia zonder geneesmiddelen. Enzym werd toegevoegd na 48 uur kweek. De cellen werden vervolgens verzameld, 2 keer gewassen met PBS, en heropgelost in 100 μL buffer. Annexin V 5 μL en PI 1 μL werden om de beurt toegevoegd, gemengd, en 15 min bij kamertemperatuur zonder blootstelling aan licht gestaan. 400 mL buffer werd toegevoegd en onderging FCM (BD FACS CantoTM, VS) proces voor cel apoptose ratios analyse.

Histocultuur Geneesmiddel Respons Assay (HDRA)

De HDRA werd uitgevoerd volgens onze eerdere studies. Kort gezegd, mannelijke ICR muizen werden subcutaan in beide okselruimtes geïnjiceerd met 4–6 × 10⁶ H₂₂ cellen in fysiologisch zout. Toen de tumoren 400–600 mm³ in volume bereikten, werden de muizen gedood door cervicale dislocatie, en verse monsters bemonsterd, tweemaal gewassen in fysiologisch zout, ondergedompeld in Hank's oplossing, en verdeeld in stukken met gewichten van ongeveer 15 mg. De weefselmonsters werden in een 24-puttenplaat geplaatst waarin vierkante gelatine sponsen met afmetingen van 1 cm waren ondergedompeld in RPMI 1640 medium aangevuld met 20% foetale kalfserum en amikacine sulfaat (100 IE/mL) bevattende vrije CDDP of CDDP-geladen NPs bij twee verschillende concentraties. Vier tumor monsters werden geïncludeerd zonder enig geneesmiddel als controle. De weefsels werden vervolgens 7 dagen gekweekt bij 37 °C 5% CO₂. Een gemengde oplossing van Type I collagenaas (100 L, 0,6 mg/mL) en MTT (100 L, 5 mg/mL) in 100 mg/mL natrium succinaat werd toegevoegd. Na incubatie voor nog eens 24 uur, werd MTT formazan geëxtraheerd door 1 mL DMSO, en 100 L van de oplossing van elke put werd overgebracht naar de putten van een 96-putten microplaat. De OD van elke put in de microplaat werd gemeten met behulp van de ELISA lezer met test en referentie golflengtes van 490 en 630 nm, respectievelijk. De levendbaarheid van de weefsels werd berekend volgens de volgende formule (4):

$${\text{Weefsel levendbaarheid}}\,(\% ) = \frac{{{\text{OD (test)}/{\text{Gewicht (test)/mg}}}}{{{\text{OD (controle)}/{\text{Gewicht (controle)/mg}}}}} \times 100\,(\% )$$ (4)

In Vivo Antitumorale Effectiviteit

Tumor Volume Meting

Mannelijke ICR muizen met gewicht tussen 18 en 20 g werden geïmplanteerd met muur hepatoma cellijn H₂₂ en gebruikt om de relatieve effectiviteit van CDDP-Tet-geladen NPs te kwalificeren. Opgegroeid onder specifieke pathogen-vrije (SPF) omstandigheden, werden de muizen uitgevoerd in naleving van richtlijnen goedgekeurd door het Dieren Zorg Comité bij Drum Tower Hospital. 0,2 mL cel suspensie bevattende 4–6 × 10⁶ H₂₂ cellen werden subcutaan geïnjiceerd in de linker okselruimte van de muizen. De muizen werden verdeeld in 6 groepen: controle groep (fysiologisch zout), lege NPs groep, vrije CDDP (3 mg/kg) groep, vrije CDDP plus Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) groep, en CDDP-Tet-geladen NPs (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) groep. Elke groep bestond uit 6 muizen. Behandelingen begonnen na 7–8 dagen na implantatie, en de dag werd aangewezen als "Dag 0." Elk dier werd gewogen op het moment van behandeling zodat doseringen aangepast konden worden om de gerapporteerde mg/kg doses te bereiken. Dieren werden ook elke twee dagen gewogen gedurende het experiment.

