SOX2 moduleert de CCAT1/miR‑185‑3p/FOXP3 route om proliferatie en zelfvernieuwing van baarmoederhalskankerstamcellen te controleren

Samenvatting

Er is de rol van lange niet-coderende RNA's (lncRNAs) in baarmoederhalskanker (CC) gepresenteerd. We willen het effect van sex-bepalende regio Y-box 2 (SOX2)/lncRNA darmkanker-geassocieerd transcript-1 (CCAT1)/microRNA-185-3p (miR-185-3p)/forkhead box proteïne 3 (FOXP3) bespreken op de proliferatie en zelfvernieuwingscapaciteit van CC stamcellen. MiR-185-3p, SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies werden getest in CC-weefsels en cellen. De relatie tussen SOX2/CCAT1 expressie en clinicopathologische kenmerken in CC-patiënten werd geverifieerd. Verlies- en winst-van-functie onderzoeken werden uitgevoerd in CD44⁺HeLa cellen om biologische functies en zelfvernieuwingscapaciteit te bespreken. Uiteindelijk werden de relaties tussen SOX2, CCAT1, FOXP3 en miR-185-3p geverifieerd. MiR-185-3p expressie was verlaagd, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies verhoogd waren in CC-weefsels en cellen. SOX2 en CCAT1 expressies waren gekoppeld aan tumoromvang, lymfekliermetastasen en internationale federatie van gynaecologie en obstetrie stadium van CC. Down-reguleren van SOX2 of CCAT1 en up-reguleren van miR-185-3p resulteerde in inhibitie van proliferatie, invasie, migratie en celsfeervorming alsook apoptoseversnelling van CD44⁺HeLa cellen. SOX2 kon binden aan CCAT1 wat miR-185-3p expressie beïnvloedde, en FOXP3 werd getarget door miR-185-3p.

Inleiding

Baarmoederhalskanker (CC) is de vierde belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen met een geschatte 570.000 gevallen en 311.000 doden wereldwijd in 2018. Deze complexe ziekte betrekt een verscheidenheid aan factoren, waaronder genetische effecten en virale infectie. Met de ontwikkeling van humane papillomavirus co-testen en humane papillomavirus vaccinatie, resulteren vroege diagnostische procedures van cervicale dysplasie en kanker in een reductie in de incidentie, morbiditeit en sterfte van CC. Voor vroege CC-patiënten wordt chirurgie aanbevolen, zoals vruchtbaarheidssparende chirurgie, conebiopsie, radicale trachelectomie, bekkenlymphectomie, bekkenradiotherapie en brachytherapie. Vanwege metastasering of recidief in geavanceerde CC-patiënten is de prognose nog steeds slecht. Daarom is het nog steeds dringend om nieuwe en effectieve prognostische markers en therapeutische strategieën te identificeren om de behandeling van CC te verbeteren.

Sex-bepalende regio Y-box 2 (SOX2) is een kritisch lid van de transcriptiefactor SOX familie en wordt voornamelijk geëxprimeerd in embryonale en volwassen stamcellen en ook in tumorstamcellen. Het is onthuld dat SOX2 radioweerstand in CC moduleert via de hedgehog signaleringsroute. Een andere studie heeft aangetoond dat SOX2 cruciaal is voor het behoud van de subpopulatie van kankerstamcellen in CC cellijnen. Lange niet-coderende RNA's (lncRNAs) zijn een klasse RNA-moleculen met 200 nucleotiden in lengte. LncRNA darmkanker-geassocieerd transcript-1 (CCAT1) ligt op menselijk chroomosoom 8q24.21 en wordt beschouwd als een "hot spot" die resulteert in genetische mutaties in darmkanker. Een studie heeft gerapporteerd dat CCAT1 celdeling en invasie van CC versnelt. Volgens Jia et al. versterkt CCAT1 de proliferatie, migratie en invasie van CC cellen dramatisch. Bovendien heeft een andere studie onthuld dat CCAT1 de maligne graad van inflammatoire darmziekte versterkt door de darmbarrière te vernietigen door microRNA-185-3p (miR-185-3p) te verlagen. MiRNA kan de genexpressie omgekeerd controleren door mRNA te verlagen en vertaling te onderdrukken. In vitro experimenten in een eerdere studie hebben onthuld dat miR-185-3p nasofaryngealcarcinoom radioweerstand moduleert. Een andere studie impliceert dat miR-185 betrokken is bij eierstokkanker cisplatijnweerstand in vivo en in vitro. Forkhead box proteïne 3 (FOXP3) is een transcriptiefactor behorend tot de FOX proteïnen familie, die eerst is gevonden in regulatorische T (Treg) cellen en een vitale rol speelt in het behoud en proces van Treg cellen. Een studie rapporteert dat FOXP3 verbonden is met lymfangiogenese van CC. Een andere studie onthult dat het niveau van FOXP3 dramatisch gelinkt is aan het internationale federatie van gynaecologie en obstetrie stadium (FIGO stadium) en tumoromvang van CC. In deze studie onderzochten we daarom de effecten van SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 as op proliferatie en zelfvernieuwingscapaciteit van CC stamcellen.

