SOX2 reguleert de lncRNA CCAT1/MicroRNA-185-3p/FOXP3-as om de proliferatie en zelfvernieuwing van baarmoederhalskankerstamcellen te beïnvloeden

Abstract

Er is de rol gepresenteerd van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) bij baarmoederhalskanker (CC). We willen het effect bespreken van geslachtsbepalende regio Y-box 2 (SOX2)/lncRNA colonkanker-geassocieerd transcript-1 (CCAT1)/microRNA-185-3p (miR-185-3p)/forkhead box protein 3 (FOXP3 ) over de proliferatie en zelfvernieuwing van CC-stamcellen. MiR-185-3p-, SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies werden getest in CC-weefsels en -cellen. De relatie tussen SOX2/CCAT1-expressie en klinisch-pathologische kenmerken bij CC-patiënten werd geverifieerd. Loss- en gain-of-function-onderzoeken werden uitgevoerd in CD44⁺ HeLa-cellen om biologische functies en zelfvernieuwend vermogen te bespreken. Ten slotte werden de relaties tussen SOX2, CCAT1, FOXP3 en miR-185-3p geverifieerd. miR-185-3p-expressie was verlaagd, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies waren verhoogd in CC-weefsels en -cellen. SOX2- en CCAT1-expressies waren gekoppeld aan tumorgrootte, lymfekliermetastase en internationale federatie van gynaecologie en verloskundestadium van CC. Neerwaartse regulatie van SOX2 of CCAT1 en opwaartse regulatie van miR-185-3p resulteerde in remming van proliferatie, invasie, migratie en aantal cellen, evenals apoptose-versnelling van CD44⁺ HeLa-cellen. SOX2 kon binden aan CCAT1 die de miR-185-3p-expressie beïnvloedde, en FOXP3 was het doelwit van miR-185-3p.

Inleiding

Baarmoederhalskanker (CC) is de vierde belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen met naar schatting 570.000 gevallen en 311.000 sterfgevallen wereldwijd in 2018 [1]. Deze complexe ziekte is betrokken bij verschillende factoren, waaronder genetische effecten en virale infectie [2]. Met de ontwikkeling van co-tests voor humaan papillomavirus en vaccinatie tegen humaan papillomavirus, resulteren vroege diagnostische procedures van cervicale dysplasie en kanker in een vermindering van de incidentie, morbiditeit en mortaliteit van CC [3]. Voor vroege CC-patiënten wordt chirurgie aanbevolen, zoals vruchtbaarheidssparende chirurgie, kegelbiopsie, radicale trachelectomie, bekkenlymfeklierdissectie, bekkenradiotherapie en brachytherapie [4]. Door metastase of recidief bij vergevorderde CC-patiënten is de prognose nog steeds slecht [5]. Daarom is het nog steeds dringend nodig om nieuwe en effectieve prognostische markers en therapeutische strategieën te identificeren om de behandeling van CC te verbeteren.

Geslachtsbepalende regio Y-box 2 (SOX2) is een cruciaal lid van de SOX-familie van transcriptiefactoren en komt voornamelijk tot uiting in embryonale en volwassen stamcellen en wordt ook tot expressie gebracht in tumorstamcellen [6]. Het heeft aangetoond dat SOX2 de radioresistentie in CC moduleert via de hedgehog-signaleringsroute [7]. Een andere studie heeft aangetoond dat SOX2 cruciaal is voor het in stand houden van de subpopulatie van kankerstamcellen in CC-cellijnen [8]. Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn een klasse van RNA-moleculen met een lengte van 200 nucleotiden [9]. LncRNA colonkanker-geassocieerd transcript-1 (CCAT1) bevindt zich op humaan chromosoom 8q24.21 en wordt beschouwd als een "hot spot" die resulteert in genetische mutaties bij darmkanker [10]. Een studie heeft gerapporteerd dat CCAT1 celproliferatie en invasie van CC versnelt [11]. Volgens Jia et al. verbetert CCAT1 de proliferatie, migratie en invasie van CC-cellen dramatisch [12]. Bovendien heeft een andere studie onthuld dat CCAT1 de kwaadaardige graad van inflammatoire darmaandoeningen verbetert door de darmbarrière te verpesten door microRNA-185-3p (miR-185-3p) [13] te verminderen. MiRNA kan de expressie van genen omgekeerd regelen door mRNA te verminderen en translatie te onderdrukken [14]. In vitro-experimenten in een eerdere studie hebben aangetoond dat miR-185-3p de radioresistentie van nasofarynxcarcinoom moduleert [15]. Een andere studie heeft aangetoond dat miR-185 in vivo en in vitro betrokken is bij resistentie tegen cisplatine van eierstokkanker [16]. Forkhead box-eiwit 3 (FOXP3) is een transcriptiefactor die behoort tot de FOX-eiwitfamilie, die voor het eerst wordt aangetroffen in regulerende T- (Treg) -cellen en een vitale rol speelt bij het onderhoud en het proces van Treg-cellen [17]. Een studie meldt dat FOXP3 verband houdt met lymfangiogenese van CC [18]. Een andere studie onthult dat het niveau van FOXP3 dramatisch gekoppeld is aan de internationale federatie van gynaecologie en verloskunde (FIGO-stadium) en tumorgrootte van CC [19]. In deze studie hebben we daarom de effecten onderzocht van de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-as op de proliferatie en het zelfvernieuwingsvermogen van CC-stamcellen.

