MicroRNA-18a uit M2-macrofagen drijft nasopharynxcarcinoomprogressie door TGFBR3 te targeten in de TGF-β-route

Samenvatting

Doelstellingen

Nasopharynxcarcinoom (NPC) is een type nasopharynxziekte met hoge metastase- en invasie-eigenschappen. Tumorgeassocieerde alternatief geactiveerde (M2) macrofagen blijken verbonden te zijn met NPC. Op basis hiervan heeft deze studie als doel het mechanisme en de betrokkenheid van microRNA-18a (miR-18a) uit M2-macrofagen in NPC te verkennen.

Methoden

Perifere bloedmononucleaire cellen werden gedifferentieerd tot macrofagen en macrofagen gepolariseerd tot M2-type door interleukine-4. SUNE-1 en CNE2-cellen werden getransfecteerd met herstelde of uitgeputte miR-18a of transformerende groeifactor-bêta III-receptor (TGFBR3) om hun rollen in NPC-progressie te verkennen met betrokkenheid van de TGF-β-signaleringroute. Vervolgens werden SUNE-1 en CNE2-cellen geco-cultuurd met M2-macrofagen die behandeld waren met herstelde of uitgeputte miR-18a of TGFBR3 om hun gecombineerde rollen in NPC te begrijpen met betrokkenheid van de TGF-β-signaleringroute.

Resultaten

MiR-18a was hoog geëxprimeerd en TGFBR3 laag geëxprimeerd in NPC-cellen. MiR-18a-herstel, TGFBR3-knockdown of co-cultuur met miR-18a-mimics of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen bevorderden SUNE-1-celprogressie, tumorgroei in muizen, verlaagden p-Smad1/t-Smad1 en verhoogden p-Smad3/t-Smad3. MiR-18a-downregulatie, TGFBR3-overexpressie of co-cultuur met miR-18a-inhibitoren of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen remden CNE2-celprogressie, tumorgroei in muizen, verhoogden p-Smad1/t-Smad1 en verlaagden p-Smad3/t-Smad3.

Conclusie

Onze studie verheldert dat miR-18a uit M2-macrofagen resulteert in bevorderde NPC-celprogressie en tumorgroei in naakte muizen via TGFBR3-onderdrukking, samen met Smad1-inactivatie en Smad3-activatie.

Inleiding

Nasopharynxcarcinoom (NPC) is een epithiaal kwaadaardige tumor die geneigd is tot locale infiltratie en vroege metastase op afstand. NPC-patiënten klachten vaak over zeszen zenuwparalyse en het syndroom van Horner. Op dit moment bestaat de toegepaste behandeling voornamelijk uit radiotherapie, en geïntegreerde radiotherapie en chemotherapie. Helaas worden radiotherapie en chemotherapie onverwacht vergezeld van complicaties, en verworven resistentie tegen radiotherapie belemmert de uitkomsten van NPC. Gezien de taak om potentiële gerichte therapie te ontdekken een prioriteit is.

Gedysreguleerde microRNA's (miRNA's) zijn gedocumenteerd betrokken bij NPC-tumorigenese, metastase, invasie en resistentie tegen radiotherapie en chemotherapie. Als een subfamilie van miRNA's, is miR-18a gevonden om NPC-progressie te faciliteren door inhibitie van suppressor of morphogenesis in genitalia 1 en mTOR-route activatie. Daarnaast is miR-18a verder geverifieerd om NPC-celproliferatie en metastase te activeren via DICER1-regulatie. Bovendien wordt NPC-celprogressie gedreven door miR-18a door miRNA-biogenese-belemmering. Verder is miR-18a gedocumenteerd om kritiek te functioneren in de metastase van NPC. Alternatief geactiveerde (M2) macrofagen zijn belangrijke componenten van solide en hematologische maligniteiten en zijn verbonden met progressie, metastase en therapieresistentie. M2-gepolariseerde tumorgeassocieerde macrofagen zijn geassocieerd met slechte prognose van NPC. Het is intrigerend vastgelegd de verschillen van M2-macrofagen in Epstein-Barr-virus-negatieve en -positieve NPC. Er is een studie die uitlijnt dat miR-18a levermetastase van darmkankercellen remt door M1-macrofagen te induceren. Transformerende groeifactor-bêta III-receptor (TGFBR3) is een TGF-β-co-receptor die het type II TGF-β-receptorligand aanlevert om signalering te stimuleren en balans van celoppervlak, en oplosbare TGFBR3 is een regulator tijdens kankerprogressie. Laag geëxprimeerde TGFBR3 wordt gerapporteerd om een immunotolerante tumormicro-omgeving te induceren. Tegengesteld, induceert transiente overexpressie van TGFBR3 apoptose in humane NPC-cellen. Tot onze beste kennis avanceren M2-macrofagpolarisatie geïnduceerd door miR-181a M2-macrofage-gemedieerde tumorcelmetastase via Kruppel-achtige factor 6 en CCAAT/enhancer-bindend eiwit α-as.

Collectief, hoewel veel studies de onafhankelijke rol van miR-18a, TGFBR3 en M2-macrofagen in NPC ontdekt hebben, zijn de gecombineerde interacties tussen deze drie factoren nog onduidelijk. Overwegende dat deze studie gelanceerd is om de mechanismen en participatie van deze factoren in NPC te ontrafelen.

Materialen en methoden

Ethische verklaring

Het experiment werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Derde Xiangya Ziekenhuis, Centrale Zuid-Universiteit en voldede aan de medische ethische standaarden. Deze studie werd uitgevoerd met schriftelijke toestemming van alle donoren. Dierproeven voldeden aan de eisen van de nationale regelgeving voor laboratoriumdierenbeheer en -gebruik.

Verzameling van perifere bloedmononucleaire cellen

De monocyten werden verkregen uit perifer bloed van gezonde donoren door adherentie-methode. Perifere bloedmonsters werden verkregen van gezonde donoren van de Afdeling Hematologie van het Derde Xiangya Ziekenhuis, Centrale Zuid-Universiteit. Monocyten-afgeleide macrofagen werden verkregen door plastic adherentie van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) eerder geïsoleerd door dichtheidsgradientcentrifugatie (Ficoll-Paque, GE Healthcare) van buffy coat-preparaten van bloed van gezonde donoren. Vervolgens werden 2,0 × 10⁶ PBMC's gekweekt in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% humaan serum (Millipore, Bedford, MA, VS) en penicilline/streptomycine op 12-gaten platen (NalgeNunc, NY, VS). Toen PBMC's 2–3 uur aan de wand gehecht waren, werden het supernatans en zwevende PBMC's herhaaldelijk verwijderd om adhesieve monocyten te verkrijgen.

Macrofagdifferentiatie

Monocyten werden geïnduceerd om te differentieren tot macrofagen door humaan macrofaagkolonie-stimulerende factor (M-CSF) en gepolariseerd tot M2-macrofagen door interleukine (IL)-4.

Inductie van macrofagen

Monocyten werden gekweekt in 20% foetaal kalfserum (FKS)-DMEM en toegevoegd met M-CSF (100 μg, Peprotech, NJ, VS) tot een finale concentratie van 100 ng/mL. Het medium werd elke 3 dagen voor de helft vernieuwd en daarna aangevuld met 100 ng/mL M-CSF. Gekweekt tot de 7–8e dag, werd een deel van de cellen geoogst, en macrofaagoppervlaktemerkers CD68, CD163 en CD206 getest door immunofluorescentie-assay om macrofagen te identificeren.

Polarisatie van macrofaag

Macrofagen werden gepolariseerd tot M2-macrofagen door 20 ng/mL IL-4 (Peprotech) toe te voegen aan het differentiatie-media voor nog 24 uur. Een deel van de M2-macrofagmonsters werd gebruikt voor flowcytometriedetectie. De monsters werden verdeeld in 3 buisjes: buisje 1 was dezelfde partij adhesieve macrofagen zonder IL-4-stimulatie; buisjes 2 en 3 waren de adhesieve macrofagen gestimuleerd door IL-4. De monsters werden gedilueerd tot ongeveer 10.000 cellen bij laden en toegevoegd met aspecifiek immunoglobuline G om de Fc-receptor te blokkeren. Vervolgens werden de monsters toegevoegd met aspecifiek isotype-antistof, PE-gelabeld CD68-antistof en PE-gelabeld CD163-antistof (beide van Biolegend, CA, VS). Geïncludeerd voor 30 min en gespoeld met 0,5% bovine serumalbumine in fosfaatgebufferde saline (PBS), werden de monsters gecentrifugeerd en in celopslaging van 500 μL PBS gemaakt voor detectie.

Reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreactie

Reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreactie (RT-qPCR) werd gebruikt om miR-18a, CCL22, peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor γ (PPAR-γ) en TGFBR3 mRNA-expressie in de verzamelde cellen te detecteren. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen door Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) en omgezet in complementaire RNA door Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (Clontech, Mountain View, CA, VS) voor miR-18a en PrimeScriptTM RT Master Mix Kit (Takara, Dalian, China) voor CCL22, PPAR-γ en TGFBR3. U6 en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) waren laadcontroles voor miR-18a, CCL22, PPAR-γ en TGFBR3. SYBR@Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) (Takara) in een LightCycler 480 II systeem (Roche Diagnostics, Indiana, VS) werd gebruikt in PCR. Databerekening werd geëvalueerd door 2^-ΔΔCT methode. PCR-primers werden gepresenteerd in Tabel 1.

Western blot assay

Western blot assay werd toegepast op de detectie van TGFBR3, totaal (t)-Smad1, gefosforyleerd (p)-Smad1, t-Smad3 en p-Smad3 eiwit in de verzamelde cellen. Totaal eiwit van cellen werd geëxtraheerd en de eiwitconcentratie bepaald op basis van het bicinchoninezuurkit. Het eiwitmonster werd geladen in de putten in natrium dodecylsulfaat polyacrylamidgeelectroforese en overgebracht op een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan. Het PVDF-membraan werd geblokkeerd met magere melk en geïncludeerd met primaire antilichamen TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, VS), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000) en GAPDH (1:1000, alle van Abcam, Cambridge, MA, VK) gevolgd door incubatie met het perioxidase-gelabelde secundaire antilichaam (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, VS). 3 keer gewassen met tris-gebufferde saline met Tween 20, werd het membraan ontwikkeld door versterkte chemiluminescentie. Kwantificering van signalen werd voltooid door de National Institutes of Health ImageJ Imaging Processing Analysis Software met signaleringsintensiteit genormaliseerd aan GAPDH.

Celkweek en screening

Humane NPC-cellijnen CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 en normale humane nasopharynxcellijn NP96 (Shanghai Instituten voor Biologische Wetenschappen, Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China) werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium (Gibco, CA, VS) met FKS (Gibco), 100 μg/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine en gepasseerd bij 80% confluence. RT-qPCR werd gebruikt om miR-18a-expressie te detecteren. Onder die NPC-cellijnen toonden CNE2- en SUNE-1-cellen het grootste en kleinste verschil in miR-18a-expressie ten opzichte van NP96-cellen, dus werden ze geselecteerd voor miR-18a-downregulatie of -upregulatie assays.

Celgroepering en behandeling

Onder alle NPC-cellijnen werden SUNE-1-cellen met het kleinste verschil van NP96-cellen in miR-18a-expressie geselecteerd. Geleïd door specificaties van Lipofectamine 2000 (Invitrogen), werden SUNE-1-cellen getransfecteerd met miR-18a-mimics, miR-18a-mimics negatieve controle (NC), si-TGFBR3 of si-TGFBR3 NC. Onder alle NPC-cellijnen werden CNE2-cellen met het grootste verschil van NP96-cellen in miR-18a-expressie geselecteerd en getransfecteerd met miR-18a-inhibitoren, miR-18a-inhibitoren NC, overexpressie (OE)-TGFBR3 of OE-TGFBR3 NC door Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Geleïd door specificaties van Lipofectamine 2000 (Invitrogen), werden M2-macrofagen getransfecteerd met miR-18a-mimics, miR-18a-mimics NC, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, miR-18a-inhibitoren, miR-18a-inhibitoren NC, OE-TGFBR3 of OE-TGFBR3 NC.

Co-cultuur van M2-macrofagen en NPC-cellen

Celco-cultuur in de Transwell-kamer werd geadopteerd om de effecten van miRNA uit M2-macrofaag op NPC-cellen te verkennen. De bovenkamer werd gevuld met M2-macrofaag met de poriegrootte van 0,4 μm, wat alleen cellen van de bovenkamer tegenhield om door te gaan maar niet de kleine moleculen gescheiden door de cellen zoals vesikels, groeifactoren, voedingsstoffen, etc. De onderkamer werd bedekt met NPC-cellen. SUNE-1 en CNE2 werden geïncludeerd in normaal FKS (Gibco). De cellen in de logaritmische groeifase werden geadopteerd voor experimenten. SUNE-1 en CNE2-cellen werden geco-cultuurd met M2-macrofagen in 10% FKS-RPMI-1640 medium (beide van Gibco) in een Transwell-invoegcelkweekschaal (Coring, Corning, NY, VS) met een poriegrootte van 0,4 μm. SUNE-1-cellen werden niet geco-cultuurd met M2-macrofagen, of geco-cultuurd met M2-macrofagen, miR-18a-mimics-getransfecteerde M2-macrofagen, miR-18a-mimics NC-getransfecteerde M2-macrofagen, si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen of si-TGFBR3 NC-getransfecteerde M2-macrofagen. CNE2-cellen werden niet geco-cultuurd met M2-macrofagen, of geco-cultuurd met M2-macrofagen, miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde M2-macrofagen, miR-18a-inhibitoren NC-getransfecteerde M2-macrofagen, OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen of OE-TGFBR3 NC-getransfecteerde M2-macrofagen.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Difenyltetrazoliumbromide-assay

Cellevensvatbaarheid werd getest door 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay, een colorimetrische assay toegepast om de activiteit van mitochondriale dehydrogenase te bepalen, die MTT reduceert tot formazan. Trypsiniseerde en gezaaide in 96-gaten platen bij 4 × 10⁴ cellen/put, werden cellen ontdoen van kweekmedium op de 0e, 12e, 24e, 36e en 48e uur respectievelijk en aangevuld met MTT-oplossing (500 μL, 0,5 g/L). Geïncludeerd voor 4 uur, werd het supernatans verworven en cellen geïncludeerd met 200 μL dimethylsulfoxide-oplossing. Optische dichtheid (OD, 490 nm) waarden werden gemeten op een microplaatlezer (ELX808IU, BioTek, VT, VS). Elke groep werd opgezet met 6 parallelle putten.

Kolonievormingsassay

Kolonievormend vermogen van NPC-cellen werd getest door kolonievormingsassay, wat celpopulatie-afhankelijkheid en celklonale proliferatie weerspiegelt. Gekweekt voor 24 uur en ontlast met 0,25% trypsin, werden 300 cellen gezaaid in een 35-mm schaal met 3 parallelle putten in elke groep. Met kweekmedium elke 3 dagen vernieuwd, werden de cellen een week gekweekt en gefixeerd met 5 mL 4% paraformaldehyde. Daarna werden de cellen gekleurd door kristalviolet-kleuringsoplossing en aan de lucht gedroogd. De schaal werd omgekeerd waarop een transparante film met roosters was 겹gelegd, en het aantal kolonieën (meer dan 50 cellen) geteld onder een microscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Krabbeltest

Celmigratie werd getest door krabbeltest. Cellen werden trypsiniseerd, gezaaid in 6-gaten platen met 3 parallelle putten voor elke groep, en gekweekt tot 90% confluence. Vervolgens werden de cellen geïncludeerd in het medium met 2% FKS en verticale krassen getrokken door een 100-μL-tip. De cellen werden gefotografeerd op de 0e en 24e uur onder een geïnverteerde microscoop om celmigratieafstand te meten.

Transwell-assay

Celinvasie en migratie werden getest door Transwell-assay. De bovenkamer van de Transwell-kamer was vooraf geïmmerserd en toegevoegd met 100 μL Matrigel (Coring) wat gedilueerd was door serumvrij RPMI 1640 medium bij 1:100. De boven- en onderkamers werden toegevoegd met 200 μL en 600 μL serumvrij RPMI 1640 medium respectievelijk. Vervolgens werd de onderkamer toegevoegd met 600 μL RPMI 1640 medium met 10% FKS terwijl de bovenkamer met 200 μL celopslaging (12,5 × 10⁴ cellen/mL). Geïncludeerd voor 40 uur, werden de cellen gekleurd door kristalviolet-kleuringsoplossing en afgewist met een katoenen zwab om de cellen door de Matrigel heen te tellen onder een microscoop.

Flowcytometrie

Celapoptose en celcyclusverdeling werden bepaald door flowcytometrie. Celcyclusverdeling werd geëvalueerd door propidiumiodide (PI) kleuring. Cellen werden gezaaid in 6-gaten platen bij 4 × 10⁵ cellen/put, en gekweekt tot 70–80% confluence. Gefixeerd in voorverkoelde 70% ethanol over nacht, werden de gecentrifugeerd (het supernatans verworven), toegevoegd met RNAase (1 g/L, 200 μL) en Triton X-100 (2 μL), en gekleurd door PI-kleuringsoplossing voor 30 min. Daarna werd celcyclusverdeling gedetecteerd door een flowcytometer (BD Bioscience, NJ, VS) bij 488 nm volgens verschillende celfluorescentie-intensiteiten per fase (G0/G1-fase, S-fase en G2/M-fase). Celapoptose werd gemeten door Annexin V-fluoresceïneisothiocyaan (FITC) en PI dubbele kleuring. Cellen werden heropgelost in 500 μL Binding-buffer en gekleurd door 5 μL Annexin V-FITC-kleuringsoplossing en 10 μL PI-oplossing. Celapoptose werd ook getest door een flowcytometer (BD Bioscience) binnen 30 min zonder lichtblootstelling. Op het spreidingsplot waren levende cellen in de linkeronderkwadrant (Q4) FITC⁻/PI⁻, apoptootse cellen in vroege stadium in de rechteronderkwadrant (Q3) FITC⁺/PI⁻, en necrotische en apoptootse cellen in late stadium in de rechterbovenkwadrant (Q2) FITC⁺/PI⁺. Apoptosepercentage = vroege apoptosepercentage (Q3) + late apoptosepercentage (Q2).

Tumor-xenografts in naakte muizen

Tumorgroei werd waargenomen door een NPC-model in naakte muizen op te zetten. Ontlast door 0,25% trypsin, SUNE-1 en CNE2-cellen in logaritmische fase werden geconfigureerd in enkelvoudige celopslaging bij 5 × 10⁷ cellen/mL. De celopslaging (0,2 mL) werd geïnjecteerd in de rechter oksel van muizen door een micro-injector om muismodellen op te zetten. Gemodelleerde muizen werden opgevoed in een specifieke pathogen-vrije omgeving. Gestart vanaf de 4e dag, werd tumorgroei waargenomen en de muizen elke 4 dagen geweegd. Naakte muizen werden gedood op de 20e dag na injectie en tumoren gere-secteerd, geweegd door een elektronische bal en gefotografeerd.

Dubbele luciferase-reportergenassay

Dubbele luciferase-reportergensysteem werd geadopteerd om de bindingsplaatsen van miR-18a en 3'onverteerde regio (UTR) van TGFBR3 mRNA te bevestigen. Een biologische voorspellingswebsite (https://www.microrna.org/microrna/home.do) werd gebruikt om het doelgen van miR-18a te analyseren en het bestaan van de complementaire bindingsplaats van miR-18a op de 3'UTR van TGFBR3 te ontdekken. Dubbele luciferase-reportergenassay werd ingezet om verder te verifiëren of TGFBR3 direct getarget werd door miR-18a. Een pmirGLO-TGFBR3-wild type (WT) en een pmirG-LO-TGFBR3-mutant type (MUT) van TGFBR3 3'UTR-bindingsplaats werden geconstrueerd. TGFBR3-WT of TGFBR3-MUT en miR-18a-mimics of mimics NC werden geco-transfecteerd in SUNE-1 en CNE2-cellen door Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en geïncludeerd voor 48 uur. Een luciferase-assaykit (Promega, Madison, WI, VS) werd gebruikt om cellen te analyseren.

Statistische analyse

SPSS21.0 statistische software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) werd gebruikt voor analyse. Data werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd door t-toets terwijl verschillen tussen meerdere groepen door eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's post-hoc toets. Een significant verschil werd overwogen bij P < 0,05.

Resultaten

Identificatie van M2-macrofagen

De monocyten verrijkt door adherentie-methode en monocyten geïnduceerd door M-CSF werden verzameld uit perifer bloed van gezonde donoren. Immunofluorescentiedetectie van CD68, CD206 en CD163 bevestigde dat PBMC's geïnduceerd door M-CSF in vitro omgezet waren tot macrofagen met typische moleculaire kenmerken, wat aan onze eisen voldeden (Fig. 1a). De verkregen macrofagen werden gepolariseerd door IL-4 en onder een microscoop geobserveerd voor morfologie. Het manifesteerde dat macrofagen (M0) zonder IL-4-stimulatie divers en irregulier waren, een ronde, ovale of speldvormige vorm vertoonnden. Gestimuleerd door IL-4, werden M2-macrofagen groter en keerden vorwiegend naar ronde vorm, wat in overeenstemming was met de morfologische kenmerken van M2-macrofagen zoals eerder beschreven (Fig. 1b). Flowcytometrie testte de oppervlakte-antigenen van de adhesieve cellen gestimuleerd door 20 ng/mL IL-4 voor 24 uur en vond dat CD68 geëxprimeerd was op 21,16% terwijl CD163 op 98,69% van het totale aantal cellen (Fig. 1c), wat de adhesieve cellen bevestigde als M2-macrofagen. RT-qPCR onthulde dat in tegenstelling tot M0-cellen, CCL22 en PPAR-γ (typische polariserende moleculen) toegenamen in M2-macrofagen (Fig. 1d, e), wat de succesvolle inductie van M2-macrofagen aanwees. RT-qPCR manifesteerde ook dat miR-18a-expressie toegenam in M2-macrofagen in tegenstelling tot M0-macrofagen (P < 0,05) (Fig. 1f).

MiR-18a is hoog geëxprimeerd en TGFBR3 slecht geëxprimeerd in NPC-cellen

Bioinformatics-website (miRanda) voorspelde de potentiële doelen van miR-18a en TGFBR3 werd beschouwd als één doel van miR-18a (Fig. 2a). Dubbele luciferase-reportergenassay werd geïmplementeerd om te verifiëren dat miR-18a 3'UTR van TGFBR3 targette. TGFBR3-WT of TGFBR3-MUT werden gekloond in de pmirGLO-vector en geco-transfecteerd met miR-18a-mimics of NC in SUNE-1 en CNE2-cellen. MiR-18a-mimics hadden geen invloed op de luciferase-activiteit van TGFBR3 3'UTR-MUT maar belemmerden die van TGFBR3 3'UTR-WT in SUNE-1 en CNE2-cellen, wat suggereert dat TGFBR3 een doelgen was gereguleerd door miR-18a (Fig. 2b). De transfectie-efficiëntie van miR-18a-mimics of miR-18a-inhibitoren in M2-macrofagen werd manifesteerd door bepaling van miR-18a- en TGFBR3-expressie in M2-macrofagen door RT-qPCR en Western blot assay. Het was duidelijk dat (Fig. 2c, d) miR-18a-overexpressie miR-18a-expressie verhoogde en TGFBR3-expressie verlaagde in M2-macrofagen. Tegengesteld, miR-18a-inhibitie verlaagde miR-18a-expressie en verhoogde TGFBR-expressie in M2-macrofagen. Geen verschil werd getuigd in de miR-18a-expressie terwijl TGFBR3-expressie verminderde toen M2-macrofagen getransfecteerd werden met si-TGFBR3. Geen verschil werd getuigd in de miR-18a-expressie terwijl TGFBR3-expressie toename bij OE-TGFBR3-transfectie aan M2-macrofagen. MiR-18a- en TGFBR3-expressie in CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 en NP96-cellijnen werden getest door RT-qPCR en Western blot assay. In NPC-cellen, in vergelijking met NP96-cellen, nam miR-18a-expressie toe en TGFBR3-expressie af (Fig. 2e). Vanwege CNE2-cellen en SUNE-1-cellen manifesteerden met het grootste en kleinste verschil in miR-18a-expressie van NP96-cellen, werden ze geselecteerd voor de voortgaande miRNA-downregulatie- en upregulatie-assays, respectievelijk. Om de effecten van miR-18a en TGFBR3 op NPC-cellen te identificeren, werden SUNE-1-cellen getransfecteerd met miR-18a-mimics of si-TGFBR3 terwijl CNE2-cellen met miR-18a-inhibitoren of OE-TGFBR3. RT-qPCR en Western blot assay toonden aan dat miR-18a-mimics miR-18a-expressie verhoogden en TGFBR3-expressie verlaagden in SUNE-1-cellen. Transfectie van si-TGFBR3 had geen effect op miR-18a-expressie terwijl TGFBR3-expressie verlaagde in SUNE-1-cellen. MiR-18a-inhibitoren verlaagden miR-18a-expressie en verhoogden TGFBR3-expressie in CNE2-cellen. OE-TGFBR3-transfectie in CNE2-cellen beïnvloedde miR-18a-expressie niet maar verhoogde TGFBR3-expressie (Fig. 2f, g). Om de effecten van miR-18a uit M2-macrofagen op NPC-cellen te verkennen, werden miR-18a-mimics- of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen of miR-18a-inhibitoren- of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen geco-cultuurd met SUNE-1 of CNE2-cellen in de Transwell-kamer, respectievelijk. RT-qPCR en Western blot assay testten miR-18a- en TGFBR3-expressie in SUNE-1 of CNE2-cellen. SUNE-1-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde of miR-18a-mimics-getransfecteerde M2-macrofagen toonden verhoogde miR-18a-expressie en gedegradeerde TGFBR3-expressie. Geen verschil werd opgemerkt in de miR-18a-expressie en TGFBR3-expressie verminderde in SUNE-1-cellen die geco-cultuurd waren met si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen (Fig. 2h). Na co-cultuur met ongetransfecteerde M2-macrofagen, waren CNE2-cellen gekenmerkt door verhoogde miR-18a-expressie en verlaagde TGFBR3-expressie. Echter, verlaagde miR-18a-expressie en verhoogde TGFBR3-expressie presenteerden in CNE2-cellen die vooraf geco-cultuurd waren met miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde M2-macrofagen. Geen verschil werd herkend in de miR-18a-expressie, en TGFBR3-expressie nam toe in CNE2-cellen geco-cultuurd met OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen (Fig. 2i).

MiR-18a uit M2-macrofagen bevordert NPC-cellevensvatbaarheid en kolonievormend vermogen

MTT-assay en kolonievormingsassay werden toegepast om de impact van miR-18a en TGFBR3 op levensvatbaarheid en kolonievormend vermogen van SUNE-1-cellen en CNE2-cellen te identificeren. MiR-18a-mimics, miR-18a-inhibitoren, si-TGFBR3 of OE-TGFBR3 werden getransfecteerd in SUNE-1-cellen of CNE2-cellen. Het werd aangegeven dat in SUNE-1-cellen, miR-18a-upregulatie of TGFBR3-downregulatie cellevensvatbaarheid verbeterde en kolonienummer verhoogde (Fig. 3a, e). In CNE2-cellen werd cellevensvatbaarheid belemmerd en het aantal kolonieën verminderd door miR-18a-inhibitie of TGFBR3-overexpressie (Fig. 3b, f). Om de effecten van miR-18a uit M2-macrofaag op levensvatbaarheid en kolonievormend vermogen van NPC-cellen te onderzoeken, werden miR-18a-mimics-, miR-18a-inhibitoren-, si-TGFBR3- of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen geco-cultuurd met SUNE-1-cellen of CNE2-cellen in de Transwell-kamer. MTT- en kolonievormingsassay toonden aan dat SUNE-1-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde, of miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen gepresenteerd waren met versterkte cellevensvatbaarheid en verhoogd aantal kolonieën (Fig. 3c, g). CNE2-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde M2-macrofagen werden benadrukt met versterkte cellevensvatbaarheid en toegenomen kolonieën. Echter, CNE2-cellen geco-cultuurd met of miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR-getransfecteerde M2-macrofagen werden getoond met verminderde cellevensvatbaarheid en verminderde kolonieën (Fig. 3d, h).

MiR-18a uit M2-macrofagen bevordert NPC-celinvasie en migratievermogen

Voor beter begrip van hoe miR-18a en TGFBR3 migratie en invasie van NPC-cellen beïnvloedden, werden krabbeltest en Transwell-assay geïmplementeerd. De resultaten onthulden dat SUNE-1-cellen getransfecteerd met miR-18a-mimics of si-TGFBR3 gekenmerkt waren door verhoogde celmigratieafstand en invasiecellen (Fig. 4a en 5a). In CNE2-cellen getransfecteerd met miR-18a-inhibitoren of OE-TGFBR3, daalde celmigratieafstand en invasiecellen (Fig. 4b en 5b). Hoe miR-18a uit M2-macrofagen invasie- en migratievermogen van NPC-cellen beïnvloedde, werd ontcijferd door miR-18a-mimics-, miR-18a-inhibitoren-, si-TGFBR3- of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen te co-culturen met SUNE-1 of CNE2-cellen. De resultaten benadrukten dat SUNE-1-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde, of miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen manifesteerden met verhoogde celmigratieafstand en invasiecellen (Fig. 4c en 5c). Zowel celmigratieafstand als invasiecellen namen toe in CNE2-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde M2-macrofagen. Bij co-cultuur met miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen, toonden CNE2-cellen verminderde migratieafstand en invasiecellen (Fig. 4d en 5d).

MiR-18a uit M2-macrofagen arresteert minder NPC-cellen in G0/G1-fase en onderdrukt apoptose

Celcyclusverdeling en apoptose werden getest door flowcytometrie om de effecten van miR-18a en TGFBR3 op NPC-cellen te stratificeren. Het werd aangegeven dat transfectie van miR-18a-mimics of si-TGFBR3 SUNE-1-cellen arresteerd in G0/G1-fase verlaagde, cellen in S- en G2/M-fase verhoogde en celapoptosepercentage verlaagde (Fig. 6a en 7a). Bij transfectie met miR-18a-inhibitoren of OE-TGFBR3, CNE2-cellen in G0/G1-fase neigten naar elevatie terwijl die in S- en G2/M-fase naar reductie, en celapoptosepercentage steeg (Fig. 6b en 7b). Met het doel het mechanisme van miR-18a uit M2-macrofagen in NPC-celcyclusverdeling en apoptose te ontcijferen, werden M2-macrofagen getransfecteerd met miR-18a-mimics, miR-18a-inhibitoren, si-TGFBR3 of OE-TGFBR3 geco-cultuurd met SUNE-1-cellen of CNE2-cellen in de Transwell-kamer. Geco-cultuurd met ongetransfecteerde, of miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen, vertoonden SUNE-1-cellen verminderde cellen in G0/G1-fase en verhoogde cellen in S- en G2/M-fase, en SUNE-1-celapoptosepercentage daalde (Fig. 6c en 7c). Geco-cultuurd met ongetransfecteerde M2-macrofagen, CNE2-cellen in G0/G1-fase daalden, cellen in S- en G2/M-fase stegen, en apoptosepercentage daalde. Tegengesteld, geco-cultuurd met miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen, CNE2-cellen in G0/G1-fase steegen terwijl die in S- en G2/M-fase daalden, en apoptosepercentage steeg (Fig. 6d en 7d).

MiR-18a uit M2-macrofagen verlaagt p-Smad1/t-Smad1 en verhoogt p-Smad3/t-Smad3 in NPC-cellen

Western blot assay detecteerde TGF-signaalweg-gerelateerde eiwitten in NPC-cellen om de effecten van miR-18a en TGFBR3 op TGF-signaalweg verder uit te leggen. Het werd uitgelegd dat transfectie van miR-18a-mimics of si-TGFBR3 p-Smad1/t-Smad1 verlaagde en p-Smad3/t-Smad3 verhoogde in SUNE-1-cellen (Fig. 8a). Transfectie met miR-18a-inhibitoren of OE-TGFBR3 leidde tot gedaalde p-Smad3/t-Smad3 en verhoogde p-Smad1/t-Smad1 in CNE2-cellen (Fig. 8b). MiR-18a uit M2-macrofagen die TGF-signaalweg in NPC-cellen beïnvloedde, werd bepaald door Western blot assay door testen van TGF-signaalweg-gerelateerde eiwitten in SUNE-1-cellen en CNE2-cellen die geco-cultuurd waren met miR-18a-mimics-, miR-18a-inhibitoren-, si-TGFBR3- of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen in de Transwell-kamer. SUNE-1-cellen geco-cultuurd met ongetransfecteerde, miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen manifesteerden met verlaagde p-Smad1/t-Smad1 en toegenomen p-Smad3/t-Smad3 (Fig. 8c). Geco-cultuurd met ongetransfecteerde M2-macrofagen, CNE2-cellen neigden naar gedaalde p-Smad1/t-Smad1 en verhoogde p-Smad3/t-Smad3. In tegengestelde richting, CNE2-cellen toonden verhoogde p-Smad1/t-Smad1 en verlaagde p-Smad3/t-Smad3 wanneer geco-cultuurd met miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen (Fig. 8d).

MiR-18a uit M2-macrofagen induceert tumorgroei in naakte muizen met NPC

Tumor-xenografts werden uitgevoerd op naakte muizen om de impact van miR-18a en TGFBR3 op tumorgroei van NPC verder te verhelderen. Het werd aangegeven dat geïnjecteerd met miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde SUNE-1-cellen, muizen manifesteerden met vergrote tumorvolume en zwaarder tumorgewicht (Fig. 9a). Verminderd tumorvolume en gewicht presenteerden in muizen met injectie van miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR3-getransfecteerde CNE2-cellen (Fig. 9b). Tumorgroei werd waargenomen in muizen die geïnjecteerd waren met miR-18a-mimics-, miR-18a-inhibitoren-, si-TGFBR3- of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen om het mechanisme van miR-18a uit M2-macrofagen in NPC te illustreren. Na co-cultuur met ongetransfecteerde, miR-18a-mimics-getransfecteerde of si-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen, werden SUNE-1-cellen in muizen geïnjecteerd en muizen waargenomen met groter tumorvolume en zwaarder tumorgewicht (Fig. 9c). CNE2-cellen werden geco-cultuurd met M2-macrofagen en in muizen geïnjecteerd met resultaten die groeiend tumorvolume en gewicht suggereerden. Zowel tumorvolume als gewicht neigden te verminderen toen muizen geïnjecteerd waren met CNE2-cellen die geco-cultuurd waren met miR-18a-inhibitoren-getransfecteerde of OE-TGFBR3-getransfecteerde M2-macrofagen (Fig. 9d).

Discussie

NPC verwijst naar een polygene ziekte bedreigd door een breed scala aan factoren. MiRNA's zijn eerder geïmpliceerd om te participeren in de pathogenese van NPC via regulatie van hun doelgenen die indicatoren zijn van cellulaire processen en routes. Concreet, miR-18a bevordert NPC-progressie door miRNA-biogenese te belemmeren. Gegeven dat deze studie voortgaat om de gecombineerde interacties van miR-18a uit M2-macrofagen en TGFBR3 in NPC te ontrafelen met de conclusie die verheldert dat miR-18a uit M2-macrofagen NPC-progressie stimuleert via TGFBR3-inhibitie (Fig. 10). Aan het begin van deze studie worden macrofagen gestimuleerd door IL-4 om te differentieren tot M2-macrofagen die verrijkt zijn in miR-18a-expressie. Zoals we weten, tijdens macrofaagpolarisatie werd miRNA-expressie gewijzigd. Daarnaast verrijkt M2-polarisatie genen die betrokken zijn bij celcyclus en metabolische processen, en het M2-fenotype is gunstig voor tumorgroei en angiogenese in neoplastische weefsels. Gebaseerd op de M2-macrofagen-verrijkte miR-18a, werden een reeks experimenten met succes uitgevoerd. Initieel heeft onze studie onthuld dat miR-18a hoog geëxprimeerd is terwijl TGFBR3 slecht geëxprimeerd is in NPC-cellen. Afgeleid van een eerdere studie, wordt geconcludeerd dat miR-18a overgeëxprimeerd is in NPC-weefsels met associatie met lymfeknoedemetastase en klinisch stadium. Daarnaast worden miR-17-92-clusterleden inclusief miR-18a gedocumenteerd overgeëxprimeerd in NPC-weefsels. Verder wordt gerapporteerd dat opgevoerde miR-18a getoond wordt in NPC-weefsels verbonden met tumor-knoedemetastase-stadium en tumoromvang. Experimenteel, behalve gedownreguleerde TGFBR3 in tongplaveiselcelcarcinoom, is er een andere studie die verminderde TGFBR3 in heldere-cel niercarcinoom afbeeldt vergezeld van ongewenste prognose. Iets ook, de resultaten in deze studie zijn consistent met deze studiebevindingen tot een zekere mate. Om de rollen van miR-18a en TGFBR3 in NPC-celprogressie te verkennen, hebben we een reeks assays uitgevoerd met resultaten die aangeven dat opgevoerde miR-18a of gedownreguleerde TGFBR3 NPC-celprogressie triggert terwijl miR-18a-repressie of TGFBR3-elevatie tegengestelde effecten heeft op NPC-cellen. Wijdverspreid is onderdrukking van miR-18a bewijzen om celprogressie in maligniteiten zoals eierstokkanker, colitis-geassocieerde darmkanker en hepatocellulaire carcinoom te belemmeren. Smaller, een bestaande studie heeft uitgesproken dat opgevoerde miR-18a NPC-celprogressie bevordert via bemiddeling van DICER1. Bovendien wordt opgemerkt dat overgeëxprimeerde miR-18a in NPC verbonden wordt met NPC-metastase en onderdrukte miR-18a deels bijdraagt aan betere prognose van NPC-patiënten. Onlangs is gepeild dat downregulatie van miR-18a capabel is NPC-proliferatie, invasie en migratie te ontmoedigen. Daarnaast wordt een afname in TGFBR3-expressie geacht te linken met larynxplaveiselcelcarcinoom (LSCC) invasie en miR-223/TGFBR3-as-regulatie deelt mee in LSCC-progressie-inhibitie. TGFBR3-elevatie is gedocumenteerd om NPC-cellevensvatbaarheid te beperken, apoptose te induceren en pro-apoptose signaleringsroutes te activeren. Eerder heeft een studie aangegeven dat upregulatie van TGFBR3 apoptose bevordert en cellen arresteerd in G2/M-fase, resulterend in belemmerde cellevensvatbaarheid en migratie in speekselklier adenoïde cystische carcinoom. Intrigerend is het voorheen beschreven dat inductie van TGFBR3 bijdraagt aan het verstoren van intrahepatische cholangiocarcinoom-progressie. Ondanks de beschermende rol van laag geëxprimeerde miR-18a en overgeëxprimeerde TGFBR3 in NPC-cel in vitro, hebben we tumor-xenografts in naakte muizen in vivo uitgevoerd voor verdere verificatie met resultaten die uitleggen dat miR-18a-knockdown of TGFBR3-elevatie tumorgroei in naakte muizen beperkt. Zoals gedemonstreerd in een eerdere studie, tonen miR-18a-geïnjecteerde naakte muizen versterkte tumorgroei en tegengesteld, tonen miR-18a-antagomir-geïnjecteerde naakte muizen onderdrukte tumorgroei in NPC. In het licht van TGFBR3-reductie in tumorgroei, wordt voorgesteld dat slecht geëxprimeerde TGFBR3 tumorvorming in heldere-cel niercarcinoom provokeert. In de tegenovergestelde richting, wordt een toename in TGFBR3 herkend om tumorgroei in longkanker te belemmeren met de aanwezigheid van lange niet-coderende RNA ADAM-metallopeptidase met trombospondine type 1 motief, 9 antisense RNA 2 elevatie en miR-223-3p-onderdrukking. Deze studie heeft ook voorspeld en geverifieerd dat TGFBR3 een doelgen is van miR-18a. Maar, meer studies moeten nog uitgevoerd worden voor verdere verificatie.

Conclusie

Over het algemeen schetst deze studie de concrete mechanismen dat miR-18a uit M2-macrofagen TGFBR3-expressie inhibeert om de progressie van NPC te verergeren via TGF-β-signaleringsroute, het resultaat van wat wordt opgeheven door miR-18a-knockdown of TGFBR3-elevatie. Deze studie actualiseert het therapeutische doelwit voor NPC. Echter, grote cohort-onderzoeken zijn nog nodig voor diepgaande verkenningen.