Nanoalginaten via inverse-micelle synthese:doxorubicine-inkapseling en cytotoxiciteit van borstkanker

Methoden

Materialen

Natriumalginaat, calciumchloridedihydraat, cyclohexaan (99,9%) en dodecylamine (98%) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Doxorubicinehydrochloride werd gekocht bij MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Deze reagentia werden gebruikt zoals ze zijn, met oplossen van natriumalginaat en de therapeutische middelen in water zoals aangegeven. Al het water was 18 MΩ gefilterd water afkomstig van een Milli-Q-bron.

Bereiding van nanoalginaten

Natriumalginaat werd opgelost in een glazen flesje met 15 mg/ml in water en men liet het gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik mengen via een roerstaaf. Het DOX werd in deze waterige fase opgelost als het in de nanodrager zou worden opgenomen. De alginaatoplossing werd vóór gebruik bij de synthese gecontroleerd op volledige oplossing van het alginaatpoeder. Zonder de introductie van een meerwaardig kation blijft de waterige alginaatfase wekenlang homogeen. Acht milliliter cyclohexaan werd in een flesje gepipetteerd. Dodecylamine, een vaste stof bij kamertemperatuur, werd enkele minuten onder warm water verwarmd totdat een deel van de vaste stof in vloeibare vorm was omgezet. Vervolgens werd 80 L dodecylamine in de cyclohexaan gepipetteerd. Een roerstaafje werd aan het glazen flesje toegevoegd en het mengsel werd vervolgens bij 125 rpm geroerd. Na 5 min mengen werd de organische fase als goed gemengd beschouwd en klaar voor toevoeging van de waterige fase. Twintig microliter van de waterige alginaatfase werd toegevoegd aan de cyclohexaan/dodecylamine organische fase. De roersnelheid werd verhoogd tot 1200 rpm. Het mengen vond plaats onder constant roeren gedurende 20 minuten. Dertig microliter 50 mM calciumchloride-oplossing werd vervolgens aan het mengsel toegevoegd. Na 25 min mengen/geleren van de deeltjes werd 2 ml water aan het mengsel toegevoegd, waardoor een waterige laag onder de organische laag ontstond. De nanodeeltjes scheidden zich in de waterige fase en een pipet van 1 ml werd gebruikt om de waterige laag te verwijderen.

Zuivering van NALG

De waterige laag werd gedurende 10 minuten bij 3200 x g gecentrifugeerd in een centrifugale filtereenheid van 100 kDa (Pall). in een centrifuge om grote aggregaten te verwijderen, en het permeaat werd overgebracht naar een eenheid van 10 kDa (Millipore). De oplossing werd vervolgens 5 minuten met dezelfde snelheid gecentrifugeerd om kleine onzuiverheden eruit te filteren. Water werd toegevoegd en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd om het retentaat te wassen. Het uiteindelijke volume van 1 ml werd verzameld en karakterisering werd op dit product uitgevoerd.

Karakterisering van de NALG

De gefilterde oplossing van nanodeeltjes werd overgebracht naar een cuvet (Malvern Instruments, DTS 1070 zeta-cel) voor dynamische lichtverstrooiingsmeting. De grootteverdeling werd bepaald met behulp van een Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, VK). Groottemetingen werden uitgevoerd met een laser met een golflengte van 633 nm bij 25 ° C met een detectiemethode van een terugverstrooiingshoek van 173 °. Zeta-potentiaalmetingen voor de alginaatnanodeeltjes werden onmiddellijk na de groottemeting in dezelfde cuvet uitgevoerd. Metingen voor grootte en zeta-potentieel werden in drievoud uitgevoerd en de gepresenteerde resultaten geven de gemiddelde   ± standaarddeviatie van de drie onderzoeken aan. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gebruikt om de grootte van de nanodeeltjes te bevestigen en hun morfologie te onderzoeken. TEM-beelden werden verkregen met behulp van een Technai F-20 transmissie-elektronenmicroscoop die werkte bij 4200 eV. Voorbereiding van de TEM-rasters omvatte druppelsgewijze afzetting van 10 μL nagefilterde nanodeeltjesoplossing op het koperen oppervlak van het formavar / koolstofgesteunde TEM-raster (Ted Pella). Natte TEM-roosters werden een nacht afgedekt in een exsiccator geplaatst voorafgaand aan de beeldvorming om een ​​goede droging te garanderen.