Immunofluorescentie Assay

De tumor weefsels van de muizen in controle groep en die vrije CDDP plus Tet en CDDP-Tet NPs ontvingen, werden geselecteerd voor histologische observatie op de 21ste dag na behandeling. De tumoren werden gedissecteerd en vastgelegd in 10% neutraal gebufferde formaline, routinematig verwerkt in paraffin, gesneden bij een dikte van 5 mm. De weefselcoupes werden waargenomen onder een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop na de monsters gekleurd waren met (40,6-diamidino-2-fenylindole) (DAPI, blauw) en terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP knik eind labelen (TUNEL, groen).

¹⁸FDG-PET/CT Imaging

Muizen van vrije CDDP plus Tet groep en CDDP-Tet-geladen NPs groep ontvingen toen PET/CT imaging op dag 6 na behandeling. 4 uur vasten werden uitgevoerd voor tracer injectie. 14,8 MBq (400 lCi) van ¹⁸F-FDG werd via de staartvene geïnjiceerd als radiotracer. De beelden werden geproduceerd met een gecombineerde PET/CT scanner (Jemini JXL, Philips, VS). Hoog-resolutie PET beelden en hetzelfde CT zichtveld werden verkregen met de muizen 45 min na de administraatie van ¹⁸F-FDG. PET beelden werden gecorrigeerd voor attenuatie en verstrooiing op basis van de CT data. De beeldfusie werd uitgevoerd door een automatisch beeldfusie systeem, met leverancier geleverde software. Maximale FDG opname waarden in de tumor werden verkregen voor de standaard opname waarde (SUV) berekeningen, met correcties voor lichaamsgewicht en geïnjiceerde activiteit.

Statistische Methoden

Statistische analyses van data werden gedaan met behulp van Student's t toets. De data worden vermeld als gemiddelde ± SD, en waarden van P < 0,05 werden geaccepteerd als een statistisch significant verschil.

Resultaten

Copolymeer Synthese en Karakterisering

Volgens onze eerdere studie, synthetiseerden we de NPs met PEG–PCL en HO-PCL (de optimale verhouding was 1:3). De diameter, polydispersiteit, getal-gemiddeld molecuulgewicht (Mn), en gewichtsgemiddeld molecuulgewicht (Mw) van de optimale PEG–PCL copolymeer NPs zijn getoond in Bijlage 1: Tabel S1. Toen geladen met CDDP en Tet, werden geneesmiddel lading inhoud en encapsulatie efficiëntie ook gemeten (Bijlage 1: Tabel S2), wat vergelijkbaar is met die van CDDP-geladen PEG–PCL copolymeer NPs. Echter, de geneesmiddel lading inhoud en lading efficiëntie van Tet zijn minder dan die van Tet-geladen PEG–PCL copolymeer NPs, wat te maken kan hebben met HO-PCL componenten.

Door dynamische lichtverstrooiing (DLS), was de diameter van CDDP-Tet-geladen PEG–PCL copolymeer NPs 359,1 ± 5,3 nm met een polydispersiteit van ongeveer 0,231. Toen waargenomen door TEM en AFM (Bijlage 1: Fig S1a en S1b), presenteerden de NPs regelmatige spherische vorm en gelijke maten die overeenkomen met de data van DLS. Ook worden kleine druppels verdeeld in de nanodeeltjes, wat bevestigt dat nanodeeltjes inderdaad de structuur van dubbele emulsie zijn.

Cellulaire Opname van CDDP-Tet-Geladen NPs

Deeltjes geladen met fluorescente kleurstoffen zijn toegepast als een veelvoorkomende methode om cellulaire opname te verkennen, wat visuele en real-time detectie realiseert. We hebben aangetoond dat de kleurstof-geladen NPs de cellen kunnen binnendringen door endocytose. In deze studie is rhodamine-B hydrofiel en kan worden gedetecteerd in PI fluorescente kanaal, die gebruikt worden om CDDP te simuleren. Als de simulatie van Tet, is coumarine-6 hydrofoob, wiens signaal kan worden ontvangen in de FITC fluorescente kanaal. Na 2 uur co-incubatie met NPs geladen met coumarine-6 en rhodamine-B, werden LoVo cellen gedetecteerd door fluorescemticroskopie en optische lens (200 ×). Zoals te zien in Fig. 2, kunnen fluorescente signalen worden gedetecteerd in PI fluorescente kanaal, de FITC fluorescente kanaal, alsook de PI/FITC dubbele fluorescente kanaal. De resultaten bevestigden dat de NPs zowel coumarine-6 als rhodamine-B naar tumorcellen tegelijkertijd kunnen dragen, waaruit we kunnen afleiden dat CDDP en Tet in de NPs geladen kunnen worden en door tumorcellen gelijktijdig geabsorbeerd kunnen worden.

In Vitro Cytotoxiciteit van de Nanodeeltjes

De cytotoxiciteit van vrije CDDP, vrije Tet, vrije CDDP plus Tet, en CDDP-Tet-geladen NPs werden vergeleken in maagcellijnen MKN28. De concentratie van Tet was 2,4 keer zoveel als de concentratie van CDDP. Zoals getoond in Fig. 3, was de cytotoxiciteit van CDDP-Tet-geladen NPs het meest krachtig onder de vier groepen. Het verschil in cytotoxiciteit tussen vrije Tet en de NPs groep en drie andere vrije-geneesmiddelen groep werd prominent met de toename van de concentratie. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in humane baarmoederhalskankercellen Hela en hepatocellulaire carcinoom cellen H₂₂ (Bijlage 1: Fig S2a, S2b).

Toxiciteitsstudie van lege NPs is in ons eerdere werk uitgevoerd. In de eerdere studie had de lege NPs weinig toxiciteit op tumorcellijnen, wat aangeeft dat lege NPs van bevredigende biocompatibiliteit zijn.

In Vitro Apoptose Analyse van CDDP-Tet-Geladen NPs

We maatten de impact van 1 μg/mL vrije CDDP, 2,4 μg/mL vrije Tet, vrije CDDP plus Tet (1 μg/mL + 2,4 μg/mL), en CDDP-Tet-geladen NPs (1 μg/mL + 2,4 μg/mL) op apoptose ratio van MKN28 cellen na 48 uur co-cultuur. Cel apoptose ratio werd berekend als Q2 + Q4 (getoond in Fig. 4). De verandering van cellen apoptose ratios was vergelijkbaar tussen vrije CDDP plus Tet, vrije CDDP, en vrije Tet groepen (Fig. 4a–c). Echter, de apoptose ratio van MKN28 cellen geïnduceerd door CDDP-Tet-geladen NPs was significant hoger dan de drie andere groepen (Fig. 4d).

Histocultuur Geneesmiddel Respons Assay (HDRA)

Om de antitumorale effectiviteit van de NPs uitgebreider te evalueren, evalueerden we antitumorale effecten van vrije CDDP, vrije CDDP plus Tet, en CDDP-Tet-geladen NPs op H₂₂ cellijnen met behulp van HDRA. Als een klinische methode om chemosensitiviteit te voorspellen, simuleert HDRA praktische omstandigheden van tumorgeweven authentieker dan cytologische experimenten, wier resultaten beïnvloed kunnen worden door de micro-omgeving en microstructuur van het tumorgeweefsel zoals penetratie van geneesmiddel, de extracellulaire pH waarden, interstitiële vloeistofdruk, etc.

De concentratie van Tet is 2,4 keer zoveel als de concentratie van CDDP. Zoals getoond in Fig. 5, bij de laagste concentratie, was het antitumorale effect van vrije CDDP en Tet groep beter dan die van CDDP, doch de effecten waren vergelijkbaar met de toename van de geneesmiddel concentratie. In overeenstemming met apoptose analyse, hadden CDDP-Tet-geladen NPs een aanzienlijk betere antitumorale effect onder de drie groepen bij alle geteste concentraties.