Materialen en methoden

Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen

De experimenten waarbij mensen betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die zijn uitgedrukt in de Verklaring van Helsinki. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van The First Hospital van Jilin University. Alle deelnemers hebben een document van geïnformeerde toestemming ondertekend.

Studieonderwerpen

Van december 2016 tot december 2018 werden 39 gevallen van CC-weefsels en overeenkomstige aangrenzende normale weefsels geoogst van CC-patiënten en bewaard in vloeibare stikstof. De inclusiecriteria waren als volgt:(1) Patiënten werden bevestigd als CC door pathologie van biopsieën in transcervicale en cervicale kanalen, cervicaal uitstrijkje, cervicale jodiumtest, vaginaal speculum en cervicale wervelresectie. (2) Patiënten kregen 2 weken voor de operatie geen radiotherapie en chemotherapie. De uitsluitingscriteria waren als volgt:(1) patiënten die radiotherapie of chemotherapie ondergingen, (2) patiënten waren het niet eens met de afname van het monster en (3) patiënten met aandoeningen van het immuunsysteem.

Celselectie en cultuur

CC-cellijnen (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 en C33A) en menselijke cervicale epitheliale onsterfelijke cellijn H8 werden gekocht bij Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). CC-cellen SiHa, HeLa en HCC94 werden gekweekt in hoog-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat, terwijl CaSki-, C33A- en H8-cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium met 10 % FBS (37℃ en 5% CO₂ ). Cellen werden om de 2 dagen losgemaakt en in subcultuur gebracht.

CC-stamcellen sorteren (CD44⁺ HeLa-cellen)

CC-stamcellen werden gescheiden van CC-cellijn HeLa door celsuspensiekweek. CC-cellen HeLa werden gedurende 21 dagen gekweekt door serumvrij Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) in een petrischaal met ultralage hechting, waarbij het medium elke 3-5 dagen semi-kwantitatief werd uitgewisseld. Sommige cellen werden in bollen gesuspendeerd en HeLa-bolvormende cellen (SFC's) werden verkregen. De eigenschap van bolvormige cellen werd geïdentificeerd en geanalyseerd. Cellen werden losgemaakt door trypsine en aangepast tot 1 × 10⁶ cellen/ml. Cellen werden toegevoegd met CD44-antilichaam en gesorteerd door middel van flowcytometrie. HeLa-cellen met positieve CD44 waren HeLa-tumorstamcellen, terwijl met negatieve CD44 HeLa-niet-stamcellen waren. CC-stamcellen werden gekweekt in DMEM/F12 en toegevoegd met 20 ng/ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF), 20 ng/ml epidermale groeifactor (EGF) en B27. Het medium bevatte 1% penicilline en streptomycine [20].

Celbehandeling

CD44⁺ HeLa-cellen werden getransfecteerd met sh-SOX2, sh-SOX2 negatieve controle (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, miR-185-3p mimic, mimic NC, sh-CCAT1 en miR-185-3p remmer evenals sh-CCAT1 en remmer NC. Alle oligonucleotidesequenties werden geleverd door GenePharma (Shanghai, China). Losgemaakt door trypsine, werden de cellen gezaaid in een plaat met 6 putjes met 3 × 10⁶ cellen/put. Toen 60% confluentie werd bereikt, werden de cellen veranderd in serumvrij medium en gedurende 1 uur geïncubeerd. Transfectie werd mogelijk gemaakt door Lipofectamine 2000 transfectiereagens (Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS).

Omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

RNA in weefsels en cellen werd geëxtraheerd door Trizol (Invitrogen). RNA (1 μg) werd omgekeerd in cDNA door moloney murine leukemievirus RTase-kit (Invitrogen). cDNA werd toegevoegd aan het real-time PCR-systeem. Primers zijn bedacht door Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) (tabel 1). U6 was de laadcontrole van miR-185-3p, terwijl glyceraldehydefosfaatdehydrogenase (GAPDH) van SOX2, CCAT1 en FOXP3. De resultaten zijn geanalyseerd door 2^−ΔΔCt methode.

Western Blot-assay

Het totale eiwit in cellen en weefsels werd geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald door bicinchoninezuurkits (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, China). Het eiwit werd gemengd met laadbuffer en 5 minuten gekookt, gevolgd door een ijsbad en centrifugeren. Het eiwit werd behandeld met 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht naar een membraan. Het membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd met 5% magere melk, onderzocht met primaire antilichamen SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, China), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA , VS), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS) en opnieuw onderzocht met secundair antilichaam gelabeld met mierikswortelperoxidase, bedekt met een conserveringsfilm en blootgesteld. Bio-rad Gel Doc EZ-imager (Bio-rad, Californië, VS) werd goedgekeurd voor ontwikkeling. De eiwitbeelden werden geanalyseerd door ImageJ2x-software.

Cell Counting Kit (CCK)-8 Assay

CCK-8-assay werd geïmplementeerd met de kits (Beyotime, Shanghai, China). Cellen (1 × 10⁴ ) werden uitgezaaid op een plaat met 96 putjes en geïncubeerd. Gekweekt gedurende 0, 24, 48 en 72 uur, werden cellen toegevoegd met 10 L / putje CCK-8-oplossing en 1 uur uitgebroed. De optische dichtheidswaarde werd bepaald met een Multiskan Spectrum microplaatlezer met volledige golflengte bij 450 nm. Zes putten werden genomen om de gemiddelde waarde te tellen. De celgroeicurve werd uitgezet met de tijd als de ordinaat en de relatieve cellevensvatbaarheid als de ordinaat. De optische dichtheidswaarde vertegenwoordigde celproliferatie.

Flowcytometrie

Cellen (1 × 10⁶ ) werden gecentrifugeerd bij 1500 r/min, gesuspendeerd met 200 L bindingsbuffer, geïncubeerd met 5 L propidiumjodide (PI) en 5 L Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) op hun beurt en toegevoegd met 400 L buffer. De snelheid van celapoptose werd geverifieerd door een flowcytometer (BD Biosciences, NJ, VS).

Krastest

De getransfecteerde cellen werden losgemaakt en in celsuspensie bereid. Celsuspensies (1 × 10⁶ cellen / ml) werden gezaaid in een plaat met 6 putjes en gekweekt tot 80-90% samenvloeiing. Transversale en longitudinale krassen op de plaat met 6 putjes werden gelijkmatig gemaakt door een aseptische pipetpunt van 10 L langs de liniaal. Het oorspronkelijke medium werd vervangen door compleet medium en de cellen werden continu gekweekt. De migratie van cellen werd onder een microscoop waargenomen om 0 h en 72 h en op dezelfde plek afgebeeld.

Transwell-assay

De getransfecteerde cellen werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd bij 1000 g en gespoeld met DMEM. Een volledig gehydrateerde Transwell-kamer werd in een plaat met 24 putjes geplaatst die 10% FBS-DMEM (600 ml / putje) bevatte. Celsuspensie (5 × 10⁵ cellen/mL, 200 L) werd toegevoegd in de bovenste kamer van Transwell (gecoat met 1:8 Matrigel 80 L), terwijl 500 μL 20% FBS-DMEM naar de onderste kamer. Cellen werden 24 uur continu gekweekt, gefixeerd met 500 L 4% paraformaldehyde (PFA) en geverfd met 0,1% kristalviolette kleuroplossing. Vervolgens werden de cellen op het oppervlak en de rand van de bovenste kamer weggevaagd met een wattenstaafje. Vijf velden werden willekeurig geselecteerd en cellen werden geteld onder een Nikon Eclipse TE2000-S-microscoop (Nikon, Japan).

Sphere-forming assay

Cellen werden gezaaid in een plaat met lage adsorptie met 6 putjes die serumvrij suspensiemedium met 200 cellen/putje bevatte. Na 2 w werd de bolvormingssnelheid van cellen waargenomen onder een Nikon Eclipse TE2000-S-microscoop (Nikon), en de bolvormingssnelheid werd berekend als gemiddeld aantal bolletjes/aantal gezaaide cellen × 100%.

Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-assay

ChIP-assay werd uitgevoerd met de ChIP-kit (Upstate, NY, VS). SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, China) en normale konijnen-IgG (12-370, Millipore, VS) antilichamen werden gebruikt om het verknoopte eiwit-DNA-complex te immunoprecipiteren. CD44⁺ HeLa-cellen werden gefixeerd met 1% PFA en geïncubeerd om DNA-eiwitverknoping te produceren. Vervolgens werd het DNA ultrasoon in een chromatinefragment van 200-300 bp geknipt. Het geprecipiteerde chromatine-DNA werd teruggewonnen en geanalyseerd met RT-qPCR.

RNA pull-down-assay

De met biotine gelabelde miR-185-3p wild-type (WT) en mutant-type (MUT) plasmiden (50 nM) werden getransfecteerd in CD44⁺ HeLa-cellen, respectievelijk. Cellen werden na 48 uur transfectie uitgebroed met specifiek cellysaat (Ambion, Austin, Texas, VS). Het cellysaat (50 ml) was subverpakt. Het resterende lysaat werd uitgebroed met M-280 streptavidine-kralen (Sigma, St. Louis, MO, VS) vooraf gecoat met RNase-vrij en gist-tRNA (Sigma). Daarna werden de cellen tweemaal gereinigd met koud lysaat, driemaal met lage zoutbuffer en eenmaal met hoge zoutbuffer. Een antagonistische miR-185-3p-sonde werd opgezet als een NC. Het totale RNA werd geëxtraheerd met Trizol en het CCAT1-niveau werd getest met RT-qPCR.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

Potentiële bindingsplaatsen E1 en E2 van SOX2 op de CCAT1-promotorregio werden voorspeld door https://jaspar.genereg.net/. De CCAT1-promotorsequentie die SOX2- en CCAT1-bindingsplaats El bevat, werd gesynthetiseerd en de CCAT1 3'UTR WT (E1-WT) en CCAT1 3'UTR MUT (E1-MUT) vectoren werden gevormd. De vectoren werden gekloond in pmirGLO (Beyotime). Daarna werd CCAT1-WT/pmirGLO of CCAT1-MUT/pmirGLO gecotransfecteerd met sh-SOX2 of sh-SOX2 NC naar CD44⁺ HeLa-cellen respectievelijk gedurende 2 d en vervolgens gelyseerd. De luciferase-activiteit werd getest door een luciferase-detectiesysteem (Takara, Dalian, China).

Bioinformatics-website werd gebruikt voor het voorspellen en analyseren van de bindingsplaatsen van CCAT1 en miR-185-3p. De bindingsplaatsen van CCAT1 en miR-185-3p werden geverifieerd door middel van een dubbele luciferase-reportergentest. CCAT1 3'UTR bevattende miR-185-3p-bindingsplaats werd samengesteld. CCAT1 3′UTR WT en CCAT1 3′UTR MUT werden geconstrueerd en gecotransfecteerd met mimics NC en miR-185-3p mimics naar CD44⁺ HeLa-cellen voor 2 d. Vervolgens werden de cellen gelyseerd en werd de luciferase-activiteit getest door middel van een luciferasedetectiesysteem (Takara). Dezelfde methode werd toegepast om de targetingrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 te verifiëren.

Statistische analyse

Alle gegevens werden geëvalueerd door SPSS 21.0-software (IBM Corp. Armonk, NY, VS). De meetgegevens werden aangegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. De t-test werd toegepast voor discrepantie tussen twee groepen en eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest voor discrepantie tussen groepen. De classificatievariabele werd beoordeeld met Fisher's exact-test. Een p waarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

miR-185-3p-expressie neemt af, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies toenemen in CC-weefsels, en SOX2- en CCAT1-expressies zijn gekoppeld aan tumorgrootte, lymfeklier Metastase (LNM) en FIGO Stadium

Bij het detecteren van de rol van de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-as op de proliferatie en zelfvernieuwing van CC-stamcellen, werden miR-185-3p-, SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies in CC-weefsels en aangrenzende normale weefsels getest met RT-qPCR en western blot-assay. Het bleek dat (Fig. 1a-c) miR-185-3p-expressie was verminderd, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies waren verhoogd in CC-weefsels.

miR-185-3p-expressie neemt af, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies toenemen in CC-weefsels. een Vergelijking van SOX2-mRNA-, CCAT1-, miR-185-3p- en FOXP3-mRNA-expressie in CC en aangrenzende normale weefsels. b Eiwitbanden van SOX2- en FOXP3-eiwitexpressie in CC en aangrenzende normale weefsels. c Vergelijking van SOX2- en FOXP3-eiwitexpressie in CC en aangrenzende normale weefsels. *p < 0,05 vs. aangrenzende normale weefsels. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld met de t-test