Doxorubicine heeft intrinsieke fluorescentie, die kan worden gebruikt om de fluorescentie van de doxorubicine-alginaat-nanodeeltjes (NALG-DOX) te vergelijken met een standaardcurve van DOX om de concentratie ervan te schatten. We gebruikten excitatie-/emissiegolflengten van 470/550 nm. De afgifte van doxorubicine uit NALG-DOX-oplossingen werd bepaald door de uiteindelijke gefilterde oplossing van nanodeeltjes te dialyseren in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4 of citraatbuffer bij pH 5,5. Er werden twee sets van vijf batches NALG-DOX bereid zoals eerder beschreven, met een initiële DOX-concentratie van 1,25 mg/ml in de waterige alginaatfase. Achttien Slide-A-Lyzer MINI dialyse-apparaten (ThermoFisher) met een binnenvolume van 100 μL en een molecuulgewichtsgrens van 2 kDa werden bereid door 100 μL NALG-DOX aan elk apparaat toe te voegen. Elk apparaat werd in een scintillatieflesje met 20 ml buffer geplaatst. Een roerstaafje werd aan elk bufferbevattend flesje toegevoegd en alle flesjes werden gedurende de duur van het experiment op een roerplaat geplaatst om voorzichtig te roeren. De flesjes werden afgedekt om het verlies van de buffer door verdamping te verminderen en om ze tegen licht te beschermen. Op elk tijdstip (1, 2, 4, 24, 48, 72 uur) werden drie apparaten verwijderd, werd 100 μL van het monster uit elk apparaat verwijderd en in een apart putje geplaatst, en werd een fluorescentiemeting gedaan op een Tecan Infinite M200 Pro microplaatlezer (Tecan Trading AG) bij 470/550 nm. De fluorescentiemetingen werden vergeleken met metingen van een standaardcurve en initiële aliquots die vóór het experiment werden genomen om de concentratie en de hoeveelheid verlies van DOX aan de buffer te bepalen.

Celcultuur en dosering

Muizenborstkankercellen, Bioware Ultra Green Cell Line 4T1 luciferase/groen fluorescerend eiwit (4T1-luc2-GFP, muizenadenocarcinoom) en geen reporter 4T1-cellen werden verkregen van PerkinElmer (Waltham, MA). Deze cellen werden onderhouden met RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine in een 5% CO₂ incubator werkend bij 37 ° C. De 4T1-cellen werden uitgezaaid met 4000 cellen/putje in een zwartwandige, heldere bodemplaat met 96 putjes. Vierentwintig uur na het zaaien in de putjes werd het oorspronkelijke medium opgezogen en werd de formulering van het geneesmiddel/medium geïntroduceerd.

Fluorescentiebeeldvorming

Na 48 uur werd het medium afgezogen, de cellen werden driemaal gewassen met PBS en formaline werd aan de putjes toegevoegd. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur werden de cellen opnieuw driemaal gewassen met PBS en werden twee druppels NucBlue-ready-cel ReadyProbes-reagens (ThermoFisher) per milliliter medium aan de putjes toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur werden de cellen opnieuw driemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 100 μL PBS aan de vaste cellen toegevoegd en werden de platen overgebracht naar een EVOS FL Auto Cell Imaging System (ThermoFisher). Een objectief van ×  20 werd gebruikt om delen van bepaalde putjes in elke plaat af te beelden. Een beeld van elk fluorescentiekanaal werd afzonderlijk opgenomen; een blauwe afbeelding voor 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), een rode afbeelding voor DOX (met behulp van RFP-kanaal om intrinsieke fluorescentie vast te leggen) en een groene afbeelding voor GFP. De 4T1-luc2-GFP-cellen brengen groen fluorescerend eiwit tot expressie, dus er was geen extra kleuring nodig om de cellen zichtbaar te maken in het groene kanaal. De DOX-behandeling "kleurt" de cellen en er is geen verder reagens nodig om het in het rode kanaal te visualiseren. De afbeeldingen zijn in ImageJ aangepast voor helderheid/contrast.

Live/Dead Cell Viability Assay

Kwalitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van 4T1-cellen na co-incubatie met NALG, DOX en NALG-DOX werd geëvalueerd met behulp van een LIVE/DEAD cellevensvatbaarheidstest (ThermoFisher). 72 uur na introductie van de met geneesmiddel beladen media werden de media opgezogen en werden de cellen driemaal gewassen met PBS. De LIVE/DEAD-test werd uitgevoerd door twee druppels van elke druppelaar NucBlue Live Reagent en NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) per milliliter media toe te voegen. Na 30 minuten incubatie werden nog drie wassingen met PBS uitgevoerd en formaline werd aan de putjes toegevoegd om de cellen te fixeren. Nog drie wassingen met PBS volgden de formaline en een laatste hoeveelheid PBS van 100 L werd aan elk putje toegevoegd. Vergelijkbare beeldvorming werd uitgevoerd zoals vermeld, maar het groene kanaal gaf nu de aanwezigheid van dode cellen aan, omdat de aangetaste celmembranen het groene reagens toestonden de cel binnen te gaan.

Live/Dead Cell Viability Assay

Kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van 4T1-cellen na co-incubatie met NALG, DOX en NALG-DOX werd geëvalueerd met behulp van de Alamar Blue cellevensvatbaarheidstest (ThermoFisher). 72 uur na introductie van de met drugs beladen media werden de media opgezogen. De Alamar Blue-assay werd uitgevoerd door 10 μL Alamar Blue-reagens aan elk putje toe te voegen met 100 μL nieuwe media en gedurende 1 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Na 1 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen voor elk putje bepaald met behulp van een Tecan Infinite M200 Pro-microplaatlezer (Tecan Trading AG). De excitatie-/emissiegolflengten werden ingesteld op 560/590, optimale versterkingsinstellingen werden door de software bepaald voor de plaat en een bodemleesprotocol werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit voor elk putje in de plaat af te lezen. Het % levensvatbaarheid van de cellen kan worden bepaald aan de hand van de uitlezing van de fluorescentie-intensiteit via de vergelijking:

Resultaten en discussies

Omgekeerd micelle-emulsieproces

In dit werk werd een nanoalginaat-medicijndrager, NALG, bereid via een omgekeerd micel-emulsieproces, zoals geïllustreerd in Fig. 1. Waterig alginaat werd toegevoegd aan een cyclohexaan / dodecylamine-oliefase, die de inverse micellen vormt. Het alginaat werd vervolgens verknoopt met toevoeging van calciumchloride (CaCl₂ ) oplossing. Na verloop van tijd om verknoping van het alginaat in de inverse micellen mogelijk te maken, werd de NALG geëxtraheerd door toevoeging van water. Ten slotte verwijderden centrifugaalfilters latente verontreinigingen en hielpen ze de grootteverdeling van de nanodeeltjes te verkleinen. Het eindproduct was een transparante waterige colloïdale oplossing.

Formuleringsproces voor de vorming van NALG en NALG-DOX. een Schematische weergave van het inverse micelsyntheseproces. Waterige alginaatketens worden verknoopt in een organisch bad (boven), geëxtraheerd tot een waterige fase (linksonder) en vervolgens gefiltreerd voor zuivering (rechtsonder). b Moleculaire interactie van Ca ²⁺ verknoping, wat leidt tot gevormd NALG. c Foto van synthese op verschillende punten, van links naar rechts, emulsie voor CaCl₂ toevoeging, emulsie na CaCl₂ toevoeging en scheiding bij toevoeging van water

De componenten van het inverse micel-emulsiesysteem werden bepaald op basis van experimentele gegevens en literatuur uit het verleden. Om de vrijheidsgraden in het systeem te verkleinen, kozen we voor cyclohexaan voor de organische fase. Bij de optimalisatie van dit proces hebben we een reeks oppervlakteactieve stoffen getest op hun vermogen om alginaatdeeltjes op nanoschaal te vormen, wat wordt aangegeven door een toename van de troebelheid van het organische mengsel na introductie van een kleine hoeveelheid waterige fase onder roeren. Dodecylamine was een geschikte kandidaat en werd gekozen als oppervlakteactieve stof om in de toekomst te gebruiken. Water werd gekozen als de waterige fase in de experimenten die hier worden gepresenteerd.

Karakterisering van NALG

In Fig. 2a, b wordt de verdeling van hydrodynamische nanodeeltjesgroottes voor NALG en NALG-DOX getoond. De nanodeeltjes, leeg of therapeutisch geladen, vertoonden vergelijkbare pieken rond 90 nm. De deeltjesdiameters voor respectievelijk NALG en NALG-DOX waren 92,2 ± 4,2 nm en 82,8 ± 3,6 nm. De polydispersiteitsindex (PDI) voor de deeltjes was 0,320 ± 0,063 en 0,204 ± 0,044, en de ζ-potentialen waren − 15,0 ± 0,8 mV en 7,2 ± 4,6 mV.

Dynamische lichtverstrooiingsverdelingen van a NALG en b NALG-DOX toont monodisperse distributies van alginaat nanodeeltjes. Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van c NALG en d NALG-DOX toont sferische morfologie van deeltjes. Schaalbalken geven 50 nm in grotere afbeelding aan en 20 nm in inzet

De afmetingen van de deeltjes waren consistent bij opname van het DOX in de alginaatmatrix. De ζ-potentiaal was negatief voor de lege NALG, wat consistent was met andere alginaat nanodeeltjes verbonden door calcium [39]. De met doxorubicine beladen deeltjes hadden een positieve ζ-potentiaal. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan een overmaat aan positief geladen calciumionen aan het oppervlak van het deeltje, wat kan helpen de positieve lading op het nanodeeltje te geven. Ook kan het primaire amine dat aanwezig is op DOX-moleculen elektrostatisch interageren met de vrije carbonzuurgroepen op het alginaat, waardoor de negatieve ladingen die beschikbaar zijn op het oppervlak van het deeltje worden verminderd.

Figuur 2c, d toont transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van met calcium verknoopte NALG en NALG-DOX. Beide soorten nanodeeltjes vertoonden sferische morfologie. De algemene distributie van nanodeeltjes bleek qua grootte vergelijkbaar te zijn met de DLS-distributie. De concentratie van de uiteindelijke NALG-DOX-oplossing werd geëvalueerd met behulp van de intrinsieke fluorescentie van het doxorubicinemolecuul. Het volume van het gefiltreerde NALG-DOX-product werd verdeeld in drievoudige sets dialyse-inrichtingen die in met PBS gevulde scintillatieflesjes werden geplaatst en DOX liet men verschillende keren vrijkomen uit de NALG-DOX. Aanvankelijk was de concentratie van DOX in de NALG-DOX-oplossing ~   4 μg/ml, wat aangeeft dat de inkapselingsefficiëntie, of verhouding van DOX in NALG-DOX tot initiële DOX toegevoegd aan de formulering, voor de NALG-DOX ~ 7% is. Hoewel deze inkapselingsefficiëntie als laag wordt beschouwd in vergelijking met vergelijkbare deeltjes [57], is dit waarschijnlijk te wijten aan de initiële DOX die aanwezig is in de waterige fase. We hebben de formulering niet herhaald door de hoeveelheid DOX die aanwezig is in de initiële waterige fase te verlagen en veronderstellen dat de efficiëntie kan worden verbeterd door de hoeveelheid DOX in de initiële formulering te verlagen. De niet-ingekapselde DOX gaat waarschijnlijk door de 3 kDa filterwassingen aan het einde van de synthese. Met de beschikbaarheid en relatief lage kosten van doxorubicine, hebben we ervoor gekozen om de formulering te "verzadigen" met DOX, wetende dat grote hoeveelheden van de overgebleven DOX waarschijnlijk niet-ingekapseld zouden passeren. Het verhogen van de inkapselingsefficiëntie zou dit deeltjesplatform in toekomstig werk kunnen verbeteren.

De afgiftecurve voor de NALG-DOX bij pH 5,5 en 7,4 is te vinden in Fig. 3. NALG-DOX behoudt ongeveer 70% van de DOX-lading in de loop van de eerste 4 uur, waarbij 90% de deeltjes na 24 uur verlaat , bij pH 7,4. Dit afgiftepatroon is gebruikelijk voor polymere materialen [57, 58] en vertoont gecontroleerde afgifte gedurende de eerste 24 uur bij blootstelling aan het PBS-reservoir. Bij een lagere pH van 5,5, meer vergelijkbaar met de pH die de nanodeeltjes zouden zien tijdens celopname in een laat endosoom [59], wordt de DOX sneller afgegeven. Dit is gewenst gedrag, omdat een langzamere afgifte nodig is in de algemene bloedsomloop, maar in de zure micro-omgeving van de tumor heeft een snellere afgifte de voorkeur.

Afgifte van doxorubicine uit nanodeeltjesoplossing toont gecontroleerde afgifte gedurende de eerste 24 uur in PBS, pH 7,4. Een snellere afgifte van doxorubicine vindt plaats bij pH 5,5. Elk punt vertegenwoordigt gemiddelde ± standaarddeviatie van n = 3 metingen

Cellulaire opname van DOX

De opname van NALG-DOX door 4T1-muizenborstkankercellen na 48 uur wordt getoond in Fig. 4a, b. Elke rij geeft een apart kleurkanaal aan en de onderste rij toont het samengestelde beeld van alle kleurkanalen. In de linkerkolom wordt een hoge concentratie DOX of NALG-DOX gebruikt, wat voldoende is om de meeste cellen te elimineren. De middelste kolom toont een concentratie van 0,31 g/mL voor DOX en 0,28 g/mL voor de DOX in de NALG-DOX, die enig potentieel voor celdoding vertoont, en de rechterkolom toont onbehandelde cellen. Cellen in de middelste afbeelding tonen doxorubicine (rood) rond en overlappend met de kern (blauw) van de cellen. Er zijn verminderde celaantallen in de eerste twee kolommen in beide panelen a en b vanwege de aanwezigheid van de DOX, die celproliferatie remde in vergelijking met de onbehandelde putjes. Doxorubicine functioneert door intercalatie in het nucleaire DNA [12], en colokalisatie van de doxorubicine en de kern zou erop kunnen wijzen dat het bij opname via dit mechanisme functioneert. In figuur 4b is het ingekapselde doxorubicine te onderscheiden in de periferie van het nucleaire gebied. De rechterkolom toont onbehandelde cellen zonder significant signaal gedetecteerd in het rode kanaal. Gratis DOX, hoewel krachtig, zou doeltoxiciteit veroorzaken en de circulatietijden in vivo verkorten. Inkapseling zorgt voor een meer gestage afgifte gedurende een langere circulatietijd, waardoor NALG-DOX mogelijk beter in vivo wordt en in toekomstig werk kan worden onderzocht.

Fluorescentiemicroscopie van beelden van gefixeerde 4T1-luc2-GFP-borstkankercellen behandeld met doxorubicine (DOX) (a ) en NALG-DOX (b ) na 48 uur blootstelling. Schaalbalken geven 100 μm aan. Blauwe nucleaire vlek:DAPI; groen (getransfecteerde cellijn):GFP; rood (intrinsieke moleculaire fluorescentie):DOX

Cytotoxiciteit van NALG-DOX

Als basistest voor het vermogen om cellen te doden, werden onbehandelde 4T1-cellen en cellen behandeld met NALG-DOX gekleurd met LIVE/DEAD cell assay (ThermoFisher) en gefixeerd na 72 uur blootstelling. Een voorbeeldafbeelding van een onbehandeld putje, een putje behandeld met NALG, een putje behandeld met 0,078 g/mL DOX en een putje behandeld met 0,20 μg/mL NALG-DOX, wordt respectievelijk getoond in Fig. 5a-d. De groene overlap getoond in Fig. 5c, d geeft aan dat de DOX- en NALG-DOX-behandeling in die putjes leidt tot de dood van veel van de cellen in die put. De cellen waren niet in staat om te prolifereren op dezelfde manier als in de onbehandelde en lege met nanodeeltjes behandelde putjes getoond in Fig. 5a, b vanwege de aanwezigheid van het therapeutische middel. De verdunning van nanodeeltjes gebruikt voor dosering in NALG en NALG-DOX was identiek.

LIVE/DEAD fluorescentietest toont weinig tot geen celdood aan in onbehandelde 4T1-cellen (a ) en in cellen die zijn behandeld met NALG (b ). Signaalintensiteit van het groene kanaal (dode celkleuring) is sterk in een groot aantal van de cellen die zijn behandeld met 0,078 μg/ml DOX (c ) en 0,20 μg/ml NALG-DOX (d ), wat wijst op celdood. Schaalbalken geven 100 μm aan. Concentraties geven de hoeveelheid DOX aan, vrij of in deeltjes. NALG-dosering in (b ) bij dezelfde deeltjesdichtheid als in NALG-DOX

Kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen van de 4T1-luc2-GFP-cellen na 72 uur blootstelling aan NALG, vrije DOX en NALG-DOX via Alamar Blue (ThermoFisher) -assay wordt getoond in Fig. 6. In Fig. 6a, de vrije doxorubicine -behandelde cellen vertoonden minder levensvatbare cellen over het gehele concentratiebereik dan de met NALG-DOX behandelde cellen (voor equivalente concentratie van DOX). Dit wordt verder weergegeven door de IC₅₀ waarden of concentratie die nodig zijn om een ​​remmend effect van 50% aan te tonen, die respectievelijk 0,093 g/ml en 0,45 μg/ml waren voor gratis DOX en NALG-DOX. De vrije DOX-waarde is vergelijkbaar met die gevonden na 72 uur tegen 4T1-cellen door Du et al. [60]. De IC₅₀ waarden zijn vergelijkbaar met die gevonden door Eliaz et al. met DOX en in liposomen ingekapselde DOX na 72 uur tegen B16F10-melanoomcellen [61].

Cellevensvatbaarheid van 4T1-luc2-GFP-cellen na 72 uur blootstelling aan NALG-DOX en DOX (a ) en NALG (b ) in verschillende concentraties. Gegevenspunten en foutbalken geven gemiddelde ± standaarddeviatie van n . aan =3 putten. Concentraties geven de hoeveelheid DOX aan, vrij of in deeltjes, in (a ). In b , werden NALG-putjes gedoseerd vanaf dezelfde deeltjesconcentraties als NALG-DOX, wat wijst op weinig tot geen celdood door alleen de geneesmiddeldrager

Een hogere concentratie doxorubicine is nodig om de NALG-DOX een soortgelijk effect te laten zien als het vrije medicijn. Dit zou te verwachten zijn, aangezien het ingekapselde therapeutische middel meer wordt gehinderd in zijn transport naar de plaats van effect. Het ingekapselde doxorubicine vertoonde nog steeds celremmende effecten, wat betekent dat het medicijn nog steeds therapeutisch actief is of dat het nanodeeltje zelf giftig is voor de cellen. Om dit te testen, werd de levensvatbaarheid van NALG op een vergelijkbare manier geëvalueerd als NALG-DOX. NALG vertoonde minimale toxiciteit in alle concentraties, zoals weergegeven in figuur 6b, wat aangeeft dat het medicijn werkzaam is.