In Vivo Antitumorale Effectiviteit Analyse

Effectiviteit en Bijwerking Evaluatie

Muur modellen gevormd door H₂₂ cellijn enting werden behandeld met 3 mg/kg vrije CDDP, vrije CDDP samen met Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), CDDP-Tet-geladen NPs (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), respectievelijk. Tumor werden verkregen 12 dagen na geneesmiddel behandeling. Tumor maten werden elke 2 dagen gedetecteerd om de meest optimale inhoud van geneesmiddel levering te bepalen. Zoals getoond in de tumorgroei curve (Fig. 6), was de tumorgroei trend van de controle groep alsook de lege nanodeeltjes groep vergelijkbaar maar er bestond prominente inhibitie van tumor in de andere drie groepen met geneesmiddel levering. In vergelijking met vrije CDDP groep, toonde vrije CDDP plus Tet groep betere antitumorale effectiviteit tijdens de eerste 6 dagen. Echter, na 6 dagen, begon het verschil in tumorinhibitie ratio tussen de twee groepen te vernauwen en na 10 dagen had vrije CDDP plus Tet zelfs slechtere antitumorale effect.

Tijdens de eerste 6 dagen, waren de antitumorale effecten van de vrije CDDP plus Tet en CDDP Tet-geladen NPs groepen vergelijkbaar. Daarom toonden muizen die CDDP-Tet-geladen NPs ontvingen betere antitumorale effectiviteit sinds dag 6 na behandeling. Bijlage 1: Figuur S3a toont verschillende tumor maten van elke groep. Het tumorvolume van CDDP-Tet-geladen NPs groep was het kleinst, wat beschouwd kan worden als de directe weerspiegeling van prominente antitumorale effect. Naast de tumorinhibitie capaciteit, in vergelijking met vrije CDDP of vrije CDDP plus Tet groep, waren er minder bloedvaten gelegen op het oppervlak van de tumor). Vergelijkbaar, zoals getoond in Bijlage 1: Figuur S3b, was de vasculaire dichtheid de laagst in de NPs groep ten opzichte van de controle groep en vrije CDDP plus Tet groep.

Om de ratio van apoptotische cellen in tumor weefsel in vivo verder te onderzoeken, werd TUNEL assay uitgevoerd voor de detectie van apoptotische cellen. Zoals getoond in Fig. 7, kunnen de apoptotische cellen in tumoren gekleurd worden met groene fluorescente om apoptose aan te duiden. De samengevoegde beelden tonen minder groene fluorescente regio's in de controle groep en de Vrije CDDP plus Tet groep, wat duidt op de aanwezigheid van minder apoptotische cellen. Bovendien werden een groot aantal groene fluorescente regio's waargenomen in de groep behandeld met CDDP-Tet NPs, wat duidt op een grote hoeveelheid apoptotische cellen. De resultaten bevestigden dat CDDP-Tet NPs tumor apoptose in vivo kunnen bevorderen.

Naast betere antitumorale effectiviteit dan vrije CDDP en vrije CDDP plus Tet groep, toonden de CDDP-Tet-geladen NPs ook minder bijwerkingen. Zoals getoond in Fig. 8a, veroorzaakten vrije CDDP en vrije CDDP plus Tet significante gewichtsverlies in vergelijking met controle groep, wat de toxiciteit met directe geneesmiddel levering aangeeft. De gewichtsverandering curve van de lege NPs groep was vergelijkbaar met die van de controle groep, wat suggereert dat de toxiciteit van de lege NPs genegeerd kon worden. Het gewichtsverlies veroorzaakt door CDDP-Tet-geladen NPs en controle groepen waren vergelijkbaar tijdens de eerste 6 dagen. Van dag 6 tot dag 12, waren muizen gewichtsniveaus in NPs groep lichtjes lager dan die in de controle groep, maar hoger dan vrije CDDP of vrije CDDP plus Tet groep. Het is opmerkelijk dat vrije CDDP plus Tet groep bijdroeg aan duidelijke gewichtsverlies en de eetlust van muizen verminderde tijdens de eerste 4 dagen, wat aangeeft dat de absorptie van geneesmiddelen schadelijk was voor het hele lichaam. In tegenstelling, kunnen CDDP-Tet-geladen NPs langzaam in weefsels vrijgekomen worden en de concentratie op een stabiel niveau handhaven; daarom waren de bijwerkingen duidelijk verlaagd in vergelijking met directe geneesmiddel levering. Vervolgens werden bijwerkingen van de behandeling ook geëvalueerd door leverbiopsie (Fig. 8b). In vergelijking met de controle groep, is de grens tussen de levercellen van de dubbele-geneesmiddel naakte geneesmiddel groep vervaagd, sommige levercellen hebben ballonachtige veranderingen, cel lichamen krimpen, kernpyknose, en verhoogde eosinofilie (gele pijl), terwijl de dubbele-geneesmiddel nanodeeltjes groep. De structuur van stamcellen is normaal, de intercellulaire ruimte is duidelijk, en er is geen duidelijke pathologische verandering. Deze resultaten suggereerden dat er weinig schade veroorzaakt werd door NPs levering.