Materialen en Methoden

Ethieke Goedkeuring en Toestemming om deel te nemen

De experimenten met mensen werden uitgevoerd in overeenstemming met de beginselen uiteengezet in de Verklaring van Helsinki. De studie werd goedgekeurd door het Institutionele Review Board van het Eerste Ziekenhuis van Jilin Universiteit. Alle deelnemers tekenden een document van geïnformeerde toestemming.

Studieonderwerpen

Van december 2016 tot december 2018 werden 39 gevallen van CC-weefsels en overeenkomstige angrenzende normale weefsels geoogst van CC-patiënten en bewaard in vloeibare stikstof. De inclusiecriteria waren als volgt: (1) Patiënten werden bevestigd als CC door pathologie van biopten in transcervicale en cervikale kanalen, cervikale afstrijkcytologie, cervikale jodiumtest, vaginale speculum en cervikale gewervel resectie. (2) Patiënten ontvingen geen radiotherapie en chemotherapie 2 weken voor de operatie. De exclusiecriteria waren als volgt: (1) patiënten die enige radiotherapie of chemotherapie ondergingen, (2) patiënten die niet akkoord gingen met de verzameling van het monster en (3) patiënten met immuunsysteemstoornissen.

Celselectie en Kweek

CC cellijnen (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 en C33A) en humane cervikale epitheele geïmmortaliseerde cellijn H8 werden gekocht van Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). CC cellen SiHa, HeLa en HCC94 werden gekweekt in hoog-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevattend 10% foetale kalfserum (FBS), terwijl CaSki, C33A en H8 cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium bevattend 10% FBS (37℃ en 5% CO₂). Cellen werden ontlachen en elk 2 dagen doorgegeven.

CC Stamcellen Sorteren (CD44⁺HeLa Cellen)

CC stamcellen werden gescheiden van CC cellijn HeLa door celsuspensiekweek. CC cellen HeLa werden gekweekt door serumvrij Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) in een ultra-lage adhesie Petrischaal gedurende 21 dagen met het medium halfkwantitatief elke 3-5 dagen uitgewisseld. Sommige cellen werden opgeslagen in sferen, en HeLa-sfeervormende cellen (SFCs) werden verkregen. De eigenschap van sferische cellen werd geïdentificeerd en geanalyseerd. Cellen werden ontlachen met trypsine en aangepast tot 1 × 10⁶ cellen/mL. Cellen werden toegevoegd met CD44 antilichaam en gesorteerd door stroomcytometrie. HeLa cellen met positieve CD44 waren HeLa tumorstamcellen, terwijl met negatieve CD44 HeLa niet-stamcellen waren. CC stamcellen werden gekweekt in DMEM/F12 en toegevoegd met 20 ng/mL basale fibroblast groeifactor (bFGF), 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) en B27. Het medium bevatte 1% penicilline en streptomycine.

Celbehandeling

CD44⁺HeLa cellen werden getransfecteerd met sh-SOX2, sh-SOX2 negatieve controle (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, miR-185-3p mimic, mimic NC, sh-CCAT1 en miR-185-3p inhibitor alsook sh-CCAT1 en inhibitor NC. Alle oligonucleotide sequenties werden geleverd door GenePharma (Shanghai, China). Ontlachen door trypsine, werden de cellen gezaaid in een 6-puttenplaat met 3 × 10⁶ cellen/put. Toen 60% confluens bereikt was, werden de cellen veranderd in serumvrij medium en 1 uur geïncubeerd. Transfectie werd vergemakkelijkt door Lipofectamine 2000 transfectiereagent (Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS).

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Kettingreactie (RT-qPCR)

RNA in weefsels en cellen werd geëxtraheerd door Trizol (Invitrogen). RNA (1 μg) werd omgekeerd in cDNA door moloney murine leukemia virus RTase kit (Invitrogen). cDNA werd toegevoegd aan real-time PCR systeem. Primers werden ontworpen door Shanghai Sangon Biotechnologie Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). U6 was de laadcontrole van miR-185-3p, terwijl glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase (GAPDH) van SOX2, CCAT1 en FOXP3. De resultaten werden geanalyseerd door 2^−ΔΔCt methode.

