Grapheneoxide-geïntegreerde nHAC/PLGA-scaffolds bevorderen osteoblaste proliferatie en botregeneratie

Samenvatting

Afbreekbare poruze scaffolds zijn centraal in botweefseltechniek. In deze studie werden nano-hydroxyapatiet/collageen (nHAC) gemengd met poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) en variërende hoeveelheden grapheneoxide (GE) gefabriceerd via vriesdrogen. De resulterende composieten vertoonden een continue driedimensionale porus netwerk. GE verbeterde de hydrofiliciteit licht en verhoogde de Young's modulus significant, met het 1,5 wt% GE monster bereikend 10,20 ± 1,28 GPa vergeleken met 7,53 ± 1,25 GPa voor de GE-vrije scaffold. In vitro toonden MC3T3-E1 osteoblasten aanzienlijk hogere adhesie en proliferatie op de 1,5 wt% GE scaffold, bevestigd door CCK-8 assays en SEM-beeldvorming. Deze resultaten tonen aan dat nHAC/PLGA/GE scaffolds uitstekende cytocompatibiliteit combineren met superieure mechanische prestaties, wat ze veelbelovende kandidaten maakt voor botregeneratietoepassingen.

Achtergrond

Driedimensionale poruze scaffolds die de bot extracellulaire matrix nabootsen, zijn essentieel voor succesvolle botreparatie. Conventionele fabricagetechnieken—elektrospinnen, computationeel topologie-ontwerp (CTD) gecombineerd met vrije-vorm-fabricatie (SFF), en vriesdrogen—bieden variërende graden van structurele controle en schaalbaarheid. Vriesdrogen biedt in het bijzonder een eenvoudige route om hoog-meteen verbonden poriën te genereren door sublimatie van een bevroren oplosmiddel onder vacuüm.

Natuurlijk bot bestaat uit een hiërarchische samenstelling van collageen en hydroxyapatiet (HA). Nano-hydroxyapatiet/collageen (nHAC) composieten nabootsen deze natuurlijke architectuur, wat gunstige biocompatibiliteit en bioresorbeerbaarheid oplevert. Echter, collageen's intrinsieke brosheid en snelle afbraak beperken het gebruik. Poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) introduceert mechanische robuustheid en afstelbare afbraaksnelheden, terwijl GE unieke fysicochemische eigenschappen biedt—hoge oppervlakte, mechanische versterking, en functionele groepen die celdrag kunnen modelleren.

Eerder werk heeft aangetoond dat GE-verbeterde scaffolds osteogene differentiatie en celproliferatie verbeteren. Hier evalueren we systematisch hoe incrementele GE-lading (0,0, 0,5, 1,0 en 1,5 wt%) de structurele, mechanische, hydrofiele en biologische prestaties van nHAC/PLGA composieten beïnvloedt.

Resultaten en discussie

Structuur van nHAC/PLGA/GE Composiet Scaffolds

Het fabricatieproces omvatte het oplossen van type I collageen in azijnzuur, co-precipitatie van Ca en P ionen om nHAC te vormen, mengen met PLGA en gedispergeerd GE, gevolgd door vriesdrogen. Scannende elektronenmicroscopie (SEM) onthulde een hoog-poruze architectuur met met elkaar verbonden poriën variërend van 0 tot 200 nm. De poriënverdeling werd gekwantificeerd door een geautomatiseerde oppervlakte-analyzer (Fig. 2f), wat een overheersing van sub-100 nm poriën bevestigt, een groottebereik dat gunstig is voor osteoblaste-infiltratie.

Fysicochemische en mechanische karakterisering

Poeder röntgendiffractie (XRD) bevestigde de aanwezigheid van hexagonale HA; GE-signalen waren niet waarneembaar door de lage lading. FT-IR-spectra toonden karakteristieke collageen-amide-banden en fosfaatpieken, met subtile verschuivingen die chemische interactie tussen collageen, HA, PLGA en GE aangeven.

Kwantitatieve nano-mechanische AFM-metingen (QNM-AFM) onthulden een monotone toename van Young's modulus met GE-inhoud: 7,53 ± 1,25 GPa (0 wt%), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5 wt%), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0 wt%), en 10,20 ± 1,28 GPa (1,5 wt%). De 1,5 wt% GE scaffold vertoonde een statistisch significante stijfheidsvoordeel ten opzichte van de GE-vrije tegenhanger, wat GE's versterkende effect weerspiegelt.

Contacthoekmetingen toonden een geleidelijke afname van 125,1° (GE-vrij) tot 101,4° (1,5 wt%), wat verbeterde oppervlaktebenettingsbaarheid aangeeft door GE's hydrofiele functionele groepen (Fig. 4f).

Celkweek en cytotoxiciteit

MC3T3-E1 osteoblasten gezaaid op de scaffolds vertoonden toenemende metabolische activiteit over 7 dagen (CCK-8 assay). Terwijl vroege proliferatie op de 0,5 wt% en 1,0 wt% GE scaffolds iets lager was dan de GE-vrije controle, matched de 1,5 wt% GE scaffold de controle en overstijgde deze op dagen 3, 5 en 7 (Fig. 5). SEM-afbeeldingen bevestigden uitgebreide celspreiding en netwerkvorming, met cellen op de GE-geladen scaffolds die grotere, meer afgeplatte morfologieën vertoonden (Fig. 6).

NIH-3T3 fibroblasten blootgesteld aan scaffold-suspensies gedurende 24 uur toonden geen significante cytotoxiciteit; levensvatbaarheid bleef boven 97% over alle GE-ladingen, wat de biocompatibiliteit van de composieten bevestigt (Fig. 7).

Conclusies

Vriesdrogen maakte de fabricatie van nHAC/PLGA/GE scaffolds mogelijk met met elkaar verbonden porositeit, verbeterde mechanische stijfheid en verbeterde hydrofiliciteit. De 1,5 wt% GE scaffold demonstreerde superieure osteoblaste-adhesie en proliferatie terwijl de uitstekende cytocompatibiliteit gehandhaafd werd, wat het potentieel onderstreept als botweefseltechniek-scaffold.

Methoden

Materialen

Type I collageen, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GE, en celkweekreagentia werden verkregen van gevestigde leveranciers. MC3T3-E1 osteoblasten en NIH-3T3 fibroblasten werden verkregen van gerenommeerde celbanken.

Scaffold-bereiding

Collageen werd opgelost in 0,5 M azijnzuur (4 g L⁻¹). Calcium- en fosfaatoplossingen (Ca/P = 1,66) werden druppelgewijs toegevoegd bij 100 druppels min⁻¹, geroerd, en getitreerd tot pH 9 met ammonia bij 37 °C. Na 24 uur werd het neerslag verzameld, vriesgedroogd, en gemalen om nHAC-poeder te produceren.

GE werd gedispergeerd in dioxaan (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 g L⁻¹) via ultrasoneer, daarna gemengd met PLGA (10% m/v) en 12 uur geroerd. nHAC werd toegevoegd in een 1:1 gewichtsverhouding tot PLGA, gevolgd door 4 uur ultrasoneer. Het mengsel werd bevroren bij –20 °C overnacht en vriesgedroogd om de finale scaffolds te verkrijgen.

Karakterisering

SEM, AFM (QNM-modus), FT-IR, XRD, contacthoek, en porositeitsmetingen werden uitgevoerd met standaardprotocollen. Alle data werden in driévoud verzameld.

Celkweek en assays

MC3T3-E1 cellen werden gezaaid met 2,5 × 10⁴ cellen mL⁻¹ op scaffold-schijven en gekweekt in DMEM +10% FBS +3% antibiotica bij 37 °C, 5% CO₂. Proliferatie werd beoordeeld door CCK-8 op dagen 1, 3, 5 en 7. Voor SEM werden cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gedeshydrateerd, kritisch-punt gedroogd, en gesputterd met goud.

Cytotoxiciteitstest

NIH-3T3 cellen werden blootgesteld aan 100 mg mL⁻¹ scaffold-suspensies gedurende 24 uur, gevolgd door CCK-8 assay. Cellevensvatbaarheid werd berekend relatief ten opzichte van controle-kweken.

Statistische analyse

Data worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Student's t-toets werd toegepast; p < 0,05 werd significant geacht.