PET–CT

Om de in vivo therapeutische effecten van elke groep beter te vergelijken, ondergingen muizen CT, PET/CT scan op dag 6 na behandeling. De fusie beelden van CT en PET scan worden getoond in Fig. 9. PET/CT is een efficiënte methode in weerspiegeling van metabole veranderingen door ¹⁸FDG opname detectie. Zoals getoond in CT scan (Fig. 9), was het tumorvolume van vrije CDDP plus Tet groep en CDDP-Tet-geladen NPs groep vergelijkbaar (Fig. 9a) maar de tumor metabolisme snelheid in vrije CDDP plus Tet groep was significant hoger dan NPs groep (Fig. 9b). De verminderde intensiteit op de tumorplaats van de muis die CDDP-Tet-geladen NPs ontving, symboliseerde slechte metabolisme snelheid van de tumor, en daarmee de capaciteit van NPs om tumorgroei te vertragen.

Discussie

Gezien de heterogeniteit en complexiteit van tumor, is combinatietherapie een standaard strategie geworden in de klinische behandeling van tumor. Niettemin, eenvoudige combinatie van twee individuele therapeutica kan niet noodzakelijk het verwachte effect bereiken vanwege de verschillende fysico-chemische en farmacokinetische eigenschappen van de twee geneesmiddelen. Om verschillende geneesmiddelen aan tumorcellen in een synergistische verhouding te leveren, is een combinatietherapie voertuig ontworpen in deze studie. CDDP is hydrofiel terwijl Tet hydrofoob is, wat problemen veroorzaakt voor de lading methode. In deze studie gebruikten we het amphiphiele copolymeer met PCL als hydrofoob kern en PEG als hydrofiele kroon. Door de verbeterde dubbele emulsie methode, bevond Tet zich in de olie laag en CDDP in de water laag, de unieke structuur verleent de NPs de capaciteit tot gelijktijdige encapsulatie van Tet en CDDP om NPs te vormen. CDDP en Tet zijn in verschillende lagen van NPs gelokaliseerd, wat resulteert in lage interferentie en hoge stabiliteit.

Het combinatietherapie voertuig geladen met CDDP en Tet kan de effectiviteit van CDDP-Tet combinatie verbeteren. Niet alleen in de cellulaire experimenten, CDDP-Tet NPs remmen ook significant tumor weefsel levendbaarheid in de HDRA assays, wat de anti-tumor effect van de NPs in het model bevestigt dat rekening houdt met tumor micro-omgeving. Wat de in vivo studie betreft, werd antitumorale effectiviteit waargenomen in tumor volume verandering, wat aangaf dat CDDP-Tet NPs effectief tumorgroei onderdrukten met lagere proliferatie niveau. ¹⁸FDG-PET/CT imaging onthulde dat de glucose metabolisme van de tumoren in de CDDP-Tet groep meer prominent en vroeger geremd werd door het induceren van hogere apoptose niveau van tumoren, wat bevestigd werd in de immunofluorescentie assays. In vergelijking met vrije CDDP plus Tet, zijn CDDP-Tet NPs sneller en veiliger effectief, wat kan worden verklaard door de drie mechanismen als volgt.

Eerstens, als een lipide-oplosbaar geneesmiddel, kan Tet moeilijk in de ECM distribueren en daarom zelden rond tumorcellen diffunderen. Gelokaliseerd in de olie fase van NPs, wordt Tet voorzien van betere oplosbaarheid en biobeschikbaarheid, bereikt de tumorplaatsen in dezelfde synergistische verhouding als CDDP. Verder, CDDP, dat systeemische bijwerkingen had, eenmaal gedragen door het nanodeeltje, kan gemakkelijk het interstitium van tumorweefsels bereiken via lekkende tumorbloedvaten en binnen de tumor gehouden worden vanwege druk gemaakt door gebrek aan lymfatische afvoer. Hoe meer CDDP tumorweefsels vasthouden, hoe minder schade aan normale organen gedaan wordt. Als resultaat van passieve targeteringsstrategieën, zijn CDDP-Tet NPs veel veiliger dan vrije CDDP plus Tet, wat waargenomen kan worden in de muizen gewichtsveranderingen en leverbiopsies.

Medicijn resistentie wordt beschouwd als een van de grootste uitdagingen in kankerbehandeling, niet alleen vanwege genetische veranderingen op het niveau van een enkele cel, maar ook door tumorweefsels en micro-omgeving. Aan de ene kant is Tet alkalisch, dus het wordt geprotonneerd in de zuur tumor micro-omgeving en kan dus de elektronegatieve tumor cytomembranen niet kruisen, wat pH-geïnduceerde fysiologische medicijn resistentie wordt genoemd. Aan de andere kant, grote afstanden tussen bloedvaten in solide tumoren en hoge interstitiële vloeistofdruk dragen bij aan beperkte distributie van CDDP en Tet. Gedragen door het nanovoertuig, kan Tet tumorcellen binnendringen via endocytose zonder invloed van tumor micro-omgeving, de pH-geïnduceerde fysiologische medicijn resistentie overwinnend. De kleine grootte van nanodragers stelt hen in staat om tumor vasculatuur te binnendringen en preferentieel te accumuleren op de tumorplaats in vivo.

Samengevat, vertegenwoordigt deze studie een voorbeeld van het leveren van een chemotherapeutisch geneesmiddel samen met een chemosensitizer gelijktijdig. Gedragen door de NPs, worden beide geneesmiddelen passief naar de tumorplaats gericht, wat systemische toxiciteit reduceert. Bovendien bieden NPs een oplossing voor fysiologische medicijn resistentie door de chemosensitizer sneller en meer in tumorcellen te laten binnendringen, wat een belangrijke rol speelt in het verbeteren van de effectiviteit van tumor chemotherapie. Daarom geloven we dat deze PEG–PCL blokcopolymeer NPs een veelbelovende drager kunnen zijn voor gecombineerde chemotherapie.

Conclusies

Gebaseerd op onze eerdere studies, onderzocht dit artikel de toepassing van PEG–PCL/HO-PCL NPs voor levering van de combinatie van twee geneesmiddelen met verschillende fysico-chemische eigenschappen. Voor in vitro studies, toonden NPs superieure antitumorale effect met grote biocompatibiliteit. Verbeterde antitumorale effectiviteit werd waargenomen in tumor volume verandering en ¹⁸FDG-PET/CT Imaging wat in vivo studie in muur model betreft. De muizen in NPs groep toonden ook verminderde bijwerkingen. Bovendien werd de apoptose ratio van tumorcellen bevorderd door NPs in zowel in vitro als in vivo studies. Samengevat, deze blokcopolymeer NPs kunnen een veelbelovende drager zijn voor de levering van Cisplatina–Tetradrine combinaties en andere combinaties, met verbeterde antitumorale effect en verminderde toxiciteit, voor de behandeling van kanker.