Verbetering van de biocompatibiliteit van polyaniline/polylactaat nanovezelgerustes door gecontroleerde oppervlaktemorfologie via anorganische zuur doping

Samenvatting

Geleidende en afbreekbare nanovezelgerustes hebben groot potentieel om celdeling, -groei en -differentiatie onder een extern elektrisch veld te bevorderen. Hoewel het probleem van inferieure elektrische geleiding in lichaamsvloeistoffen nog steeds bestaat, kunnen polyaniline (PANI)-gebaseerde afbreekbare nanovezels celdheching, -groei en -proliferatie bevorderen. Om te onderzoeken of het effect wordt veroorzaakt door de PANI-morfologie, selecteerden we drie anorganische zuren als dopanten in het proces van PANI in situ oxidatieve polymerisatie: chloorwaterstofzuur, zwavelzuur en perchloorzuur. De verkregen polyaniline/polylactaat (PANI/PLA) composiet nanovezels werden gekarakteriseerd via SEM, FTIR en XPS analyse, en we bevestigden dat de PLA nanovezels met succes werden bekleed door PANI zonder enige verandering in de poreuze structuur van de PLA nanovezels. De in vitro mechanische eigenschappen en afbreekbaarheid gaven aan dat de oxidatie van zuur dopanten in aanmerking moet worden genomen en dat het waarschijnlijk een hogere oxidatieve degradatie effect heeft op PLA nanovezels. De contacthoektest toonde aan dat PANI/PLA composiet nanovezels met verschillende oppervlaktemorfologieën een goede benettingsbaarheid hebben, wat impliceert dat ze voldoen aan de eisen van botweefseltechnische gerustes. De oppervlakteruwigheid en celvitaliteit toonden aan dat verschillende PANI-morfologieën op het oppervlak celproliferatie kunnen bevorderen. Hoe hoger de oppervlakteruwigheid van het PANI, hoe beter de biocompatibiliteit. Gevolgd heeft de gereguleerde oppervlaktemorfologie van PANI/PLA composiet nanovezels via verschillende zuren doping een positief effect op biocompatibiliteit in weefseltechniek.

Inleiding

Extracellulaire matrix (ECM) is een type macromoleculair netwerk dat door cellen in de extracellulaire stroma wordt gesecreteerd. Het vormt de basis van cellen, weefsels en organen, vergezeld van organen, en wordt gekenmerkt door een complexe roosterstructuur. Bovendien biedt het een geschikte plek voor het overleven en de activiteit van cellen, bepaalt hun vorm, controleert hun differentiatie, neemt deel aan hun migratie en metabolisme, en beïnvloedt uiteindelijk hun overleven, groei en dood. Elektrospinnen nanovezels kunnen de werking van extracellulaire matrix nabootsen om celgedrag te reguleren vanwege hun hoge specifieke oppervlakte, geschikte mechanische eigenschappen en biologische afbreekbaarheid. Daarnaast kunnen elektrospinnen nanovezels multifunctioneel zijn door oppervlaktemodificatie op basis van het behoud van de poreuze structuur. Daarom zijn elektrospinnen nanovezels een veelbelovend kandidaatmateriaal in weefseltechniek, wat breed wordt toegepast in geneesmiddelafgifte, orthopedische regeneratie, zenuwregeneratie en herstel.

Geleidende polymeren (bijv. polypyrrole [PPy], polythiofeen [PTH] en polyaniline [PANI]) hebben goede in vitro en in vivo biocompatibiliteit, wat celdheching, -proliferatie en -differentiatie alsook weefselregeneratie aanzienlijk kan beïnvloeden. Onder deze geleidende polymeren wordt PANI beschouwd als een potentieel materiaal voor weefseltechniek en regeneratieve geneeskunde vanwege de goede verwerkbaarheid, uitstekende geleiding, goede redox stabiliteit en biocompatibiliteit. Onder elektrische stimulatie kan PANI celdheching, -proliferatie, -migratie en -differentiatie reguleren. In feite hebben talloze rapporten geconcludeerd dat PANI-gebaseerde geleidende afbreekbare composiet nanovezels celgedrag onder een elektrisch veld bevorderen. Dit impliceert echter een cruciaal probleem dat de geleiding van PANI in fysiologische omgeving (pH = 7,4) zal worden verzwakt door PANI dedoping, wat, zoals eerdere studies hebben aangetoond, de elektrische activiteitsvoordelen van het bevorderen van celproliferatie en -differentiatie vermindert. Hoewel dit duidelijk een beperking van PANI-gebaseerde geleidende afbreekbare nanovezels in botweefseltechniek onder externe elektrische stimulatie presenteert, kunnen ze nog steeds celproliferatie en -groei in een grote mate bevorderen. Hier spekuleren we dat de oppervlaktemorfologie van PANI de ruwheid van de composiet nanovezels verhoogt, wat gunstig is voor celdheching, -groei en -proliferatie.