Western Blot Assay

Het totale eiwit in cellen en weefsels werd geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald door bicinchoninezuur kits (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, China). Het eiwit werd gemengd met laadbuffer en 5 min gekookt, gevolgd door ijsbad en centrifugatie. Het eiwit werd behandeld met 10% natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamidgelektroforese en overgebracht naar een membraam. Het membraam werd geblokkeerd met 5% magere melk gedurende 1 uur, getest met primaire antilichamen SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, China), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, VS), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS) en opnieuw getest met secundair antilichaam gemarkeerd met horseradish peroxidase, bedekt met conserveringsfolie en blootgesteld. Bio-rad Gel Doc EZ imager (Bio-rad, Californië, VS) werd gebruikt voor ontwikkeling. De eiwitafbeeldingen werden geanalyseerd door ImageJ2x software.

Cel Telling Kit (CCK)-8 Assay

CCK-8 assay werd geïmplementeerd met de kits (Beyotime, Shanghai, China). Cellen (1 × 10⁴) werden gezaaid in een 96-puttenplaat en geïncubeerd. Gekweekt gedurende 0, 24, 48 en 72 uur, werden cellen toegevoegd met 10 μL/put CCK-8 oplossing en 1 uur uitgebroed. De optische dichtheid waarde werd bepaald met Multiskan Spectrum vol-golfengte microplaatlezer bij 450 nm. Zes putten werden genomen om de gemiddelde waarde te tellen. De celdgroeicurve werd geplot met tijd als de y-as en de relatieve celvitaliteit als de y-as. De optische dichtheid waarde vertegenwoordigde celproliferatie.

Stroomcytometrie

Cellen (1 × 10⁶) werden gecentrifugeerd bij 1500 t/min, opgeschud met 200 μL bindingsbuffer, geïncubeerd met 5 μL propidium iodide (PI) en 5 μL Annexin V-fluoresceïne isothiocyaan (FITC) om de beurt en toegevoegd met 400 μL buffer. Celapoptosesnelheid werd geverifieerd door een stroomcytometer (BD Biosciences, NJ, VS).

Krabbeltest

De getransfecteerde cellen werden ontlachen en voorbereid in celsuspensie. Celsuspensies (1 × 10⁶ cellen/mL) werden gezaaid in een 6-puttenplaat en gekweekt tot 80-90% confluens. Transversale en longitudinale krabben op de 6-puttenplaat werden gelijkmatig gemaakt door een 10-μL steriele pipetpunt langs de liniaal. Het oorspronkelijke medium werd vervangen door compleet medium, en cellen werden continu gekweekt. De migratie van cellen werd waargenomen onder een microscoop bij 0 uur en 72 uur en op dezelfde plaats afgebeeld.

Transwell Assay

De getransfecteerde cellen werden getrypsineerd, gecentrifugeerd bij 1000 g en gespoeld met DMEM. Een volledig gehydrateerde Transwell kamer werd geplaatst in een 24-puttenplaat met 10% FBS-DMEM (600 mL/put). Celsuspensie (5 × 10⁵ cellen/mL, 200 μL) werd toegevoegd aan Transwell bovenkamer (bekleed met 1:8 Matrigel 80 μL), terwijl 500 μL 20% FBS-DMEM aan de onderkamer. Cellen werden continu 24 uur gekweekt, gefixeerd met 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) en gekleurd met 0,1% kristalviolet kleurstofoplossing. Vervolgens werden de cellen op het oppervlak en de rand van de bovenkamer weggeveegd met een katoenen zwab. Vijf velden werden willekeurig geselecteerd, en cellen werden geteld onder een Nikon Eclipse TE2000-S microscoop (Nikon, Japan).

Sfeervormingsassay

Cellen werden gezaaid in een lage adsorptie 6-puttenplaat met serumvrije suspensiemedium met 200 cellen/put. Na 2 weken werd de sfeervormingssnelheid van cellen waargenomen onder een Nikon Eclipse TE2000-S microscoop (Nikon), en de sfeervormingssnelheid werd berekend als gemiddeld aantal sferen/aantal gezaaide cellen × 100%.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) Assay

ChIP assay werd uitgevoerd met de ChIP kit (Upstate, NY, VS). SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, China) en normale konijn IgG (12-370, Millipore, VS) antilichamen werden gebruikt om het gekruiste eiwit-DNA complex te immunoprecipitaten. CD44⁺HeLa cellen werden gefixeerd met 1% PFA en geïncubeerd om DNA-eiwit kruising te produceren. Vervolgens werd DNA in 200-300 bp chromatine fragmenten gesneden door ultrasoon. Het geïmmunoprecipiteerde chromatine DNA werd hersteld en geanalyseerd door RT-qPCR.

RNA Pull-Down Assay

De biotine-gemarkeerde miR-185-3p wild-type (WT) en mutant-type (MUT) plasmiden (50 nM) werden respectievelijk getransfecteerd in CD44⁺HeLa cellen. Cellen werden 48 uur na transfectie uitgebroed met specifieke celyseringsbuffer (Ambion, Austin, Texas, VS). De celyseringsbuffer (50 mL) werd verdeeld. De resterende lysaat werd uitgebroed met M-280 streptavidine korrels (Sigma, St. Louis, MO, VS) voorbehandeld met RNase-vrij en gist tRNA (Sigma). Volgend daarop werden de cellen tweemaal gewassen met koude lysaat, driemaal met laag zout buffer en eenmaal met hoog zout buffer. Een antagonistische miR-185-3p probe werd ingesteld als NC. Het totale RNA werd geëxtraheerd door Trizol, en CCAT1 niveau werd getest door RT-qPCR.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

Potentiële bindingsplaatsen E1 en E2 van SOX2 op CCAT1 promotorregio werden voorspeld door https://jaspar.genereg.net/. De CCAT1 promotorsequentie met SOX2 en CCAT1 bindingsplaats E1 werd gesynthetiseerd, en de CCAT1 3'UTR WT (E1-WT) en CCAT1 3'UTR MUT (E1-MUT) vectoren werden gevormd. De vectoren werden gekloond in pmirGLO (Beyotime). Daarna werd CCAT1-WT/pmirGLO of CCAT1-MUT/pmirGLO gecotransfecteerd met sh-SOX2 of sh-SOX2 NC naar CD44⁺HeLa cellen, respectievelijk, voor 2 dagen en daarna gelyseerd. De luciferase activiteit werd getest door luciferase detectiesysteem (Takara, Dalian, China).

Bio-informatica website werd gebruikt voor het voorspellen en analyseren van de bindingsplaatsen van CCAT1 en miR-185-3p. De bindingsplaatsen van CCAT1 en miR-185-3p werden geverifieerd door dubbele luciferase reporter gen assay. CCAT1 3'UTR met miR-185-3p bindingsplaats werd samengesteld. CCAT1 3'UTR WT en CCAT1 3'UTR MUT werden geconstrueerd en gecotransfecteerd met mimics NC en miR-185-3p mimics naar CD44⁺HeLa cellen voor 2 dagen. Vervolgens werden cellen gelyseerd en luciferase activiteit getest door luciferase detectiesysteem (Takara). Dezelfde methode werd toegepast om de targetrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 te verifiëren.

Statistische Analyse

Alle data werden geëvalueerd door SPSS 21.0 software (IBM Corp. Armonk, NY, VS). De meetdata werden aangeduid als gemiddelde ± standaarddeviatie. De t-toets werd toegepast voor discrepantie tussen twee groepen en eénrichtings variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's multiple vergelijkingen toets voor discrepantie onder groepen. De classificatievariabele werd beoordeeld door Fisher's exacte toets. Een p waarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

MiR-185-3p Expressie Daalt, Terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 Expressies Stijgen in CC Weefsels, en SOX2 en CCAT1 Expressies zijn Gekoppeld aan Tumoromvang, Lymfekliermetastasen (LNM) en FIGO Stadium

Bij het detecteren van de rol van SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 as op de proliferatie en zelfvernieuwingscapaciteit van CC stamcellen, werden miR-185-3p, SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies in CC-weefsels en angrenzende normale weefsels getest door RT-qPCR en western blot assay. Het werd geopenbaard dat (Fig. 1a-c) miR-185-3p expressie was verlaagd, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies verhoogd waren in CC-weefsels.

MiR-185-3p expressie daalt, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies stijgen in CC weefsels. a Vergelijking van SOX2 mRNA, CCAT1, miR-185-3p en FOXP3 mRNA expressie in CC en angrenzende normale weefsels. b Eiwitbanden van SOX2 en FOXP3 eiwitexpressie in CC en angrenzende normale weefsels. c Vergelijking van SOX2 en FOXP3 eiwitexpressie in CC en angrenzende normale weefsels. *p < 0,05 vs. angrenzende normale weefsels. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld door t-toets

De relatie tussen SOX2/CCAT1 expressie en clinicopathologische kenmerken van CC werd geanalyseerd (Tabel 2). Overexprimeerde SOX2 en CCAT1 in CC waren verbonden met tumoromvang, LNM en FIGO stadium, wat aangeeft dat SOX2 en CCAT1 expressies hoger waren in patiënten met grotere tumoromvang, LNM en geavanceerd FIGO stadium van CC-patiënten.

MiR-185-3p Expressie Vermindert, Terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 Expressies Stijgen in CD44⁺HeLa Cellen

Vervolgens werden miR-185-3p, SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies in humane cervikale epitheele geïmmortaliseerde cel H8 en CC cellijnen SiHa, CasKi, HeLa, HCC94 en C33A getest. Het werd gesuggereerd dat (Fig. 2a-c) miR-185-3p expressie was gedegradeerd, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 verhoogd waren in CC cellijnen. Onder hen had SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 in HeLa cellen het grootste expressieverschil met H8 cellen; dus werden HeLa cellen uitgeselecteerd en gesorteerd; HeLa-SFCs werden verkregen door celsuspensiekweken, en CD44 expressie in celoppervlak voor en na sortering werd geïdentificeerd door stroomcytometrie. De resultaten benadrukten dat de positieve graad van CD44 in HeLa-SFCs aanzienlijk hoger was dan die voor sortering, wat een succesvolle sortering van CC stamcellen suggereert (Fig. 2d). De gesorteerde stamcellen werden benoemd als CD44⁺HeLa cellen. Vervolgens werden miR-185-3p, SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies getest in HeLa en CD44⁺HeLa cellen (Fig. 2e-g). Het werd geopenbaard dat SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies up-reguleerd waren en miR-185-3p down-reguleerd in CD44⁺HeLa cellen.

MiR-185-3p expressie vermindert, terwijl SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies stijgen in CD44⁺HeLa cellen. a Vergelijking van SOX2 mRNA, CCAT1, miR-185-3p en FOXP3 mRNA expressie in H8 en CC cellijnen. b Eiwitbanden van SOX2 en FOXP3 eiwitexpressie in H8 en CC cellijnen. c Vergelijking van SOX2 en FOXP3 eiwitexpressie in H8 en CC cellijnen. d Detectie van CD44 expressiegraad in HeLa cellen voor en na sortering door stroomcytometrie. e Vergelijking van SOX2 mRNA, CCAT1 en miR-185-3p expressie tussen HeLa cellen en CD44⁺HeLa cellen. f Eiwitband van SOX2 eiwitexpressie in HeLa cellen en CD44⁺HeLa cellen. g Vergelijking van SOX2 eiwitexpressie tussen HeLa cellen en CD44⁺HeLa cellen. ^p < 0,05 vs. H8 cellen. ^&p < 0,05 vs. HeLa cellen. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld door t-toets, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eénrichtings ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc toets

Down-reguleren van SOX2 en Down-reguleren van CCAT1 Verminderen Proliferatie, Migratie, Invasie en Sfeervormingssnelheid en Verhogen Apoptose van CD44⁺HeLa Cellen

Vervolgens werden SOX2 en CCAT1 gedempt in CD44⁺HeLa cellen om hun effecten op de proliferatie en zelfvernieuwing van CC stamcellen te verkennen. Gedetecteerd door CCK-8 assay, stroomcytometrie, krabbeltest, Transwell assay en sfeervormingsexperiment, werden de proliferatie, migratie, invasie en sfeervormingssnelheid onderdrukt en apoptose van CD44⁺HeLa cellen bevorderd door inhibitie van SOX2 en CCAT1 (Fig. 3a-i). Het was indicatief dat dempen van SOX2 of CCAT1 de proliferatie en zelfvernieuwing van CC stamcellen remde.

Down-reguleren van SOX2 en down-reguleren van CCAT1 verminderen proliferatie, migratie, invasie en sfeervormingssnelheid en verhogen apoptose van CD44⁺HeLa cellen. a CCK-8 assay geteste celdgroeicurve in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. b Stroomcytometrie detecteerde celapoptose in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. c Vergelijking van celapoptosesnelheid in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. d Celmigratie in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2 getest door krabbeltest. e Vergelijking van celmigratie in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. f Detectie van invasievaardigheid van cellen in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2 door Transwell assay. g Vergelijking van de invasievaardigheid van cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. h Sfeervormingsexperiment geteste zelfvernieuwingscapaciteit in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. i Vergelijking van sfeervormingssnelheid in cellen behandeld met sh-CCAT1 of sh-SOX2. a p < 0,05 vs. de sh-SOX2 NC groep. b p < 0,05 vs. de sh-CCAT1 NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eénrichtings ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc toets

Uitgeputte miR-185-3p Keert de Rol van Down-regulatie van CCAT1 in CD44⁺HeLa Cellen Om

Toen onderzochten we of miR-185-3p betrokken was in het proces van CCAT1 het reguleren van de proliferatie en zelfvernieuwing van CC stamcellen. CD44⁺HeLa werd getransfecteerd met miR-185-3p mimic of gecotransfecteerd met sh-CCAT1 en miR-185-3p inhibitor. De resultaten presenteerden dat up-regulatie van miR-185-3p aanzienlijk proliferatie, migratie, invasie en sfeervormingssnelheid verlaagde terwijl apoptosesnelheid van CD44⁺HeLa cellen verhoogde. Cellen behandeld met miR-185-3p inhibitor konden de rol van down-gereguleerde CCAT1 in proliferatie, migratie, invasie, apoptose en celsfeervorming van CD44⁺HeLa cellen omkeren (Fig. 4a-i).

Overexprimeerde miR-185-3p onderdrukt proliferatie, migratie, invasie en sfeervormingssnelheid en verhoogt apoptose van CD44⁺HeLa cellen. a CCK-8 assay geteste celdgroeicurve in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. b Stroomcytometrie detecteerde celapoptose in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. c Vergelijking van celapoptosesnelheid in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. d Celmigratie in cellen behandeld met miR-185-3p mimic getest door krabbeltest. e Vergelijking van celmigratie in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. f Detectie van invasievaardigheid van cellen behandeld met miR-185-3p mimic door Transwell assay. g Vergelijking van de invasievaardigheid van cellen behandeld met miR-185-3p mimic. h Sfeervormingsexperiment geteste zelfvernieuwingscapaciteit in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. i Vergelijking van sfeervormingssnelheid in cellen behandeld met miR-185-3p mimic. a p < 0,05 vs. de sh-SOX2 NC groep. b p < 0,05 vs. de sh-CCAT1 NC groep. c p < 0,05 vs. de mimic NC groep. d p < 0,05 vs. de sh-CCAT1 + inhibitor NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eénrichtings ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc toets

Laag Geëxprimeerde SOX2 en Laag Geëxprimeerde CCAT1 Verminderen FOXP3 Expressie en Verhogen miR-185-3p Expressie in CD44⁺HeLa Cellen

Daarna onderzochten we SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 expressie in CD44⁺HeLa cellen na transfectie van sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p mimic en gecotransfectie van sh-CCAT1 en miR-185-3p inhibitor. SOX2, CCAT1 en FOXP3 expressies werden verlaagd, terwijl miR-185-3p expressie verhoogd was in cellen behandeld met sh-SOX2. CCAT1 en FOXP3 expressies werden verlaagd, en miR-185-3p expressie werd verhoogd in cellen behandeld met sh-CCAT1. MiR-185-3p expressie werd verhoogd, en FOXP3 expressie werd verlaagd in cellen geïntroduceerd met miR-185-3p mimic. FOXP3 expressie werd verhoogd, en miR-185-3p expressie werd verlaagd in cellen opeenvolgend getransfecteerd met sh-CCAT1 en miR-185-3p inhibitor (Fig. 5a-d).

Laag geëxprimeerde SOX2 en laag geëxprimeerde CCAT1 verminderen FOXP3 expressie en verhogen miR-185-3p expressie in CD44⁺HeLa cellen. a SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 expressie in de sh-SOX2 NC en sh-SOX2 groepen. b SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 expressie in de sh-CCAT1 NC en sh-CCAT1 groepen. c SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 expressie in de mimic NC en miR-185-3p mimic groepen. d SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 expressie in de sh-CCAT1 + inhibitor NC en sh-CCAT1 + miR-185-3p inhibitor groepen. a p < 0,05 vs. de sh-SOX2 NC groep. b p < 0,05 vs. de sh-CCAT1 NC groep. c p < 0,05 vs. de mimic NC groep. d p < 0,05 vs. de sh-CCAT1 + inhibitor NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eénrichtings ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc toets

SOX2 Bindt aan CCAT1 Wat miR-185-3p Expressie Beïnvloedt, en FOXP3 is een Target Gen van miR-185-3p

De potentiële bindingsplaatsen van CCAT1 promotorregio transcriptiefactor werden voorspeld en geanalyseerd door https://jaspar.genereg.net/ website, en het toonde aan dat SOX2 en CCAT1 potentiële bindingsplaatsen hadden in CCAT1 promotorregio (Fig. 6a). ChIP-qPCR rapporteerde dat (Fig. 6b): In contraste met de IgG groep, werden meer CCAT1 promotorfragmenten verrijkt in de SOX2 groep bij de E1 bindingsplaats, wat bewijst dat SOX2 gebonden was aan CCAT1 promotor op de E1 plaats en SOX2 betrokken was in de regulatie van CCAT1. Dubbele luciferase reporter gen assay toonde aan dat (Fig. 6c): De luciferase activiteit werd onderdrukt in cellen gecotransfecteerd met sh-SOX2 en E1-WT, wat aangeeft dat SOX2 kon binden aan CCAT1.

SOX2 kan binden aan CCAT1 wat miR-185-3p expressie beïnvloedt, en FOXP3 is een target gen van miR-185-3p. a Voorspelling van bindingsplaatsen in SOX2 en CCAT1 promotorregio's door bio-informatica sites. b ChIP-qPCR experiment geverifieerd de bindingsrelatie tussen SOX2 en CCAT1. c De bindingsplaats van SOX2 en CCAT1 geverifieerd door dubbele luciferase reporter gen assay. d Voorspelling van bindingsplaatsen in CCAT1 en miR-185-3p door bio-informatica sites. e Verificatie van de binding van CCAT1 en miR-185-3p door dubbele luciferase reporter gen assay. f De bindingsrelatie tussen CCAT1 en miR-185-3p in cellen geverifieerd door RNA pull-down assay. g Voorspelling van de targetrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 door bio-informatica website. h Identificatie van de targetrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 door dubbele luciferase reporter gen assay. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld door t-toets

Jefferson website voorspelde dat CCAT1 kon binden aan miR-185-3p (Fig. 6d). Dubbele luciferase reporter gen assay rapporteerde dat (Fig. 6e) de luciferase activiteit afnam in cellen geïntroduceerd met miR-185-3p mimic en CCAT1-WT, wat suggereert dat miR-185-3p kon binden aan CCAT1. RNA pull-down assay werd gebruikt om te verifiëren of CCAT1 kon binden met miR-185-3p. De resultaten onthulden dat (Fig. 6f) het verrijkingsniveau van CCAT1 in cellen behandeld met Bio-miR-185-3p-WT aanzienlijk toenem, terwijl het verrijkingsniveau van CCAT1 in cellen behandeld met Bio-miR-185-3p-MUT geen significant verschil vertoonde. Dit resultaat toonde aan dat CCAT1 miR-185-3p kon adsorberen, waardoor miR-185-3p expressie beïnvloed werd.

De targetrelatie tussen miR-185-3p en FOXP3 werd voorspeld door Jefferson website (Fig. 6g). Dubbele luciferase reporter gen assay verifieerde dat (Fig. 6h) de relatieve luciferase activiteit van cellen dramatisch afnam na FOXP3-WT en miR-185-3p mimic gecotransfecteerd naar CD44⁺HeLa cellen, terwijl FOXP3-MUT gecotransfecteerd met miR-185-3p mimic de relatieve luciferase activiteit van cellen niet beïnvloedde, wat suggereert dat miR-185-3p FOXP3 targette.

Discussie

CC is de vierde frequente maligniteit bij vrouwen in de wereld, gevolgd door kankers van borst, darm en long. Het is gerapporteerd dat CC cellen met positieve SOX2 expressie de kenmerken van kankerstamcellen vertonen. Een studie heeft gerapporteerd dat CCAT1 een essentiële oncogene lncRNA is gerelateerd aan CC en een faciliterende rol uitoefent in CC celdeling en invasie. Een andere studie onthult dat miR-185-3p radiosensitiviteit van nasofaryngealcarcinoom kan voorspellen en de groei en apoptose van kankercellen reguleert. Het is gerapporteerd dat het circulerende antilichaam tegen FOXP3 de continue voortgang van de cervicale laesie weerspiegelt en een potentiële biomarker kan zijn voor de vroege prognose van CC. De huidige studie was ontworpen om te verkennen hoe SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 as de proliferatie en zelfvernieuwingscapaciteit van CC stamcellen beïnvloedde.

Gebaseerd op onze bevindingen, waren SOX2 en CCAT1 expressies verhoogd in CC-weefsels en cellen die gekoppeld waren aan tumoromvang, LNM en geavanceerd FIGO. Functioneel bewijzen, down-reguleren van SOX2 en CCAT1 verlaagde proliferatie, migratie, invasie en sfeercellen aantal en verhoogde apoptose van CC stamcellen. Vergelijkbaar met onze studie, neigt SOX2 expressie toe te stijgen in CC. Bovendien is SOX2 expressie ook up-reguleerd in CC cellen afkomstig van kankerstamcellen. Overexprimeerde SOX2 werd voorgesteld om te linken met clinicopathologische kenmerken van patiënten met diverse typen kanker, niet beperkt tot CC. Bijvoorbeeld, werd voorgesteld dat up-gereguleerde SOX2 verschijnt in plaveiselcelcarcinoom van de baarmoederhals patiënten gestadifeerd in FIGO I-II. Bovendien is SOX2 expressie gelinkt aan LNM in mondholte plaveiselcelcarcinoom. Wanneer het gaat om de moleculaire functie van SOX2 voor kankerprogressie, is er een observationeel werk dat presenteert dat down-gereguleerde SOX-2 celmigratie en invasie van plaveiselcelcarcinoom van de baarmoederhals onderdrukt. Tegelijkertijd heeft een ander onderzoek een bewijs aangeboden dat up-gereguleerde SOX2 CC cel clonogeniciteit, proliferatie en tumorgeneticiteit in vitro en in vivo versterkt dan controle cellen.

Wat betreft de regulatorische relatie tussen SOX2 en CCAT1, heeft een bestaande studie gepresenteerd dat dempen van SOX2 CCAT1 mRNA niveau aanzienlijk verlaagt. Wat betreft de rol van CCAT1 in kankers, heeft een studie getoond dat CCAT1 expressie aanzienlijk verhoogd is in CC-weefsels versus in de angrenzende normale weefsels. Opmerkelijk is dat CCAT1 overexpressie in CC positief gerelateerd is aan tumoromvang. In termen van de rol van CCAT1 in kankercelactiviteit, is er een onderzoek dat benadrukt dat overexprimeerde CCAT1 CC celdeling, kolonievorming en invasie versnelt. Interessant heeft een eerdere studie aangetoond dat celvitaliteit, invasieve en migratoire vaardigheden worden verlaagd via uitschakelen van CCAT1. Toch was het functionele effect van SOX2 en CCAT1 in andere kankers vergelijkbaar met dat in CC.

Vervolgens onthulde ons onderzoek dat CCAT1 kon binden aan miR-185-3p, de down-gereguleerde CCAT1 in CC en overexpressie van miR-185-3p onderdrukte de proliferatie en zelfvernieuwingscapaciteiten van CC stamcellen. Het is gerapporteerd dat CCAT1 en miR-185-3p negatief gecorreleerd zijn. Verder rapporteerde een resultaat dat een reductie gezien werd in miR-185-3p expressie in radioweerstand nasofaryngealcarcinoom gevallen. Wat betreft de onderdrukkende functie van miR-185-3p in kankercelagressiviteit, heeft een studie onthuld dat up-regulatie van miR-185-3p de invasieve en metastatische eigenschappen van nasofaryngealcarcinoom cellen onderdrukt. Verder hebben Zou et al. gesuggereerd dat herstelde miR-185 borstkankercelgroei en invasie onderdrukt. Er is een artikel dat vindt dat up-regulatie van miR-185 de proliferatie, invasie en kolonievormingscapaciteiten van niet-kleincel longkanker cellen in vitro verlaagt. Het is gepresenteerd dat in vitro celdeling, invasie en migratie alsook in vivo tumorgroei worden onderdrukt via miR-185-overexpressie in niet-kleincel longkanker cellen. Uit die studies was de anti-tumor rol van miR-185-3p in de huidige studie consistent met eerdere onderzoeken.

Om door te gaan, onthulden we dat miR-185-3p FOXP3 targette, het overexprimeerde gen in CC om CC stamcelactiviteiten te reguleren. In feite is FOXP3, de regulator van SOX2 kankerstamcel-achtige marker in darmkanker, onderzocht in CC, wat een up-regulatie in CC cellen toont. Het was bewijzen dat verhoogde FOXP3 de vorming van tumor-sferen bevordert en de stamcelheid van niet-kleincel longkanker cellen stimuleert.

Conclusie

Collectief hebben we voor het eerst onderzocht dat SOX2 transcriptie CCAT1 kan activeren, daarbij miR-185-3p remt en FOXP3 reguleert om de proliferatie en zelfvernieuwing van CC stamcellen te bevorderen, wat een potentiële weg is om CC te behandelen. Daarnaast bestaan er echter nog beperkingen in deze huidige studie in de relatief kleine proefgrootte in het ontworpen experiment. Dus klinische onderzoeken kunnen verder worden uitgevoerd om de effectiviteit voor de behandeling van CC te detecteren.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing.