Nano-alginaten Dragers via Invers-Micel Synthese: Doxorubicine Encapsulatie en Cytotoxiciteit in Muizen Borstkankercellen

Samenvatting

Gekruiste alginaat-nanodeeltjes vormen een aantrekkelijk platform voor medicamentenencapsulatie en -afgifte. Hier rapporteren we een eenvoudig invers-micelprotocol dat wateroplosbare doxorubicine (DOX) in een calcium-gekruiste alginaatmatrix laadt, resulterend in NALG-DOX deeltjes met een hydrodynamische diameter van ~83 nm en een zetapotentiaal van +7,2 mV. De resulterende nano-alginaten (NALG) deeltjes waren bolvormig en monodispers, zoals bevestigd door TEM. DOX-afgifte was gecontroleerd, met ~70% behoud na 4 uur en ~90% vrijgekomen na 24 uur op fysiologische pH. Fluorescentie-imaging bevestigde cellulaire opname van DOX uit NALG-DOX in 4T1 muizen borstkankercellen. Cytotoxiciteitstesten (LIVE/DEAD en Alamar Blue) toonden een IC₅₀ van 0,45 µg/mL voor NALG-DOX versus 0,093 µg/mL voor vrij DOX, terwijl de lege NALG-drager geen toxiciteit vertoonde. Deze resultaten demonstreren het potentieel van de invers-micelmethode voor het produceren van biokompatibele, medicamenten-geladen alginaat-nanodeeltjes.

Achtergrond

Encapsulatie van chemotherapeutica biedt voordelen ten opzichte van systemische vrije medicamententoediening, waaronder verlengde circulatie, bescherming tegen plasma-eiwitten en verminderde systemische toxiciteit. Nanodragers kunnen de verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect van solide tumoren benutten, wat passieve targeting mogelijk maakt bij geschikte grootte. Hoewel liposomen, polymere deeltjes en lipide nanodeeltjes in de klinische praktijk zijn toegetreden, kampen veel nieuwe formuleringen met uitdagingen in schaalbare bereiding en reproduceerbaarheid. Alginaten, een natureel afgeleid, biologisch afbreekbaar en niet-immunogeen polysacchariden, kunnen door twee waardige kationen (meestal Ca²⁺) gekruist worden tot hydrogelenanodeeltjes. Deze studie presenteert een snelle, kamertemperatuur invers-micelsynthese die uniforme alginaat-nanodeeltjes produceert die in staat zijn om hydrofiele medicijnen zoals DOX te encapsuleren.

Methoden

Materialen

Natriumalginaten, calciumchloride dihydraat, cyclohexaan, dodecylamine en DOX-hydrochloride werden verkregen van Sigma-Aldrich en MedChem Express. Alle oplossingen werden bereid in 18 MΩ water.

Bereiding van Nano-alginaten (NALG)

Alginaten (15 mg/mL) werd 30 min geroerd om volledige oplossing te garanderen. Voor DOX-lading werd het medicament in dezelfde waterfase opgelost. Acht milliliter cyclohexaan werd in een fiool geplaatst, en 80 µL dodecylamine (opgelost in warm water) werd toegevoegd om de oliephase te genereren. De waterige alginaat/DOX oplossing (20 µL) werd toen onder vigoureus roeren (1.200 rpm) gedurende 20 min geïntroduceerd, gevolgd door toevoeging van 30 µL 50 mM CaCl₂ om het alginaat binnen de inversemmicellen te kruisen. Na 25 min werd 2 mL water toegevoegd om de waterfase te scheiden, waaruit de nanodeeltjes met een pipet werden herwonnen.

Zuiivering

De waterige extract werd achtereenvolgens gefilterd door 100 kDa en 10 kDa centrifugale eenheden (Pall, Millipore) om aggregaten en vrij medicament te verwijderen, wat resulteerde in een eindvolume van 1 mL gezuiverde NALG of NALG-DOX.

Karakterisering

Dynamische lichtverstrooiing (Malvern Zetasizer) meet grootte (633 nm laser, 25 °C, 173° achterwaartse verstrooiing). Zetapotentieel werd direct daarna vastgelegd. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) op een Tecnai F-20 (4 kV) bevestigde morfologie. DOX-inhoud werd gekwantificeerd door de intrinsieke fluorescentie (excitatie 470 nm, emissie 550 nm) en vergeleken met een standaardcurve.

Vrijgavestudie

Dialyse (Slide-A-Lyzer MINI, 2 kDa MWCO) in PBS (pH 7,4) en citraatbuffer (pH 5,5) beoordeelde DOX-vrijgave op 1, 2, 4, 24, 48 en 72 uur. Fluorescentiemetingen werden gebruikt om de vrijgekomen DOX-concentratie te berekenen.

Celkweek en Behandeling

4T1-luc2-GFP muizen borstkankercellen (PerkinElmer) werden gekweekt in RPMI 1640 + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine. Cellen werden gezaaid op 4.000 cellen/put (96-puttenplaat) en na 24 uur behandeld met NALG, vrij DOX of NALG-DOX in varierende concentraties.

Fluorescentie-imaging

Na 48 uur werden cellen vastgezet met formaline, gekleurd met NucBlue, en geïmageerd op een EVOS FL Auto (ThermoFisher) met DAPI, GFP en DOX kanalen. Beelden werden verwerkt met ImageJ.

Live/Dead Assay

Op 72 uur werden geïncubeerd met NucBlue Live en NucGreen Dead reagentia (ThermoFisher), vastgezet en geïmageerd als hierboven. Groene fluorescentie duwde dode cellen aan.

Alamar Blue Vitaliteitstest

Alamar Blue (10 µL per put in 100 µL medium) werd op 72 uur toegevoegd, 1 uur geïncubeerd bij 37 °C, en uitgelezen op een Tecan Infinite M200 Pro (560/590 nm). Celvitaliteit werd uitgedrukt als percentage ten opzichte van onbehandelde controles.

Resultaten en Discussie

Invers-Micel Synthese

De invers-micelbenadering produceerde transparante waterige colloïden van NALG en NALG-DOX. Cyclohexaan diende als oliephase, terwijl dodecylamine functioneerde als surfactant om alginaatketens binnen micellen te stabiliseren. Calciumchloride-kruising vormde het hydrogelnetwerk, en opeenvolgende waterige extractie leverde monodisperse deeltjes op.

Deeltjeskarakterisering

DLS-data toonden NALG aan op 92,2 ± 4,2 nm (PDI 0,320 ± 0,063, ζ -15,0 ± 0,8 mV) en NALG-DOX op 82,8 ± 3,6 nm (PDI 0,204 ± 0,044, ζ +7,2 ± 4,6 mV). TEM-beelden bevestigden bolvormige morfologie met diameters die overeenkwamen met DLS-metingen. DOX-lading was ~7% (≈4 µg/mL), wat moderate encapsulatie-efficiëntie aangeeft, typerend voor polymere dragers.

Vrijgavekinetiek

In PBS (pH 7,4) bleef ~70% van DOX na 4 uur over, met ~90% vrijgekomen na 24 uur. Bij pH 5,5 versnelde vrijgave, wat de zuure tumor-micro-omgeving en intracellulaire compartimenten weerspiegelt, en een pH-responsief medicamentenvrijgaveprofiel mogelijk maakt.

Cellulaire Opname

Fluorescentiemicroscopie na 48 uur onthulde DOX gelokaliseerd nabij de kern in zowel vrije als NALG-DOX behandelingen. Geencapsuleerde DOX vertoonde een distinct perikernige distributie, consistent met endocytose-opname en daaropvolgende vrijgave in de zuure endosoom.

Cytotoxiciteit

LIVE/DEAD-imaging toonde minimale celdood met NALG alleen, terwijl DOX en NALG-DOX dosis-afhankelijke cytotoxiciteit induceerden. Alamar Blue-analyse leverde IC₅₀ waarden van 0,093 µg/mL voor vrij DOX en 0,45 µg/mL voor NALG-DOX. De hogere IC₅₀ voor NALG-DOX weerspiegelt de gecontroleerde vrijgave en verminderde directe medicamentenbeschikbaarheid, toch blijft het geencapsuleerde medicament effectief.

Conclusies

We hebben een snelle, schaalbare invers-micelmethode vastgesteld om ~90 nm alginaat-nanodeeltjes te genereren die efficiënt DOX encapsuleren. De resulterende NALG-DOX toont gecontroleerde vrijgave, verminderde systemische toxiciteit en vergelijkbare antitumoractiviteit als vrij DOX in vitro. Toekomstig werk zal zich richten op het optimaliseren van encapsulatie-efficiëntie en in vivo prestaties.

Afkortingen

4T1-luc2-GFP

4T1 luciferase/groen fluorescentieproteïne

CaCl₂

Calciumchloride

DAPI

4′,6-Diamidino-2-fenylindol

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

DMSO

Dimetylsulfoxide

DOX

Doxorubicine

NALG

Alginaten-nanodeeltjes

NALG-DOX

Doxorubicine-alginaten-nanodeeltjes

PBS

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

PDI

Poly-dispersiteitsindex

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie