Synthese van geel-fluorescerende koolstof nano-dots door Microplasma voor beeldvorming en fotokatalytische inactivatie van kankercellen

Resultaten en discussie

Karakterisering van CQD's

De geel-emitterende CQD's in deze studie worden op een gemakkelijke en milieuvriendelijke manier bereid door een microplasmamethode met behulp van o -fenyleendiamine als de koolstofvoorloper. Hoewel is gemeld dat de methode van microplasmaverwerking wordt gebruikt voor de synthese van koolstofnanopunten, bestaan ​​er zeldzame relatieve onderzoeken. Figuur 1A toont transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) beelden van de CQD-deeltjes. De door microplasma geproduceerde deeltjes waren cyclo-scherp of ovaal van vorm met een gemiddelde diameter van 3,2 nm. Zoals getoond in de afbeelding met hoge resolutie Fig. 1A (inzet), is de roosterafstand in de CQD's 0,21 nm, behorend tot het (1,1,0) vlak van grafiet. Het Raman-spectrum laat zien dat de D-modus, genoemd als de door stoornis veroorzaakte modus, zich op ongeveer 1342 cm ⁻¹ bevindt. en G-modus centreert rond 1507 cm ⁻¹ , respectievelijk, vanwege het resultaat van sp ³ en sp ² -hybridisatie van koolstof (Fig. 1E). Het is bekend dat de intensiteit van de D-modus in vergelijking met de G-modus afhangt van de grootte van de grafietmicrokristallen in het monster. De hogere wanorde van het monster leidt tot de hogere intensiteitsverhouding van ID/IG en het kleinere grafietmicrokristal. Verder kunnen de D- en G-modus van CQD-poeders ook worden gezien als kleine grafietvlokken met een relatief hoge intensiteitsverhouding van ID/IG (0,77).

Karakteriseringen van CQD's. A TEM-afbeeldingen van CQD's (inzet, TEM-afbeeldingen met hoge resolutie); B Grootteverdelingen van CQD's; C UV-vis absorptiespectra van de CQD's; D Het FL-spectrum van de CQD's met excitatiegolflengten van 400 tot 500 nm in stappen van 20 nm; E , V Raman-spectrum van CQD's en FTIR-spectrum van CQD's

FTIR en XPS zijn krachtige hulpmiddelen om de chemische samenstelling en structuur van op koolstof gebaseerde materialen te karakteriseren. FTIR-gegevens voor CQD's werden geregistreerd in het bereik van 400–4000 cm ⁻¹ , zoals weergegeven in Fig. 1F. Uit het FTIR-spectrum bleek dat de CQD's voornamelijk amine bevatten (3052 en 3324 cm ⁻¹ ), OH (3200 cm ⁻¹ ), C=O (1595 cm ⁻¹ ), C–N/C–O (1200 cm ⁻¹ ), C=C (1500 cm ⁻¹ ) en CH (748 cm ⁻¹ ) functionele groepen of chemische bindingen [26, 27]. De oppervlaktecomponenten van de CQD's, zoals bepaald door XPS, waren consistent met de FTIR-resultaten. Het volledige spectrum gepresenteerd in Fig. 2A vertoonde drie typische pieken:C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), en O 1s (531 eV).

XPS-spectra van CQD's. A Volledige XPS-spectra van de CQD's; B Hoge resolutie van C 1s spectrum; C hoge resolutie van N 1s spectrum; D Hoge resolutie van O 1s spectrum

Zoals getoond in Fig. 2B–D, een C 1s analyse onthulde de aanwezigheid van sp ² /sp ³ koolstoffen (C–C/C=C, 284,8 eV), nitreuze koolstoffen (C–O/C-N, 285,9 eV) en carbonylkoolstoffen (C=O, 287,7 eV). De N 1s band werd gedeconvolueerd in drie pieken bij 399,3, 400,3 en 401,7 eV, die respectievelijk overeenkomen met pyrrolisch N, grafiet N en amino N. De O 1s band bevatte pieken bij 531,6 en 533,1 eV voor respectievelijk C–O en C=O [28, 29]. Belangrijk is dat het bestaan ​​van deze bovengenoemde functionele groepen CQD's een gunstige oplosbaarheid gaf. Verder werden de optische eigenschappen van CQD's onderzocht met behulp van fluorescentiespectroscopie en UV-Vis-absorptie. De fluorescentie-emissiespectra van CQD's worden getoond in figuur 1C. De bereide CQD's vertonen een excitatie-afhankelijk fluorescentie-emissiegedrag. Wanneer geëxciteerd bij golflengten van 400 tot 500 nm, verschoof de maximale fluorescentie-emissiepiek naar rood van 473 naar 519 nm en nam de fluorescentie-intensiteit sterk af [30]. Zoals weergegeven in figuur 1D, vertoonden de UV-vis-spectra van CQD een sterke absorptiepiek in het golflengtebereik van 400-490 nm. De CQD's vertoonden twee karakteristieke absorptiepieken bij 280 en 420 nm, die respectievelijk verwezen naar π–π* (aromatische C=C) en n–π* (carboxyl en/of C–N) overgangen [31, 32]. Daarom boden deze optische eigenschappen van CQD's haalbaarheid voor gelijktijdige biologische beeldvorming en fotodynamische inactivatie.

Biobeeldvorming en cytotoxiciteit van CQD's

Om het vermogen van CQD's voor bioimaging en cellabeling te beoordelen, werd in vitro cellulaire beeldvorming met behulp van CQD's onderzocht op HeLa-cellen door een confocale laserscanningmicroscoop (CLSM). Hela-cellen werden geïncubeerd met 200 μg mL ⁻¹ CQD's gedurende 6 uur en vervolgens voorbereid op CLSM-detectie. Als resultaat vertoonden HeLa-cellen een heldergele fluorescentie die gelijkmatig over de cel was verdeeld (figuur 3A). Wat nog belangrijker is, moet worden opgemerkt dat een lage CQD-concentratie van 200 μg mL ⁻¹ was genoeg om Hela-cellen te labelen met gele fluorescentie, wat de mogelijkheid van CQD's in celbeeldvorming verder specificeerde. Zoals is gemeld, vertoonden koolstofnanodeeltjes altijd een sterke emissie alleen in het blauwlichtgebied, terwijl de emissies over lange golflengten meestal zwak waren. Onder UV-excitatie vertoonden biologische weefsels vaak blauwe autofluorescentie en waren ze kwetsbaar voor fotoschade, wat de biologische beeldanalysetoepassingen van koolstofnanodeeltjes met kortegolflengte-emissies ernstig belemmert [33]. Daarom was de ontwikkeling van koolstofnanodeeltjes met emissies op lange golflengten wijdverbreid. In de huidige studie vertoonden de zoals voorbereide CQD's felgele fluorescentie onder de excitatie van een 400-450 nm licht. De geëxciteerde gele fluorescentie zou het mogelijk kunnen maken om CQD's te gebruiken voor de detectie van diepgewortelde tumoren. Er is echter nog een lange weg te gaan voor praktische toepassingen in de beeldvorming van kanker bij de mens.

Toepassing van CQD's. A CLSM-beeldvorming van HeLa-cellen gelabeld met CQD's; B In vitro cytotoxiciteitstest van CQD's; C Relatieve levensvatbaarheid van HeLa-cellen die zijn geïncubeerd met controleoplossing of CQD's (200 μg mL ⁻¹ ) en blootgesteld aan blauw licht (460 nm, 30 mW cm ⁻² ) gedurende 5 min, 10 min en 15 min; D De IC50 van aangeslagen CQD's op Hela-cellen na blootstelling aan blauw licht gedurende 10 en 15 min (*P < 0.05)

Naast luminescentiekenmerken zijn altijd hoge biocompatibiliteit en lage toxiciteit vereist als CQD's bedoeld zijn om te worden ontwikkeld als een potentieel biolabelingsreagens. Voor biomedische toepassingen moeten materialen in hoge mate biocompatibel zijn bij de aanbevolen doseringen. Om cytotoxiciteit te onderzoeken, werden HeLa-cellen behandeld met CQD's in eindconcentraties variërend van 0 tot 400 μg mL ⁻¹ voor 24 uur. Zoals getoond in Fig. 3B overleefde meer dan 95% van de cellen zoals bepaald met MTT (3-(4,5-dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide)-assays, waaruit bleek dat CQD's praktisch niet- giftig.

Deze gegevens suggereren dat de nieuw gegenereerde CQD's met opgewonden gele fluorescentie een lage cytotoxiciteit en hoge biocompatibiliteit hebben, wat hun veelbelovende vooruitzicht op biologische beeldvorming faciliteert.

Werkzaamheid van fotodynamische therapie

Inactivatie van kankercellen

Zoals getoond in Fig. 3C, verschilde de levensvatbaarheid niet tussen HeLa-cellen die werden behandeld met CQD's of alleen blauw licht. Gelijktijdige behandeling met CQD's en blauw licht verminderde de levensvatbaarheid van Hela-cellen aanzienlijk, afhankelijk van de duur van de blootstelling aan foto's. Na bestraling bij 460 nm gedurende 15 minuten vertoonden de CQD's opmerkelijke antitumoractiviteit; de levensvatbaarheid van HeLa-cellen nam met ongeveer 40% af bij een concentratie van 200 μg mL ⁻¹ . Om de effecten van de aangeslagen CQD's verder te detecteren, werden MTT-assays geïmplementeerd om de halfmaximale remmende concentratie (IC50) van aangeslagen CQD's op Hela-cellen te evalueren. Als gevolg hiervan was de IC50 van CQD's na excitatie op Hela-cellen ongeveer 427,5 μg mL ⁻¹ (95%-BI 366,7-498,7 μg mL ⁻¹ ) na een bestraling van 10 minuten en was ongeveer 255,1 μg mL ⁻¹ (95%-BI 220,9–249,8 μg mL ⁻¹ ) na 15 min blootstelling aan blauw licht.

Deze resultaten gaven aan dat de opgewonden CQD's tumorcellen effectief konden doden, zoals sommige klinische geneesmiddelen tegen kanker, zoals Photofrin [34], wat leidde tot de veelbelovende waarde van CQD's in beeldgestuurde antitumortherapie.

ROS-generatie van CQD's

Tijdens PDT kunnen kankercellen worden gedood door cytotoxische ROS gegenereerd door de endocytose fotosensitizer onder geschikte bestralingsomstandigheden [35, 36]. ROS kan doelcellen inactiveren door apoptose of necrose met weinig bijwerkingen via PDT bij verschillende ziekten [37,38,39,40]. Inspectie van Fig. 4A toonde aan dat ROS-reagens rode fluorescentie uitzendt, wat wijst op het genereren van ROS. Bovendien overlapte het rode signaal van ROS goed met de fluorescentie van CQD's, wat betekent dat het genereren van ROS nauw verband hield met de opname van CQD's door tumorcellen. Zoals getoond in figuur 4B, vergeleken met de controlegroepen en geen laserbestralingsgroepen, vertoonden de experimentele groepen onder 460 nm laserbestraling gedurende 15 minuten een duidelijke ROS-generatie. Onze resultaten gaven aan dat CQD's de productie van de intracellulaire ROS aanzienlijk konden bevorderen onder de bestraling van een laser van 460 nm en een groot potentieel hadden voor toepassing in PDT. In principe kunnen de CQD's worden geëxciteerd van de grondtoestand (S0 in Fig. 4C) naar een aangeslagen toestand (Sn in Fig. 4C), en de efficiëntie van dit proces wordt bepaald door de intensiteit van de lichtbron en de extinctiecoëfficiënt . Na door oplosmiddel gemedieerde relaxatie blijven CQD's op het laagste trillingsniveau van de eerste aangeslagen toestand van het singlet. Vanwege de snelle vibratie-relaxatie na excitatie, is de energie van het foton dat wordt uitgezonden vanuit de eerste singlet-aangeslagen toestand (S1 in Fig. 4C) lager dan de energie van het excitatiefoton, wat resulteert in een toename van de golflengte. Fluorescentiebeeldvorming maakt gebruik van de CQD's-overgang van S0 naar Sn naar S1 [41]. De CQD's werden ingenomen door HeLa-tumorcellen en straalden fluorescentie uit wanneer ze werden belicht door een geschikte golflengtebron, waardoor de cellen konden worden gelabeld. S1 kan terugkeren naar de S0-toestand door fluorescentie of door intersysteemkruising naar een niet-fluorescerende triplet-geëxciteerde toestand (T1 in Fig. 4C) [7, 42]. De fluorescerende groep van T1 is vooral actief in elektronenoverdrachtsreacties, waarbij vrije radicalen van superoxide worden gegenereerd, wat vervolgens resulteert in degradatie van fluorescerende groepen. De energie van T1 overgebracht naar moleculaire zuurstof zou een geëxciteerd singlet zuurstofoxidatiemiddel produceren dat sterker is dan moleculaire zuurstof in de grondtoestand. De superoxideradicalen en singletzuurstof, evenals andere ROS, waaronder OH en H₂ O₂ , reageren met nabijgelegen biologische moleculen om fototoxiciteit uit te oefenen, wat leidt tot celdood. Nadat de CQD's waren opgenomen door HeLa-cellen, resulteerde verlichting in de overdracht van de singlet-toestand naar de triplet-toestand via het intersysteem, en het proces van energieoverdracht produceerde ROS en leidde uiteindelijk tot celdood. Onder de juiste golflengtebron ondergaan de CQD's twee soorten energieoverdracht. Fluorescentie werd uitgezonden om HeLa-tumorcellen te markeren en HeLa-cellen werden gedood door ROS. Onze experimentele gegevens onthulden de goede biocompatibiliteit van de nieuw geproduceerde CQD's in het donker en de tumordodende efficiëntie onder lichtomstandigheden. Daarom zouden de CQD's kunnen worden gebruikt als fotosensibilisator voor tumorcellen en weefsels.

Intracellulaire ROS-generatie. A Fluorescentiebeelden van HeLa, (a) Helderveldtransmissiebeeld, (b) CQDs-fluorescentiebeeld verzameld in het bereik van 400-450 nm, (c) ROS-detectiereagensfluorescentiebeeld vastgelegd in het bereik van 510-530 nm, en (d ) de samengevoegde afbeelding; B De intracellulaire ROS-productie voor verschillende concentraties CQD's met of zonder bestraling gedurende 15 minuten; C een vereenvoudigd energieniveaudiagram toont potentiële fluorescentie- en celdood-energieoverdrachtsroutes. (S0, grondtoestand van het fluorofoormolecuul; S1, eerste aangeslagen singlettoestand; Sn (n> 1); T1, eerste triplet aangeslagen toestand; Ex, excitatie door fotonabsorptie; FL, fluorescentie)

Bovendien is het nog steeds een onopgelost probleem hoe CQD's tumor nauwkeurig kunnen targeten en tumorcellen effectiever kunnen doden. De bestaande overvloed aan functionele hydrofiele groepen aan het oppervlak (carboxyl, carbonyl, epoxy, hydroxyl, hydroxyl, enz.) stelt koolstofstippen in staat om te conjugeren met specifiek antilichaam dat zich precies op tumoren zou kunnen richten, en dit vereist dat de tumor specifieke biomarkers heeft. Tegelijkertijd zouden koolstofstippen ook kunnen dienen als een hulpmiddel voor medicijn- en genafgifte vanwege hun hoge oppervlakte-tot-volumeverhouding [43]. Gezien de uitstekende biocompatibiliteit, het kleine formaat voor internalisatie door tumorcellen, het feit dat ze rijk zijn aan functionele oppervlaktegroepen en de mogelijkheden voor biobeeldvorming, wordt aangenomen dat koolstofstippen (inclusief CQD's) veelbelovende theranostische kandidaten worden voor tumortherapie. Er bestaan ​​echter nog steeds uitdagingen en veel onopgeloste problemen voor de toepassingen van koolstofstippen in nanogeneeskunde en bio-imaging. Er moeten meer inspanningen worden geleverd om in de toekomst de vertaling van koolstofdot-gerelateerde nanogeneeskunde van de werkbank naar het bed te bevorderen.