Frequentiemodulatie dielectroforese van vesicles en cellen: Voorspelbare U-bocht trajecten bij de crossover frequentie

Samenvatting

We hebben een uitgebreid model afgeleid voor de dielectroforetische (DEP) kracht uitgeoefend op micro- en nanoscopische deeltjes wanneer blootgesteld aan frequentiemodulerende (FM) elektrisch velden. Door de FM golf's frequentieband af te stemmen om de crossover frequentie f_X van het reële deel van de Clausius-Mossotti factor te omvatten, voorspelt onze theorie een systematische omkering van de DEP kracht elke keer dat de instantane frequentie f_X kruist. Experimenteel waarnamen we periodieke U-bochten in multilamellaire vesicles (MLVs), humane T-cel leukemie (TL) cellen, B-cel leukemie (BL) cellen en rode bloed (RB) cellen onder FM-DEP. Videotracking van deze U-bochten biedt een snelle, <30-seconde, en zeer accurate methode om f_X te bepalen, nuttig voor zowel zoutoplossingen als nanodeeltjesuspensies waar elektrisch-veld-geïnduceerde oplosmiddelstroom geminimaliseerd wordt. De nauwkeurigheid van f_X werd bevestigd door twee onafhankelijke experimenten: (1) het meten van de DEP kracht op een enkel vesicle onder wisselstroom (AC) DEP bij verschillende sinusoïdale frequenties en het vergelijken van de resulterende f_X met die verkregen uit FM-DEP; en (2) het beoordelen hoe f_X varieert met de geleidbaarheid van het omringende medium voor drie celtypen. De tweede benadering maakte gelijktijdige schatting van cytoplasmatische geleidbaarheden en membraancapaciteiten mogelijk met een verfijnd enkel-schel model. Cytoplasmatische geleidbaarheden waren iets lager dan eerdere gerapporteerde ranges, terwijl membraancapaciteiten nauwkeurig overeenkwamen met literatuurwaarden.

Achtergrond

Cellulaire polariseerbaarheid wordt gedomineerd door de membraan en cytoplasmatische elektrische eigenschappen, die variëren met de toegepaste veldfrequentie. Deze frequentie-afhankelijke dielectrische spectrum stelt label-vrije discriminatie van celtypen mogelijk via impedantiespectroscopie, AC DEP, reizend-golf DEP (twDEP) en electrotatie [1–16]. Vergeleken met antistof-gebaseerde of adhesieve labelmethoden, vermijden deze elektrische technieken celmodificatie en potentiële activatie, wat ze aantrekkelijk maakt voor non-invasieve celsortering.

DEP ontstaat in een niet-uniform elektrisch veld, wat een kracht genereert evenredig met de gradiënt van de veldamplitude en het reële deel van de Clausius-Mossotti (CM) factor. De fasegradiënt geeft aanleiding tot twDEP of electrotatie, die complementaire dielectrische informatie bieden. Ons werk breidt de conventionele AC DEP uit door FM elektrisch velden te introduceren, wat continue doorlopen van de crossover frequentie f_X mogelijk maakt en snelle dielectrische karakterisatie toestaat.

In typische AC DEP opstellingen wordt het veld toegepast tussen vaste gemicrofabriceerde elektrodes, wat ruimtelijke flexibiliteit beperkt. Elektronische pincetten – waar micromanipuleerde elektrodenalden het veld leveren – bieden een veelzijdige, contact-vrije alternatief. Echter, dielectrische metingen vereisen korte bloottijden (<30 s) om oplosmiddelstroomeffecten te reduceren, wat uitdagend is met multi-elektrodesystemen. FM-DEP lost dit op door de frequentie te moduleren terwijl de elektrodengeometrie constant blijft.

Ons plug-in systeem (Fig. 1) gebruikt twee wolfraam naaldelektroden, elk 0,5 µm punt diameter, 100 µm uit elkaar geplaatst. De alden worden aangedreven willekeurige golfgenerator en stroomversterker, en de hele montage is gemonteerd op een patch-clamp micromanipulator onder een geïnverteerde microscoop. Deze configuratie stelt precieze, contact-vrije manipulatie van individuele vesicles of cellen boven het substraat toe.

De FM golf wordt gedefinieerd door E(r,t)=A(r)cosθ(t), met de fase gerelateerd aan de instantane frequentie f(t) door θ̇=2πf(t). We gebruiken een breedband FM modulatie: f(t)=f_c+Δf cos(2πf_m t), waar de modulatie frequentie f_m veel kleiner is dan de draaggolf frequentiebereik, voldoend aan de breedband limiet (WBL) voorwaarde Δf/f_m≫1.

Methoden

Materialen

MLVs werden bereid uit 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine (DOPC; Avanti Polar Lipids). Een 1 ml DOPC oplossing (20 mM) in chloroforme/methanol (2:1 v/v) werd gedroogd onder stikstof en vacuüm-geseald voor >12 uur. De dunne film werd gerehydrateerd met gedemineraliseerd water en geïncubeerd bij 25 °C gedurende diverse uren.

Humane T-cel leukemie (JKT-β-del) en B-cel leukemie (CCRF-SB) cellijnen werden gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 10% fetale boviene serum en 100 mM natriumpyruvaat bij 37 °C, 5% CO₂. Na 1 week werden cellen gecentrifugeerd (370 g, 3 min, tweemaal) en heropgelost in 1 ml RPMI 1640. Oplossingen werden vervolgens gedilueerd in isotone 200 mM sucrose om gewenste geleidbaarheden te bereiken.

Humane RB cellen werden geïsoleerd uit heel bloed van gezonde vrijwilligers (vroege twintigers). Cellen werden opgelost in een 3,1% hematocriet RPMI 1640 mengsel en gedilueerd met 200 mM sucrose. Alle RB experimenten werden uitgevoerd binnen 10 min na bloedafname.

Experimentele opstelling

Geleidbaarheid van suspensies werd gemeten met een SevenMulti meter (Mettler-Toledo). Het FM of AC veld werd gegenereerd door een Agilent 33220A golfgenerator en versterkt door een F30PV stroomversterker. Twee 0,5 µm wolfraam alden, gescheiden door 100 µm, leverden het veld. De aldenpaar werd gepositioneerd 50 µl van suspensie op een verwarmde plat (25 °C). Beeldvorming werd uitgevoerd met een Nikon TE2000-U microscoop en een Retiga Exi CCD camera (25 fps). De FM golf's frequentieresolutie werd geverifieerd om binnen experimentele fout te liggen.

Extra Films S1–S3 demonstreren AC DEP manipulatie van diatomee cellen in gedemineraliseerd water: (S1) rotatie bij 30 kHz, (S2) duwen naar een glazen wand bij 100 kHz, en (S3) ophalen bij 20 MHz.

Resultaten en discussie

Experimentele waarneming van een leukemiecel die FM-DEP ervaart

De plug-in alden staan veldtoepassing boven het substraat toe, wat nauwkeurige celselectie faciliteert. Film S4 toont een driehoekige diatomee cel die reageert op een 100–500 kHz frequentiesprong bij 0,5 s intervallen. Films S5 en S6 tonen typische U-bocht trajecten van TL cellen onder FM-DEP (0,25 Hz modulatie, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). Fig. 2 toont een 3-D traject (x, y, t) waar de oorsprong overeenkomt met de aldenpunt. De x-as ligt langs de raaklijn aan het elektrodeonoppervlak; de y-as weerspiegelt de U-bocht amplitude.

U-bochten bestaan uit drie fasen: het verlaten van de alden, het naderen na een U-bocht, en het blijven op het elektrodeonoppervlak. Oplosmiddelstroom voorkomt vaak exacte terugkeer naar dezelfde plek, maar het timing van verlaten en U-bocht initiatie is duidelijk. De waargenomen U-bocht periode (≈4 s) komt overeen met de modulatieperiode van 0,25 Hz.

Theoretische studie van de FM-DEP

Voor een sferisch deeltje met interieure permittiviteit ε_in en geleidbaarheid σ_in en exterieure ε_out, σ_out, is de DEP kracht F_DEP(r,t)=p(r,t)·∇E(r,t), met de dipolmoment p(r,t)=4πR³ε_out K_H{E(r,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(r,t)}, waar K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ⁻¹=τ₀⁻¹–τ⁻¹, en τ₀ en τ de karakteristieke tijden gedefinieerd in de tekst. Gemiddeld over een AC cyclus levert de gemiddelde DEP kracht ⟨F_DEP⟩=χ(f_AC)∇A_RMS², waar χ(f) evenredig is met het reële deel van de CM factor.

Vervanging van het AC veld door een FM golf en aanroep van de WBL, wordt de gemiddelde DEP kracht ⟨F_DEP(r,t)⟩=χ{f(t)}∇A_RMS², wat toont dat de krachtrichting verandert wanneer f(t) f_X kruist. Dit verklaart de periodieke U-bochten waargenomen experimenteel.

Oplossen voor het moment dat f(t)=f_X geeft f_X=f_c–Δf cos(πf_m Δt_n), waar Δt_n de gemeten tijd is van verlaten van de alden tot de U-bocht. Dus biedt de FM-DEP methode een snelle bepaling van f_X uit de waargenomen traject.

Vergelijking van crossover frequenties van een enkele MLV bepaald uit FM- en AC-DEPs

Met een zout-vrije MLV suspensie, vergeleken we f_X verkregen uit FM-DEP (10–50 kHz FM bereik, f_m=0,1 Hz, 10 s periode) en AC-DEP (30–100 kHz sinusoïde). Uit de FM traject was de gemiddelde vertrektijd 5,8 ± 0,2 s, wat f_X=35 ± 1 kHz opleverde. AC-DEP krachtmetingen via een bewegende alden leverden een kracht-frequentie curve die het model paste F_DEP(f)= [L+(2πfτ)²H]/[1+(2πfτ)²], met gefitte parameters L=–21,02 pN, H=19,03 pN, τ=4,9 µs, wat f_X=34,15 kHz gaf, in uitstekende overeenstemming met het FM resultaat.

Geleidbaarheidsafhankelijkheden van de crossover frequenties voor biologische cellen

We pasten FM-DEP toe op TL, BL en RB cellen in geleidbaarheidsbereiken 60–160 mS m⁻¹ (Δf≈700 kHz, f_m=0,25 Hz). Voor elk celtype maatten we de vertrektijden van 10 cellen per druppel, gemiddeld over twee druppels, en afgeleid f_X gebruikmakend van Eq. (10). Figuur 6 plaatst de resulterende f_X versus σ_out. De data werden gefit aan het uitgebreide enkel-schel model f_X= [σ_out–(σ_out²)/(2σ_cyt)]/(√2 π R C_m) + f_X0, wat membraancapaciteiten C_m en cytoplasmatische geleidbaarheden σ_cyt opleverde die overeenkomen met literatuurwaarden (C_m≈0,5–1,5 µF cm⁻², σ_cyt≈0,3–0,8 S m⁻¹). De consistentie over celtypen bevestigt de betrouwbaarheid van FM-DEP voor dielectrische karakterisatie.

Conclusies

Onze WBL-gebaseerde theorie en experimenten bevestigen dat FM-DEP voorspelbare U-bochten produceert bij de crossover frequentie, wat snelle, <30-seconde bepaling van f_X mogelijk maakt. De FM-DEP metingen van MLVs matchen directe AC-DEP krachtmetingen, terwijl de geleidbaarheids-afhankelijke f_X data membraancapaciteiten opleveren die overeenstemmen met literatuur. FM-DEP biedt daarom een robuuste, contact-vrije methode voor dielectrische spectroscopie van vesicles en cellen, en kan uitgebreid worden tot sub-micron en nanoscopische deeltjes in on-chip configuraties voor real-time elektrokinetische spectroscopie.

Afkortingen

AC:

Wisselstroom

BL:

B-cel leukemie

CM:

Clausius-Mossotti

DEP:

Dielectroforese

DOPC:

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine

FM:

Frequentiemodulatie

MLV:

Multilamellaire vesicle

RB:

Rode bloed

RMS:

Root mean squared

TL:

T-cel leukemie

twDEP:

Reizend-golf dielectroforese

WBL:

Breedband limiet