Polyaniline gedopt met anorganische zuren heeft doorgaans goede elektrische geleiding. Echter, de anionen geïntroduceerd door verschillende anorganische zuur dopanten zullen de geleiding en structuur van polyaniline beïnvloeden. In dit artikel zijn drie gangbare anorganische zuren, nl. chloorwaterstofzuur (HCl, HZ), zwavelzuur (H₂SO₄, ZZ) en perchloorzuur (HClO₄, PZ), geselecteerd als de dopanten in een PANI in situ oxidatieve polymerisatie. Vervolgens werden de mechanische eigenschappen, benettingsbaarheid, oppervlaktemorfologie, biocompatibiliteit en celdheching van PANI/polylactaat (PLA) nanovezels onderzocht onder verschillende zuur dopanten. De resultaten gaven aan dat hoe hoger de oppervlakteruwigheid van het PANI, hoe beter de celproliferatie, wat betere biocompatibiliteit aantoont.

Methoden/Experimenteel

Chemicaliën

Aniline (AN) werd gekocht bij Sigma, PLA (Mw = 60.000) werd gekocht bij Solarbio, dichloormethaan (DCM) werd gekocht bij Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., en N, N-dimetylformamide (DMF) werd gekocht bij Macklin. Tegelijkertijd werd ammoniumpersulfaat (APS) gekocht bij Aladdin, HCl en H₂SO₄ werden gekocht bij Guangzhou Chemical Co., Ltd., en HClO₄ werd gekocht bij Macklin.

Voorbereiding van Polyaniline/Polylactaat Nanovezels

Fabricage van Elektrospinnen Polylactaat Nanovezels

PLA deeltjes met een specifieke massa werden toegevoegd aan een gemengde oplossing van DCM en DMF (volume verhouding 7:3) voordat ze werden gerold tot ze oplosten, en een gemengde oplossing van 10% PLA werd verkregen. De PLA oplossing werd vervolgens in een spuit gedoseerd en verbonden met een hoge-spanningsvoeding. De elektrospinnen machine (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) werd ingesteld met een spanning van 15 kV en op een afstand van 15 cm. De verkregen PLA nanovezels werden vacuümgedroogd overnacht bij 40 °C.

Voorbereiding van Polyaniline/Polylactaat Nanovezels Gedopt met Verschillende Anorganische Zuren

De PLA nanovezels werden in de plasma reinigingsmachine kamer (PCE-6, MTI Corporation, USA) geplaatst en 2 min ontladen bij 30 W RF vermogen. In dit artikel werden drie gangbare anorganische zuren, nl. HCl, H₂SO₄ en HClO₄, gebruikt als dopanten voor in situ oxidatieve polymerisatie in de bereiding van PANI/PLA nanovezels, en de overeenkomstige PANI nanovezels werden gemarkeerd als PANI-HZ, PANI-ZZ en PANI-PZ, respectievelijk, terwijl de PANI/PLA nanocomposit nanovezels werden gelabeld als PANI/PLA-HZ, PANI/PLA-ZZ en PANI/PLA-PZ, respectievelijk. Het bereidingsproces van PLA en PANI/PLA composiet nanovezels wordt getoond in Fig. 1.

Schema van het bereidingsproces van PLA en PANI/PLA composiet nanovezels

PANI/PLA nanocomposit nanovezels werden onder ijsbadcondities bereid. De APS en AN werden toegevoegd aan een 1 M zuuroplossing volgens een molaire verhouding van 1:1. Hier nemen we HCl als voorbeeld om het bereidingsproces van PANI/PLA nanovezels te illustreren. Onder ijsbadcondities werd de AN (930 mg, 0,01 mol) druppelgewijs toegevoegd aan APS (2.280 mg, 0,01 mol) en opgelost in 50 mL 1 M HCl. Onmiddellijk werd de PLA nanovezelmembraan behandeld met plasma in de oplossing gedompeld en 2 uur gerold bij 0 °C. Na de reactie werd de PLA nanovezelmembraan meerdere keren gewassen met HCl en ethanol om de niet-gehechte PANI te verwijderen voordat ze overnacht bij 40 °C werden gedroogd om PANI/PLA-HZ nanovezels te verkrijgen, die voor later gebruik bewaard werden. De PANI/PLA-ZZ en PANI/PLA-PZ composiet nanovezels werden verkregen volgens een vergelijkbare aanpak.

Karakterisatie

De unaxiale trektests voor de PLA nanovezels en PANI/PLA composiet nanovezels werden uitgevoerd via een rek-spanningstest (Shimadzu AGX-PLUS, Japan). Hier werd het monster in een hamerhoofdvormig formaat gesneden, met de treksnelheid constant gehouden op 3 mm/min. Young's modulus werd berekend uit het 0-15% rek lineaire gebied in de spanning-rekcurve, en de treksterkte en breuktrekverhouding van de curve werden bepaald uit de breuk van het nanovezelmembraan.

De morfologie van de nanovezelgerustes werd gekarakteriseerd via veldemissie scanning elektronenmicroscopie (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japan) om de verschillende morfologieën van de PANI gedopt met verschillende anorganische zuren te observeren. Voor de SEM observatie werden de nanovezelmonsters 60 s met goud besproeid om duidelijke observatie van de morfologie te ermöglichen. Tegelijkertijd werd de oppervlakteruwigheid van de PANI/PLA composiet nanovezels gemeten met atoommicroscopie (AFM, Bruker Dimension Edge). Om te bevestigen dat PANI volledig op de PLA nanovezels was geladen, werd Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) gebruikt om de golflengteverandering van 2000 ~ 500 cm⁻¹ te meten. Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS; Thermo ESCALAB 250) en Al-Kα werden gebruikt als de Röntgenemissiebronnen om de oppervlaktesamenstelling van de PANI/PLA nanovezels verder te bepalen, terwijl hun benettingsbaarheid werd gemeten in termen van de contacthoek van waterdruppels bij kamertemperatuur via contacthoekanalyse (OCA 15 plus, Duitsland). De degradatie van de nanovezels werd geëvalueerd met een massaverliesmethode. De nanovezelmembranen werden in 16-mm schijven gesneden en in 20 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een pH van 7,4 geplaatst voordat de gerustes geïncubeerd werden bij 37 °C gedurende 7, 14 en 21 dagen en gedroogd tot constant gewicht.

Biocompatibiliteit van PANI/PLA Composiet Nanovezelgerustes

Biocompatibiliteit

In dit artikel werd de biocompatibiliteit van PANI/PLA composiet nanovezelgerustes gekarakteriseerd door een humaan osteosarcocoma (HOS) celactiviteit experiment. HOS cellen werden gekocht van de celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai. De HOS cellen werden gekweekt in laag-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevattend 10% foetale kalfserum, 100 U/mL penicilline en 100 U/mL streptomycine voordat ze geïncubeerd werden bij 37 °C en 5% CO₂. Toen de celding een fusiegraad van 90% bereikte, werden de cellen doorgegeven met een verhouding van 1:3.

De HOS cellen moesten op de PANI/PLA nanovezels gezaaid worden voor de celproliferatietest. Hier werden de nanovezels in een 96-puttenplaat geplaatst zodat ze de bodem van de plaat volledig bedekten voordat ze gesteriliseerd werden via UV gedurende 30 min en via een 75% ethanoloplossing gedurende 30 min. Vervolgens werden ze gewassen met PBS. De nanovezels werden vervolgens geïnculeerd met een dichtheid van 1 × 10⁴ per put, terwijl een blanco groep en een controlegroep gelijktijdig werden ingesteld. De cellen werden vervolgens geïncubeerd in een celincubator bij 37 °C gedurende één, drie en vijf dagen, met het medium elke twee dagen ververst.

Celvitaliteit van de PANI/PLA nanovezels werd geëvalueerd met een 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) assay. Na incubatie van één, drie en vijf dagen, werd het medium uit de 96-puttenplaat verwijderd en driedeelmaals gewassen met PBS voordat 1 mL DMEM met 10% 5 mg/mL MTT werd toegevoegd. Het medium werd vervolgens geïncubeerd bij 37 °C gedurende 4 uur en daarna verwijderd voordat DMSO werd toegevoegd om het methylprednisolon op te lossen. Het medium werd 10 min getrild, en vervolgens werd de absorbantie bepaald (BioTek Synergy HTX, VS).

Fluorescent Immunokleuring

De HOS cellen werden 24 uur in de PANI/PLA nanovezelincubator geïncubeerd en driedeelmaals gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyd gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De gefixeerde cellen werden driedeelmaals gewassen met PBS (10 min elk) en 10 μL van 100 nM FITC-gemarkeerd peptide werd toegevoegd voordat de cellen 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd werden en vervolgens driedeelmaals gewassen met PBS (5 min elk). Het extracellulaire actine van de HOS cellen werd gekleurd, met confocal microscopie (Type A1, Nikon, Japan) gebruikt om de celkleuring te observeren bij een 20× vergroting.

Celdheching

De heching van de HOS cellen op de PANI/PLA composiet nanovezelgerustes werd waargenomen via SEM. Hier werd het kweekmedium verwijderd na de 24-uurs PANI/PLA nanovezel HOS celkweek en vervolgens driedeelmaals gewassen met PBS voordat 4% PFA werd toegevoegd. Het medium werd overnacht bij 4 °C gefixeerd, driedeelmaals gewassen met PBS, gedeshydrateerd met een gradient ethanoloplossing (30%, 50%, 70%, 85%, 90% en 100%, respectievelijk; 20 min elk), en vervolgens 24 uur vriesgedroogd. Voor de SEM observatie werden de nanovezels 120 s met platina besproeid om betere observatie toe te staan.

Alkalische Fosfatase Activiteit (ALP)

ALP is een van de veelgebruikte vroege osteoblaast differentiatie markers die afhangen van alkalische fosfatase enzym expressie. Hier werd ALP activiteit uitgevoerd met behulp van de ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S). De HOS cellen werden gekweekt op verschillende PANI/PLA composiet gerustes voor de aangewezen 7 dagen. De cellen werden gelyseerd met 50 μL Tris-HCl (0,1 M, pH 8) met 0,1% (v/v) triton X-100. De ALP activiteit wordt geanalyseerd door de concentratie van p-nitrofenol van p-nitrofenylfosfaat (PNPP) te kwantificeren, wat wordt geschat door de absorbantie op 405 nm op te nemen. Het percentage ALP activiteit van de cellen gekweekt langs de PANI/PLA nanovezels wordt berekend door de ALP activiteit van de cellen gekweekt op zuivere PLA nanovezels te vergelijken.

Statistische Analyse

De statistische significantie van de resultaten werd beoordeeld via eénrichtings variantieanalyse (ANOVA) met GraphPad Prism (versie 8.02). Hier werden de verschillen in mechanische eigenschappen, in vitro biologische afbreekbaarheid en celvitaliteit tussen de verschillende PANI/PLA composiet nanovezelgerustes geanalyseerd. De resultaten werden als significant beschouwd wanneer p < 0,05 (∗) en zeer significant wanneer p < 0,005 (∗∗).

Resultaten en Discussie

De mechanische eigenschappen van weefseltechnische gerustes zijn belangrijke indicatoren in de evaluatie of de gerustes vloeistofdynamica kunnen weerstaan. De aanwezigheid van anorganische zuren kan de fysieke en chemische eigenschappen van de PLA matrix van PANI/PLA composiet nanovezels in het in situ chemische oxidatie polymerisatieproces van PANI beïnvloeden. Daarom is het verkennen van de mechanische eigenschappen van PANI/PLA composiet nanovezels gedopt met anorganische zuren noodzakelijk. Hier werden de mechanische eigenschappen van PANI/PLA composiet nanovezels geëvalueerd via een trektest, wat getoond wordt in Fig. 2, inclusief spanning-rek, Young's modulus, treksterkte en rek bij breuk. Zoals getoond in Fig. 2a, vertoonden de PLA nanovezels lineair elastisch gedrag, en de PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-ZZ composiet nanovezels vertoonden duidelijke vloeigedrag, terwijl de PANI/PLA-PZ composiet nanovezels direct braken na elastische deformatie. De Young's modulus (Fig. 2b) van de PANI/PLA composiet nanovezels was hoger dan die van de PLA nanovezels. Vergeleken met PLA, was de toename in elastische modulus van PANI/PLA-HZ, PANI/PLA-ZZ en PANI/PLA-PZ respectievelijk 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 en 28,43 ± 8,34 MPa. Wat betreft treksterkte (Fig. 2c) en breuktrekverhouding (Fig. 2d), daalden die van PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-PZ, terwijl die van PANI/PLA-ZZ licht toegenamen; de treksterkte en rek bij breuk van PANI/PLA-PZ waren de laagste. Vergeleken met de PLA nanovezels, daalde de treksterkte van PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-PZ met 0,15 ± 0,01 en 0,64 ± 0,03 MPa, respectievelijk, terwijl die van PANI/PLA-ZZ licht toegenam met 0,13 ± 0,05 MPa. De rek bij breuk van PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-PZ daalde met 16,93 ± 1,38% en 35,42 ± 3,94%, respectievelijk, terwijl die van PANI/PLA-ZZ toegenam met 3,32 ± 0,13%.

Mechanische eigenschappen van PLA nanovezels en PANI/PLA composiet nanovezels. a Representatieve trek spanning-rekcurven, b Young's modulus, c treksterkte bij breuk, d rek bij breuk

Zoals getoond in Fig. 2, kunnen de geselecteerde anorganische zuren de elastische modulus van PLA nanovezels verhogen door de verbinding van de PANI coating. Wat betreft treksterkte en rek bij breuk, vergeleken met PLA nanovezels, varieerden de mechanische eigenschappen van PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-ZZ in uiteenlopende mate, terwijl die van PANI/PLA-PZ het duidelijkst afnamen, en zodra de spanning tijdens de test werd toegepast, trad er een breuk op in minder dan 5 s. Deze resultaten kunnen te wijten zijn aan de oxidatie van HClO₄, wat resulteerde in de splitsing van de esterbinding in de PLA moleculaire keten en de oxidatieve decompositie van de carboxylgroep, wat vervolgens leidde tot inferieure mechanische eigenschappen. Tegelijkertijd kunnen de verschillende mechanische eigenschappen van PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-ZZ gerelateerd zijn aan de verschillende dichtheid van het PANI gedopt door HCl en H₂SO₄, terwijl de introductie van APS in het reactieproces ook een lichte impact kan hebben gehad op de PLA nanovezels, met het gecombineerde effect van deze factoren verschillende mechanische eigenschappen vertonend.

Celdheching, -proliferatie en -differentiatie worden beïnvloed door de morfologie, met een ruw oppervlak algemeen als gunstig voor celdheching beschouwd. De hydrofobiciteit van PLA nanovezels impliceert dat de uniforme polymerisatie van PANI een barrière presenteert, terwijl de oppervlaktebehandeling van PLA nanovezels met plasma de benettingsbaarheid aanzienlijk kan verbeteren. Na de PANI-gebaseerde in situ polymerisatie met verschillende anorganische zuur dopanten, werden PANI/PLA composiet nanovezels met een uniforme oppervlaktedepositie verkregen.

De PANI-morfologie op het oppervlak van de verschillende PANI/PLA vezels werd waargenomen via FE-SEM (Fig. 3). De figuur toont duidelijk dat het oppervlak van de PLA nanovezels bedekt was door veel onregelmatige nanopartikelen en dat de PANI/PLA composiet nanovezels gedopt met de anorganische zuren in staat waren om een goede vezelmorfologie en poreuze nanovezelstructuur te behouden. De morfologische waarnemingen onthulden dat de PANI/PLA composiet nanovezels met succes met PANI werden geladen, wat een basis vormde voor celdheching en -proliferatie. Tegelijkertijd werd AFM gebruikt om de oppervlakteruwigheid van de PANI/PLA composiet nanovezels te meten, zoals getoond in Fig. 4. Ra, de gemiddelde waarde van de oppervlakteruwigheid op drie verschillende posities van elk monster, wordt doorgaans gebruikt om de oppervlakteruwigheid van het monster te evalueren. Verder was de Ra van de PANI/PLA composiet nanovezels groter dan die van de PLA nanovezels, en de Ra van PANI/PLA-PZ was de hoogste. Deze toename in oppervlakteruwigheid versnelde het oppervlakteoppervlak en de polariteit, wat potentiël meer groeplaatsen voor cellen kan bieden en celdheching kan bevorderen.

Morfologie van a PLA nanovezels, b PANI/PLA-HZ, c PANI/PLA-ZZ en d PANI/PLA-PZ composiet nanovezels

AFM-afbeelding en oppervlakteruwigheid (Ra) van a PLA nanovezels, b PANI/PLA-HZ, c PANI/PLA-ZZ en d PANI/PLA-PZ composiet nanovezels

Celdheching, -migratie en -proliferatie worden aanzienlijk beïnvloed door de benettingsbaarheid van de gerustes. In het algemeen wordt benettingsbaarheid geëvalueerd in termen van de contacthoek tussen de gerust en water. Gezien PLA hydrofoob is, meeten we de contacthoek van de waterdruppels op het nanovezelmembraan binnen 1 s, zoals getoond in Fig. 5, en de contacthoeken van de PANI/PLA nanovezels na behandeling bleken aanzienlijk te dalen. De overeenkomstige contacthoeken van PLA, PANI/PLA-HZ, PANI/PLA-ZZ en PANI/PLA-PZ waren respectievelijk 112°, 61,6°, 36,7° en 37,2°. De PANI-morfologie van PANI/PLA verhoogde de oppervlakte-energie van het systeem, met het contactoppervlak toenemend bij de initiële contact met water, wat resulteerde in de daling van de contacthoek en de verbetering van de benettingsbaarheid. De contacthoek van de composiet nanovezels veranderde naar 0° na 5 s contact met water, wat goede hydrofiliciteit aantoont. Deze hydrofiele gerust biedt ook gunstige voorwaarden voor celdheching en -diffusie aangezien de zuurstofbevattende functionele groepen (bijv. -OH en -COOH) op het PLA oppervlak na de plasmabehandeling sterker aan het nanovezeloppervlak gebonden waren, en de PANI-morfologie en zuurstofbevattende functionele groepen samenwerkten om ervoor te zorgen dat de PANI/PLA composiet nanovezels uiteindelijk volledig benat waren.

Contacthoek van a PLA nanovezels, b PANI/PLA-HZ, c PANI/PLA-ZZ en d PANI/PLA-PZ composiet nanovezels

De FTIR-spectra van zuiver PANI en PANI/PLA composiet nanovezels gedopt door verschillende anorganische zuren zijn getoond in Fig. 6. In het zuiver gedopte PANI-spectrum (Fig. 6a) corresponderen de sterke kenmerkende pieken op 1.565, 1.485, 1.298 en 1.125 cm⁻¹ respectievelijk met een C=C rek van de chinonringen en een C=C rek, C-N rek en =C-H rek van de benzeenringen. In het zuiver gedopte PANI-spectrum (Fig. 6b), naast de kenmerkende PANI-piek, kan ook een PLA-piek worden gezien (C-O rek trillingspieken van 1092 en 1184 cm⁻¹, C=O rek trillingspiek van 1757 cm⁻¹). Deze resultaten geven aan dat PANI met succes op het oppervlak van de PANI/PLA nanovezels gedopt met anorganische zuren werd geladen. Om de chemische samenstelling van de PANI/PLA nanovezels verder te onderzoeken, werd XPS gebruikt om hun oppervlaktesamenstelling te analyseren. Daarnaast waren in de XPS-spectra (Fig. 7a) duidelijke N1s-pieken zichtbaar bij ~ 400 eV in PANI/PLA composiet nanovezels. Bovendien waren Cl2p-pieken zichtbaar bij ~ 200 eV in PANI/PLA-HZ en PANI/PLA-PZ, terwijl de piekintensiteit van Cl2p met PANI/PLA-PZ hoger was dan met PANI/PLA-HZ. Een piek van S2p verscheen bij ~ 210 eV op de XPS-spectra in PANI/PLA-ZZ. XPS-spectra gaven aan dat Cl⁻, SO₄²⁻ en ClO₄⁻ op de overeenkomstige PANI/PLA nanovezels gedopt waren. Daarnaast werden de imine stikstofatomen van PANI volledig of deels geoxideerd om een reeks oxidatietoestanden te produceren vergezeld door variërende graden van protonatie. De veranderingen in de oxidatietoestand en het protonatieniveau van PANI werden gemeten in termen van N1s kernniveauspectra (Fig. 7b-d). Elk N1s-spectrum kan worden gedecconvoleerd in vier hoofcomponenten met bindingsenergien van ongeveer 398,7, 399,6, 400,4 en 401,8 eV, wat respectievelijk toegeschreven kan worden aan de chinonoide imine (–N=), benzeenamine (–NH–), geprotonineerde amine (–N⁺) en geprotonineerde imine (=N⁺). Met verwijzing naar Kumar's studie, werd de fitting piek van het N1s-spectrum geacht beïnvloed te worden door de lading in de anionen gebonden door de geprotonineerde N-atomen, wat resulteerde in delocalisatie en een lichte verschuiving.

FTIR-spectra van a PANI, b PLA en PANI/PLA composiet nanovezels

XPS-spectra (a) van bereide PANI/PLA composiet nanovezelgerustes en de PANI/PLA-HZ (b), PANI/PLA-ZZ (c) en PANI/PLA-PZ (d) van de kernniveausignaal van N1s

Als sjabloon voor weefselreparatie en -regeneratie, worden bioactieve gerustes afgebroken en uit het lichaam geëxcreteerd na geïnduceerde cel- en weefselreparatie. In dit artikel werden de degradatie-eigenschappen van de nanovezelgerustes geëvalueerd met een massaverliesmethode, zoals getoond in Fig. 8. Het massaverlies van alle monsters nam toe op 7, 14 en 21 dagen, en de massaverliespercentages van de PLA nanovezels waren respectievelijk 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% en 12,65 ± 0,83%. Tegelijkertijd nam het massaverlies van de PANI/PLA-PZ composiet nanovezels geleidelijk toe na de in situ oxidatieve polymerisatie, met massaverliespercentages van 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% en 40 ± 2,54% op 7, 14 en 21 dagen, respectievelijk, wat aanzienlijk hoger was dan die van zowel PANI/PLA-HZ als PANI/PLA-ZZ nanovezels. In het PANI in situ oxidatieve polymerisatieproces kon de aanwezigheid van het oxidatiemiddel APS de esterbinding in PLA hebben vernield en een hydrolyse reactie geïnduceerd, wat resulteerde in microkraken in de PLA nanovezels. Met de verlenging van de PBS-injectietijd, accumulateerden de microkraken geleidelijk en begon de PLA matrix geleidelijk te degraderen. Het op het oppervlak geladen PANI viel ook af, wat resulteerde in een verliespercentage van nanovezelkwaliteit. Met de toename van de tijd werd het massaverliespercentage duidelijker. Hier verergerde de sterke oxidatie van HClO₄ de degradatie van PLA en versnelde het massaverlies van de PANI/PLA-PZ nanovezels, wat consistent is met de mechanische eigenschappen gepresenteerd in Fig. 2.

Degradatie-eigenschappen van PLA en PANI/PLA nanovezels

De biocompatibiliteit van bioactieve gerustes is de basis voor het bevorderen van celdheching, -groei en -proliferatie. Hier bestudeerden we de celproliferatie van HOS op PLA en PANI/PLA composiet nanovezels om de bijbehorende heching en biocompatibiliteit te illustreren. Tijdens de chemische behandeling en functionalisatie konden een aantal potentiële beïnvloedende factoren een rol spelen in de bereiding van bioactieve gerustes. Daarom is het onderzoeken van hun biocompatibiliteit de sleutel tot het evalueren van hun praktische toepassing.

Om de biocompatibiliteit van PANI/PLA composiet nanovezels te onderzoeken, werd hun celvitaliteit geëvalueerd met een MTT-methode. Figuur 9 toont de celactiviteit geïncubeerd op PLA en PANI/PLA composiet nanovezels na 1, 3 en 5 dagen. De figuur toont duidelijk dat met de verlenging van de incubatietijd de celactiviteit van de nanovezels geleidelijk toenem; de PANI/PLA-PZ cellen vertoonden de beste activiteit en de celactiviteit na een vijfdaagse kweek was de hoogste.

Celvitaliteit HOS gekweekt gedurende 1, 3 en 5 dagen op PLA nanovezels en PANI/PLA composiet nanovezels (*p < 0,05; **p < 0,005)

PLA is biologisch afbreekbaar, maar hydrofoob, wat betekent dat het niet gunstig is voor celdheching, -groei en -proliferatie. Na de plasmabehandeling werd het oppervlak van de PANI/PLA composiet nanovezels geladen met zuurstofbevattende groepen, en het functionele oppervlak vertoonde goede hydrofiliciteit. De bovenstaande morfologie- en AFM-resultaten geven aan dat het PANI gedopt met verschillende anorganische zuren verschillende morfologieën en ruwheidsniveaus vertoonde op het oppervlak van de PLA nanovezels. Tegelijkertijd vertoonden de PANI/PLA composiet nanovezels uitstekende benettingsbaarheid. Daarom beschouwden we dat de verschillende morfologieën van PANI gedopt met anorganische zuren leidden tot de versterking van de oppervlakte-energie en polariteit van de PANI/PLA composiet nanovezels, wat consequent het celgedrag, -migratie en -proliferatie beïnvloedde, wat resulteerde in verbeterde prestaties in termen van celactiviteit.

Om het celgedrag van de PANI/PLA composiet nanovezels verder te bestuderen, werden de groei en heching op de nanovezels waargenomen via fluorescente immunokleuring (Fig. 10) en SEM (Fig. 11). Hier vergelijken we de actine en celmorfologie op het oppervlak van verschillende nanovezels. Toen de cellen groeiden op de PLA vezels en PANI/PLA nanovezels, vertoonden de actinebundels een goede uitgerekte toestand. Tegelijkertijd was de celdichtheid van de PANI/PLA composiet nanovezels hoger dan die van de PLA nanovezels van de controlegroep, met de celdichtheid van de groei volgend de orde PANI/PLA-PZ > PANI/PLA-ZZ > PANI/PLA-HZ. De HOS cellen groeiden op de PANI/PLA nanovezels en hechtten in een platte multipolaire vorm. Duidelijk waren veel cellen in de poriën van de PANI/PLA vezels ingesloten, maar slecht uitgerekt op de PLA nanovezels en konden niet volledig uitgevouwen worden. Deze resultaten geven aan dat PANI/PLA composiet nanovezels de heching en proliferatie van HOS cellen kunnen bevorderen.

Fluorescentiemicrografische afbeeldingen op a PLA nanovezels, b PANI/PLA-HZ, c PANI/PLA-ZZ en d PANI/PLA-PZ composiet nanovezels na 24 uur incubatie

SEM-micrografieken van HOS gezaaid op a PLA nanovezels, b PANI/PLA-HZ, c PANI/PLA-ZZ en d PANI/PLA-PZ composiet nanovezels na 24 uur

Tegelijkertijd gaven de celimmunofluorescentiekleuring en celdchtingresultaten aan dat de verschillende PANI-morfologieën op het oppervlak van de PANI/PLA composiet nanovezels de groei, heching en proliferatie van de HOS cellen beïnvloedden, wat consistent was met de bovenstaande resultaten.

Als vroege osteogene marker werd de ALP-test uitgevoerd op PLA en PANI/PLA composiet nanovezelgerustes gedurende 7 dagen. Vergeleken met de zuivere PLA nanovezels, toonde het resultaat (Fig. 12) aan dat de ALP-activiteit aanzienlijk verbeterd was in PANI/PLA composiet nanovezels. Duidelijk is de ALP-activiteit van PANI/PLA-PZ composiet nanovezels de beste. Deze resultaten bewijzen dat PANI/PLA composiet nanovezels een betere biocompatibiliteit vertoonden, wat consistent is met de bovenstaande resultaten van celdheching, -groei en -proliferatie.

Alkalische fosfatase activiteit op PANI/PLA composiet nanovezelgerustes (ns = geen significantie)

Conclusies

In dit artikel werden PANI/PLA composiet nanovezels van verschillende oppervlaktemorfologieën bereid door drie typen anorganische zuren als dopant in in situ polymerisatie. We bevestigden dat PANI met succes op het oppervlak van PLA kon worden geladen zonder de poreuze structuur van de nanovezels te veranderen. De mechanische eigenschappen en in vitro degradatie-experimenten toonden aan that oxiderende zuren de mechanische eigenschappen significant kunnen verzwakken en de degradatie van polyester nanovezels versnellen. Tegelijkertijd resulteerde een ruwer oppervlak in een betere benettingsbaarheid en bevorderde de celdheching, -groei en -proliferatie, wat een betere biocompatibiliteit aantoonde. Concluderend heeft de gereguleerde PANI-morfologie via verschillende zuren doping een positief effect op biocompatibiliteit in weefseltechniek.

Beschikbaarheid van data en materialen

De auteurs verklaren dat de materialen en data onmiddellijk beschikbaar zijn voor lezers zonder onredelijke kwalificaties voor materiaaloverdrachtsovereenkomsten. Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn in dit artikel opgenomen.

Afkortingen

PANI:

Polyaniline

PLA:

Polylactaat

ECM:

Extracellulaire matrix

PPy:

Polypyrrole

PTH:

Polythiofeen

AN:

Aniline

DCM:

Dichloormethaan

DMF:

N,N-Dimetylformamide

APS:

Ammoniumpersulfaat

HOS:

Humane osteosarcocoma cellen

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

MTT:

3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide

FITC:

Fluoresceïne isothiocyaan

FTIR:

Fourier transformatie infraroodspectroscopie

FE-SEM:

Veldemissie scanning elektronenmicroscopie

XPS:

Röntgenfoto-elektronspectroscopie

ALP:

Alkalische fosfatase