De relatie tussen SOX2 / CCAT1-expressie en klinisch-pathologische kenmerken van CC werd geanalyseerd (tabel 2). Overexpressie van SOX2 en CCAT1 in CC waren verbonden met tumorgrootte, LNM en FIGO-stadium, wat aangeeft dat SOX2- en CCAT1-expressies hoger waren bij patiënten met grotere tumorgrootte, LNM en gevorderd FIGO-stadium van CC-patiënten.

miR-185-3p-expressie vermindert, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies toenemen in CD44⁺ HeLa-cellen

Vervolgens werden miR-185-3p-, SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies in menselijke cervicale epitheliale onsterfelijke cel H8- en CC-cellijnen SiHa, CasKi, HeLa, HCC94 en C33A getest. Er werd gesuggereerd dat (Fig. 2a-c) miR-185-3p-expressie was afgebroken, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 verhoogd waren in CC-cellijnen. Onder hen had SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 in HeLa-cellen het grootste expressieverschil met H8-cellen; dus werden HeLa-cellen gescreend en gesorteerd; HeLa-SFC's werden verkregen door celsuspensieculturen en CD44-expressie in het celoppervlak voor en na het sorteren werd geïdentificeerd door flowcytometrie. De resultaten benadrukten dat de positieve snelheid van CD44 in HeLa-SFC's aanzienlijk hoger was dan die vóór het sorteren, wat een succesvolle sortering van CC-stamcellen suggereert (figuur 2d). De gesorteerde stamcellen kregen de naam CD44⁺ HeLa-cellen. Vervolgens werden miR-185-3p-, SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies getest in HeLa en CD44⁺ HeLa-cellen (Fig. 2e-g). Het bleek dat SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies waren opwaarts gereguleerd en miR-185-3p was neerwaarts gereguleerd in CD44⁺ HeLa-cellen.

miR-185-3p-expressie vermindert, terwijl SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies toenemen in CD44⁺ HeLa-cellen. een Vergelijking van SOX2-mRNA-, CCAT1-, miR-185-3p- en FOXP3-mRNA-expressie in H8- en CC-cellijnen. b Eiwitbanden van SOX2- en FOXP3-eiwitexpressie in H8- en CC-cellijnen. c Vergelijking van SOX2- en FOXP3-eiwitexpressie in H8- en CC-cellijnen. d Detectie van CD44-expressiesnelheid in HeLa-cellen voor en na het sorteren door middel van flowcytometrie. e Vergelijking van SOX2-mRNA-, CCAT1- en miR-185-3p-expressie tussen HeLa-cellen en CD44⁺ HeLa-cellen. v Eiwitband van SOX2-eiwitexpressie in HeLa-cellen en CD44⁺ HeLa-cellen. g Vergelijking van SOX2-eiwitexpressie tussen HeLa-cellen en CD44⁺ HeLa-cellen. ^p < 0,05 versus H8-cellen. ^& p < 0,05 vs. HeLa-cellen. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld met de t-test en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Neerwaarts regulerende SOX2 en neerwaarts regulerende CCAT1 nemen proliferatie, migratie, invasie en bolvorming af en verhogen apoptose van CD44⁺ HeLa-cellen

Vervolgens werden SOX2 en CCAT1 tot zwijgen gebracht in CD44⁺ HeLa-cellen om hun effecten op de proliferatie en zelfvernieuwing van CC-stamcellen te onderzoeken. Gedetecteerd door CCK-8-assay, flowcytometrie, krastest, Transwell-assay en bolvormend experiment, werden de proliferatie, migratie, invasie en bolvormingssnelheid onderdrukt en apoptose van CD44⁺ HeLa-cellen werden bevorderd door remming van SOX2 en CCAT1 (Fig. 3a-i). Het was indicatief dat het stilleggen van SOX2 of CCAT1 de proliferatie en zelfvernieuwing van CC-stamcellen remde.

Neerwaartse regulering van SOX2 en neerwaartse regulering van CCAT1 verminderen de proliferatie, migratie, invasie en bolvormingssnelheid en verhogen de apoptose van CD44⁺ HeLa-cellen. een CCK-8-assay testte de celgroeicurve in cellen die waren behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. b Flowcytometrie detecteerde celapoptose in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. c Vergelijking van de snelheid van celapoptose in cellen die zijn behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. d Celmigratie in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2 getest door middel van een krastest. e Vergelijking van celmigratie in cellen die zijn behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. v Detectie van invasievermogen van cellen in cellen die zijn behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2 door Transwell-assay. g Vergelijking van het invasievermogen van cellen die zijn behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. u Bolvormend experiment testte het zelfvernieuwingsvermogen in cellen die waren behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. ik Vergelijking van bolvormingssnelheid in cellen die zijn behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. een p <-0,05 vs. de sh-SOX2 NC-groep. b p <-0,05 vs. de sh-CCAT1 NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door middel van eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Uitgeputte miR-185-3p keert de rol van neerwaartse regulering van CCAT1 in CD44⁺ om HeLa-cellen

Vervolgens hebben we onderzocht of miR-185-3p betrokken was bij het proces van CCAT1 dat de proliferatie en zelfvernieuwing van CC-stamcellen reguleert. CD44⁺ HeLa werd getransfecteerd met miR-185-3p-nabootsing of gecotransfecteerd met sh-CCAT1 en miR-185-3p-remmer. De resultaten toonden aan dat opregulatie van miR-185-3p de proliferatie, migratie, invasie en bolvormingssnelheid aanzienlijk verminderde, terwijl de apoptosesnelheid van CD44⁺ toenam. HeLa-cellen. Cellen die zijn behandeld met miR-185-3p-remmer kunnen de rol van neerwaarts gereguleerde CCAT1 bij proliferatie, migratie, invasie, apoptose en celbolvorming van CD44⁺ omkeren HeLa-cellen (Fig. 4a–i).

Overexpressie van miR-185-3p onderdrukt proliferatie, migratie, invasie en bolvormingssnelheid en verhoogt apoptose van CD44⁺ HeLa-cellen. een CCK-8-assay testte de celgroeicurve in cellen die waren behandeld met miR-185-3p-nabootsing. b Flowcytometrie detecteerde celapoptose in cellen die waren behandeld met miR-185-3p mimic. c Vergelijking van de snelheid van celapoptose in cellen die zijn behandeld met miR-185-3p-nabootsing. d Celmigratie in cellen die zijn behandeld met miR-185-3p-nabootsing getest door middel van een krastest. e Vergelijking van celmigratie in cellen die zijn behandeld met miR-185-3p mimic. v Detectie van invasievermogen van cellen die zijn behandeld met miR-185-3p-nabootsing door Transwell-assay. g Vergelijking van het invasievermogen van cellen die zijn behandeld met miR-185-3p mimic. u Bolvormend experiment testte het zelfvernieuwingsvermogen in cellen die waren behandeld met miR-185-3p-nabootsing. ik Vergelijking van bolvormingssnelheid in cellen die zijn behandeld met miR-185-3p-nabootsing. een p <-0,05 vs. de sh-SOX2 NC-groep. b p <-0,05 vs. de sh-CCAT1 NC-groep. c p <-0,05 vs. de nabootsende NC-groep. d p <-0,05 vs. de sh-CCAT1 + -remmer NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door middel van eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Laag tot expressie gebrachte SOX2 en laag tot expressie gebrachte CCAT1 verlagen FOXP3-expressie en verhogen miR-185-3p-expressie in CD44⁺ HeLa-cellen

Daarna onderzochten we de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-expressie in CD44⁺ HeLa-cellen na transfectie van sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p-nabootsing en co-transfectie van sh-CCAT1 en miR-185-3p-remmer. SOX2-, CCAT1- en FOXP3-expressies waren verminderd, terwijl miR-185-3p-expressie verhoogd was in cellen die waren behandeld met sh-SOX2. CCAT1- en FOXP3-expressies waren verminderd en miR-185-3p-expressie was verbeterd in cellen die waren behandeld met sh-CCAT1. miR-185-3p-expressie was verhoogd en FOXP3-expressie was verlaagd in cellen die waren geïntroduceerd met miR-185-3p-nabootsing. FOXP3-expressie was verhoogd en miR-185-3p-expressie was verminderd in cellen die achtereenvolgens waren getransfecteerd met sh-CCAT1 en miR-185-3p-remmer (Fig. 5a-d).

Laag tot expressie gebrachte SOX2 en laag tot expressie gebrachte CCAT1 verlagen de FOXP3-expressie en verhogen de miR-185-3p-expressie in CD44⁺ HeLa-cellen. een SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-expressie in de sh-SOX2 NC- en sh-SOX2-groepen. b SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-expressie in de sh-CCAT1 NC- en sh-CCAT1-groepen. c SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-expressie in de mimische NC- en miR-185-3p-nabootsingsgroepen. d SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-expressie in de sh-CCAT1 + -remmer NC- en sh-CCAT1 + miR-185-3p-remmergroepen. een p <-0,05 vs. de sh-SOX2 NC-groep. b p <-0,05 vs. de sh-CCAT1 NC-groep. c p <-0,05 vs. de nabootsende NC-groep. d p <-0,05 vs. de sh-CCAT1 + -remmer NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door middel van eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

SOX2 bindt aan CCAT1 wat de miR-185-3p-expressie beïnvloedt, en FOXP3 is een doelgen van miR-185-3p

De potentiële bindingsplaatsen van de transcriptiefactor van de CCAT1-promotorregio werden bepaald en geanalyseerd door //jaspar.genereg.net/-website, en het toonde aan dat SOX2 en CCAT1 potentiële bindingsplaatsen hadden in de CCAT1-promotorregio (figuur 6a). ChIP-qPCR meldde dat (Fig. 6b):in tegenstelling tot de IgG-groep waren er meer CCAT1-promotorfragmenten verrijkt in de SOX2-groep op de El-bindingsplaats, wat aantoonde dat SOX2 was gebonden aan de CCAT1-promotor op de El-plaats en SOX2 was betrokken bij de regulering van CCAT1. Dubbele luciferase-reportergentest toonde dat aan (Fig. 6c):de luciferase-activiteit werd onderdrukt in cellen die waren gecotransfecteerd met sh-SOX2 en E1-WT, wat aangeeft dat SOX2 aan CCAT1 kon binden.

SOX2 kan binden aan CCAT1 dat de expressie van miR-185-3p beïnvloedt, en FOXP3 is een doelwitgen van miR-185-3p. een Voorspelling van bindingsplaatsen in SOX2- en CCAT1-promotorregio's door bioinformatica-sites. b ChIP-qPCR-experiment verifieerde de bindingsrelatie tussen SOX2 en CCAT1. c De bindingsplaats van SOX2 en CCAT1 geverifieerd door dubbele luciferasereportergentest. d Voorspelling van bindingsplaatsen in CCAT1 en miR-185-3p door bioinformatica-sites. e Verificatie van de binding van CCAT1 en miR-185-3p door middel van een dubbele luciferase-reportergentest. v De bindingsrelatie tussen CCAT1 en miR-185-3p in cellen geverifieerd door RNA pull-down assay. g Voorspelling van de targetingrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 door bioinformatica-website. u Identificatie van de targetingrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 door dubbele luciferase-reportergentest. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld met de t-test

De website van Jefferson voorspelde dat CCAT1 zou kunnen binden aan miR-185-3p (figuur 6d). Dubbele luciferase-reportergentest meldde dat (Fig. 6e) de luciferase-activiteit was afgenomen in cellen die waren geïntroduceerd met miR-185-3p-nabootsing en CCAT1-WT, wat suggereert dat miR-185-3p aan CCAT1 zou kunnen binden. RNA pull-down assay werd gebruikt om te verifiëren of CCAT1 kon binden met miR-185-3p. De resultaten toonden aan dat (Fig. 6f) het verrijkingsniveau van CCAT1 in cellen behandeld met Bio-miR-185-3p-WT aanzienlijk toenam, terwijl het verrijkingsniveau van CCAT1 in cellen behandeld met Bio-miR-185-3p-MUT toonde geen significant verschil. Dit resultaat toonde aan dat CCAT1 miR-185-3p kon adsorberen, waardoor de expressie van miR-185-3p werd beïnvloed.

De doelrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 werd voorspeld door de Jefferson-website (Fig. 6g). Dubbele luciferase-reportergentest bevestigde dat (Fig. 6h) de relatieve luciferase-activiteit van cellen dramatisch verminderde nadat FOXP3-WT en miR-185-3p gecotransfecteerd waren naar CD44⁺ HeLa-cellen, terwijl FOXP3-MUT gecotransfecteerd met miR-185-3p-nabootsing, had geen invloed op de relatieve luciferase-activiteit van cellen, wat suggereert dat miR-185-3p zich op FOXP3 richtte.

Discussie

CC is de vierde frequente maligniteit bij vrouwen in de wereld, gevolgd door kanker van borst, colon en long [3]. Het heeft gemeld dat CC-cellen met positieve SOX2-expressie de kenmerken van kankerstamcellen vertonen [21]. Een studie heeft gemeld dat CCAT1 een essentieel oncogeen lncRNA is dat gerelateerd is aan CC en een faciliterende rol speelt bij de groei en invasie van CC-cellen [11]. Een andere studie onthult dat miR-185-3p de radiogevoeligheid van nasofarynxcarcinoom zou kunnen voorspellen en de groei en apoptose van kankercellen zou kunnen reguleren [22]. Het heeft gemeld dat het circulerende auto-antilichaam tegen FOXP3 de continue voortgang van de cervicale laesie weerspiegelt en een potentiële biomarker kan zijn voor de vroege prognose van CC [23]. De huidige studie was bedoeld om te onderzoeken hoe de SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3-as de proliferatie en het zelfvernieuwingsvermogen van CC-stamcellen beïnvloedde.

Op basis van onze bevindingen waren SOX2- en CCAT1-expressies verhoogd in CC-weefsels en cellen die waren gekoppeld aan tumorgrootte, LNM en geavanceerde FIGO. Functionally proved, down-regulating SOX2 and CCAT1 declined proliferation, migration, invasion and sphere cells number and increased apoptosis of CC stem cells. Similar to our study, SOX2 expression trends to increase in CC [24, 25]. Moreover, SOX2 expression is also up-regulated in CC cells derived from cancer stem cells [26]. Overexpressed SOX2 was suggested to link with clinicopathological characteristics of patients with several types of cancer, not limited to CC. For example, it was suggested that up-regulated SOX2 shows in cervical squamous cell carcinoma patients staged in FIGO I-II [27]. Moreover, SOX2 expression is linked to LNM in oral squamous cell carcinoma [28]. When it comes to the molecular function of SOX2 for cancer progression, there is an observational work presenting that down-regulated SOX-2 suppresses cell migration and invasion of cervical squamous cell carcinoma [29]. Meanwhile, another research has offered a proof that up-regulated SOX2 enhances CC cell clonogenicity, proliferation and tumorigenicity in vitro and in vivo than control cells [30].

Concerning to the regulatory relation between SOX2 and CCAT1, an existed study has presented that silencing SOX2 markedly reduces CCAT1 mRNA level [31]. As to the role of CCAT1 in cancers, a study has showed that CCAT1 expression is markedly elevated in CC tissues versus in the adjacent normal tissues [11, 12]. Of note, CCAT1 overexpression in CC is positively related to the tumor size [12]. In terms of the role of CCAT1 in cancer cell activity, there is a research highlighting that overexpressed CCAT1 accelerates CC cell proliferation, colony formation and invasion [11]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the cell viability, invasive and migratory abilities are declined via knocking down CCAT1 [12]. Anyway, the functional effect of SOX2 and CCAT1 in other cancers was similar to that in CC.

Afterward, our research revealed that CCAT1 could bind to miR-185-3p, the down-regulated CCAT1 in CC and overexpressing miR-185-3p suppressed the proliferation and self-renewal abilities of CC stem cells. It is reported that CCAT1 and miR-185-3p are negatively correlated [13]. Furthermore, a result reported that a reduction is seen in miR-185-3p expression in radioresistant nasopharyngeal carcinoma cases [22]. Regarding to the suppressive function of miR-185-3p in cancer cell aggressiveness, a study has revealed that up-regulation of miR-185-3p suppresses the invasive and metastatic properties of nasopharyngeal carcinoma cells [32]. Furthermore, Zou et al. have suggested that restored miR-185 represses breast cancer cell growth and invasion [33]. There is a article finding that up-regulation of miR-185 declines the proliferation, invasion and colony formation capacities of non-small cell lung cancer cells in vitro [34]. It is presented that in vitro cell proliferation, invasion and migration as well as in vivo tumor growth are suppressed via miR-185-overexpressing in non-small cell lung cancer cells [35]. From those studies, the anti-tumor role of miR-185-3p in the present study was consistent with previous researches.

To proceed, we unveiled that miR-185-3p targeted FOXP3, the overexpressed gene in CC to regulate CC stem cell activities. In fact, FOXP3, the regulator of SOX2 cancer stem-like cell marker in colon cancer [36], has been investigated in CC, showing an up-regulation in CC cells [19] [37]. It was evidenced that elevating FOXP3 promotes the formation of tumor spheres and stimulates the stemness of non-small cell lung cancer cells [38].

Conclusion

Collectively, we explored for the first time that SOX2 transcription could activate CCAT1, thereby inhibiting miR-185-3p and regulating FOXP3 to promote the proliferation and self-renewal of CC stem cells, which is a potential avenue to treat CC. Additionally, however, limitations in this present study still exist in the relatively small trial size in the designed experiment. Thus, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy for the treatment of CC.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.

Geremde MicroRNA-301 remt angiogenese en celgroei bij slokdarm-plaveiselcelcarcinoom door verhoging van PTEN Multifunctionele toepassing van PVA-aided Zn-Fe-Mn-gekoppeld oxide nanocomposiet

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal