Verbeterde Antitumorale Effect van Dacarbazine en All-Trans Retinozuur Samen Geleverd via Lipide Nanodeeltjes voor Maligne Melanoom

Samenvatting

Maligne melanoom is een zeer agressieve huidkanker die verantwoordelijk is voor 80% van de sterftgevallen. De mediaan overleving van patiënten met gemetastaseerd melanoom bedraagt slechts 6–9 maanden. Combinatietherapie door de gelijktijdige toediening van twee geneesmiddelen in een enkele nanodrager heeft zich bewzen als een elegante en effectieve strategie in de bestrijding van kanker. In deze studie passen we een combinatietherapie toe gebaseerd op dacarbazine (DBZ), het enige door de FDA goedgekeurde chemotherapeuticum voor melanoom, en all-trans retinozuur (ATRA), een veelbelovend antikankermiddel, beide geladen in lipide nanoformuleringen (RD-LNF) als nieuwe behandelstrategie voor maligne melanoom.

We hebben beide geneesmiddelen met succes in lipide nanoformuleringen geencapsuleerd en een gecontroleerde afgifte van de lading over de tijd aangetoond. We lieten zien dat de gelijktijdige afgifte van DBZ en ATRA de celproliferatie effectief kan reduceren op een concentratie-afhankelijke manier. De combinatienanodeeltjes reduceren de kolonievormingscapaciteit van B16F10-melanoomcellen aanzienlijk. Stroomcytometrieanalyse toonde aan dat RD-LNF een groter deel apoptotische cellen induceert met significante remming van celcyclusvoortgang en celmigratie. Deze resultaten suggereren de veelbelovende potentie van RD-LNF in de behandeling van maligne melanoom met hoge effectiviteit.

Inleiding

Maligne melanoom is een van de agressieve maligniteiten die voornamelijk in de menselijke huid voorkomt. Melanoom staat voor 4% van alle dermatologische kankers, maar is verantwoordelijk voor 80% van de huidkankersterfte en wordt een groeiend probleem in ontwikkelings- en ontwikkelingslanden. Melanoom heeft een hoge neiging om te metastaseren naar verschillende lichaamsdelen, waaronder de hersenen, het hart en de longen, wat het tot een van de agressiefste maligniteiten maakt. Bij vroege diagnose is chirurgische excisie een potentiële therapeutische optie, maar chirurgicale interventie garandeert geen volledige hersteling. Bovendien wordt de radiale groeifase van deze maligniteit resistent tegen de meeste andere behandelopties, waaronder chemotherapie en radiotherapie. Peptidereceptoren zijn op de oppervlakte van melanoomcellen overexprimeerd, wat het een aantrekkelijk doelwit maakt. De subtyp-2 somatostatine receptor (SSTR2) blijkt hoog te exprimeren in melanoomcellen.

Dacarbazine (DBZ) of dimethyl-triazeno-imidazole carboxamide (DTIC), een DNA-alkylerend middel, is de eerste en enige keuze van chemotherapeutisch geneesmiddel goedgekeurd door de FDA. DBZ is een krachtig alkylerend middel dat kankercellen doodt door alkylgroepen toe te voegen aan het DNA of kernmateriaal van kankercellen. Ondanks zijn potente werking, lijdt DBZ aan slechte wateroplosbaarheid en een korte halfwaardetijd (41 min) in de bloedsomloop, wat de therapeutische werking in de behandeling van melanoommaligniteiten vermindert. Bovendien werd een teleurstellende responsratio van 10-25% waargenomen met minder dan 5% complete kankerhersteling, wat de beperkingen van een monotherapie benadrukt. Er is daarom een urgente behoefte aan een alternatieve strategie om de behandelwirksamheid van DBZ te verbeteren.

Co-delivery van meerdere therapeutische middelen in een enkele toediening blijkt effectiever te zijn dan individuele therapeutische middelen. De co-delivery in een enkel drager systeem zorgt voor synergistische activiteit, vergelijkbare farmacokinetische eigenschappen en hogere antikankereffectiviteit. All-trans-retinozuur (ATRA) is een veelbelovend antikankermiddel dat wordt gebruikt in de behandeling van verschillende kankers. ATRA toont zijn therapeutische effectiviteit door te binden aan retinozuurreceptoren in de kern van kankercellen, wat resulteert in remming van groei, proliferatie, differentiatie en uiteindelijke celdood. In tegenstelling tot andere chemotherapeutische middelen leidt ATRA niet tot bijwerkingen zoals cardiotoxiciteit of beenmerghypoplasie. ATRA heeft aangetoond de antikankereffectiviteit te vergroten wanneer gecombineerd met een geschikt chemotherapeutisch middel. Ook ATRA lijdt aan slechte wateroplosbaarheid en snelle systemische clearance, wat de noodzaak van een stabiel afgiftesysteem benadrukt.

Nanodeeltjes-afgiftesystemen hebben aangetoond de therapeutische effectiviteit van geencapsuleerde therapeutica te verbeteren door deze vrij te maken in doeltumorweefsels en off-target effecten in de systemische circulatie te vermijden via het enhanced permeation and retention (EPR) effect. Vaste lipide nanodeeltjes (SLN) worden beschouwd als alternatief voor veel bestaande dragers zoals liposomen of micellen vanwege kenmerken als verbeterde stabiliteit, gecontroleerde afgifte, hoge laadefficiëntie en gemakkelijke bereiding/opschaling. Een belangrijk aspect van SLN als geneesmiddeldrager is het veiligheidsprofiel van lipiden die GRAS-status hebben, goed verdragen worden en fysiologische lipiden zijn. De stabiele incorporatie van geneesmiddelen in de lipide kern verbetert de wateroplosbaarheid en het farmacokinetische profiel en verlengt de fysiologische stabiliteit in de systemische circulatie.

In deze studie onderzoeken we een veelbelovende strategie van co-delivery van DBZ en ATRA met behulp van lipide nanoformuleringen voor combinatiebehandeling van melanoommaligniteiten. DBZ wordt verwacht in de lipide kern te laden, terwijl ATRA deel uitmaakt van de nanodeeltjesstructuur. We bestudeerden de fysicochemische eigenschappen, cellulaire opname en in vitro cytotoxiciteit van de gecombineerde nanodeeltjes. Daarnaast werd het antikankereffect verder geëvalueerd door apoptose-assay, celcyclusanalyse, kolonievorming en celmigratieanalyse.

Materialen en Methodes

Bereiding van DBZ/ATRA-Geladen Lipide Nanoformuleringen

De geneesmiddel-geladen lipide nanodeeltjes werden bereid via de sonicatiemethode. Kortom, 10 mg DBZ en 10 mg ATRA werden opgelost in 2 ml chloroformoplossing met 50 mg eieren l-α-fosfatidylcholine (PC) en 2 mg DSPE-methyl(polyetheenglycol)-2000 (mPEG₂₀₀₀). Het organische oplosmiddel werd gedroogd met argongas gedurende 20 minuten. Het gedroogde geneesmiddel-lipidemengsel werd toegevoegd aan 80 mg trimyristine (Tm) en geïncubeerd bij 65 °C gedurende 1 uur. Aan deze oliemengsel werd 5 ml van een 4% poloxameroplossing toegevoegd en direct met een proefsonicator bij 80 W gedurende 6 minuten gesonicateerd. De resulterende emulsie werd 30 minuten op ijs gekoeld. De nanodeeltjes werden onderworpen aan een Amicon Ultra 0,5 centrifugefilterunit (3 kDa afsnijwaarde; Merck, Duitsland) bij 12.000×g gedurende 20 minuten. De hoeveelheid vrije DBZ en ATRA in het filtraat werd geanalyseerd met HPLC en laadefficiëntie en laadcapaciteit werden berekend.

Deeltjesgrootte en Morfologieanalyse

De deeltjesgrootteverdeling van de gecombineerde nanodeeltjes werd geëvalueerd met een Malvern Zetasizer Nano ZS90 met een He-Ne laser (633 nm). Alle monsters werden verdund met gedestilleerd water en de experimenten werden in drievoud bij 24 °C uitgevoerd. De morfologie van de nanodeeltjes werd beoordeeld met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; JEOL JEM200CX bij 120 kV). De verdunde deeltjes werden gekleurd met 2% fosfo-wolframzuur, gedroogd en onder TEM bekeken.

In Vitro Geneesmiddelafgifte van Geladen Nanoformuleringen

De afgifte van geencapsuleerde geneesmiddelen werd geëvalueerd met de dialysemethode. Twee milliliter geneesmiddel-geladen nanodeeltjes met een equivalent van 1 mg ATRA en 1 mg DBZ werd verzegeld in een dialysemembraan (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa). De dialysebuis werd in 25 ml vrijgavebuffer geplaatst en bij 100 toeren/min op 37 °C geroteerd. Op vooraf vastgestelde tijdstippen tot 72 uur werden 1 ml monsters onttrokken en vervangen door evenveel verse buffer. De hoeveelheid DBZ en ATRA werd bepaald met HPLC zoals hierboven beschreven.

Celkweek en Cellulaire Opnameanalyse

Muishuidmelanoomcellen (B16F10) werden aangeschaft bij China Infrastructure of Cell Line Resources (Peking, China). De cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica-mengsel. Media werden elke 2 dagen ververst en gekweekt na 90% confluentie. Voor cellulaire opnameanalyse werden B16F10-cellen gezaaid in een 6-puttenplaat voor 24 uur incubatie. De nanodeeltjes werden geladen met Coumarine-6 als fluorescente tracker. Het oude medium werd verwijderd en vervangen door vers medium met Coumarine-6-lipide nanodeeltjes en geïncubeerd voor 1-3 uur in omgekeerde volgorde. De cellen werden gewassen en afgeschraapt met een celschraper. De cellen werden gecentrifugeerd bij 1200 toeren/min gedurende 5 minuten en het celpellet werd heropgelost in 1 ml koud PBS. De monsters werden geanalyseerd met een AccuriTM C6 stroomcytometer (BD Co., VS).

In Vitro Cytotoxiciteitsassay

Het cytotoxische effect van vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF op B16F10-cellen werd geëvalueerd met een MTT-assay. De cellen (1 × 10⁴) werden in elke put van een 96-puttenplaat gezaaid en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden eerst behandeld met verschillende concentraties vrije ATRA en DBZ en het antikankereffect op melanoomcellen getest. Vervolgens werden cellen behandeld met een vaste concentratie vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF van respectievelijk 25 μg/ml en 50 μg/ml. De cellen werden 24 uur geïncubeerd, waarna het medium zorgvuldig werd verwijderd en tweemaal met PBS gewassen. Ten slotte werden cellen behandeld met 100 μl van een 5 mg/ml MTT-oplossing en 4 uur geïncubeerd. Het kweekmedium werd zorgvuldig verwijderd en 100 μl isopropanol werd toegevoegd en 15 minuten onder schudden geïncubeerd. De opgeloste formazankristallen werden bestudeerd bij 570 nm met een microplaatlezer. Onbehandelde cellen dienden als controle en berekeningen werden gebaseerd op de celviabiliteit van de controles.

Apoptose-assay – Stroomcytometrie

Het apoptose-effect van vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF in B16F10-cellen werd geëvalueerd na kleuring met PE annexine V en 7AAD-gebaseerd apoptose-kit. De cellen werden gezaaid in een 12-puttenplaat bij een cel dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/put en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 μg/ml equivalenten van vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF formuleringen; onbehandelde cellen dienden als controle. Na 24 uur blootstelling werden de cellen gekleurd volgens het protocol van de fabrikant. Een AccuriTM C6 stroomcytometer werd gebruikt voor PE en 7AAD-expressie en minimaal 10.000 events werden verkregen. PE-positieve en 7AAD-negatieve cellen waren vroege apoptotisch; PE-positieve en 7AAD-positieve cellen waren late apoptotisch.

Celcyclusanalyse – Stroomcytometrie

De cellen werden gezaaid in een 12-puttenplaat bij een cel dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/put en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 μg/ml equivalenten van vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF formuleringen; onbehandelde cellen dienden als controle. Na 24 uur werden behandelde cellen gewassen en verzameld door trypsinizatie en gefixeerd met 70% ethanol gedurende 2 uur bij 4 °C. Cellen werden vervolgens behandeld met ribonuclease om eventuele RNA-verontreiniging te verwijderen. Vervolgens werden de cellen gekleurd met propidiumiodide (PI) gedurende 30 minuten bij 37 °C in de incubator. De fluorescentie van PI-gekleurde cellen werd bepaald met de AccuriTM C6 stroomcytometer. De celfase werd verdeeld in subG1, G1, S en G2/M fase.

Kolonievormingsassay

De cellen werden gezaaid in 12-puttenplaten bij een cel dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/put en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 μg/ml equivalenten van vrije ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF formuleringen. De behandelde cellen werden getrypsiniseerd, gewassen en geteld met een celteller. De cellen werden vervolgens gezaaid in een 6-puttenplaat bij een dichtheid van 1500 cellen/put. De cellen werden vervolgens geïncubeerd onder standaardomstandigheden van 37 °C gedurende 12 dagen tot de kolonieën zichtbaar waren. De cellen werden gewassen met PBS en gefixeerd met methanol tot azijnzuur tot water (1:1:8) gedurende 10 minuten, gevolgd door kleuring met 0,1% kristalvioleetkleuring gedurende 45 minuten. De gekleurde cellen werden vervolgens waargenomen onder een lichtmicroscoop.

Celmigratieassay

Een 12-putten transwell-kamer met 8 μm poriegrootte werd gebruikt voor deze assay. Om de studie te starten, werden 5 × 10⁴ cellen/put gezaaid in de bovenste kamer. Het bovenste medium bevatte geen FBS, terwijl het medium in de onderste kamer 10% FBS bevatte. Na 24 uur werd de hoeveelheid cellen die naar het onderste membraanoppervlak gemigreerd was, gefixeerd en gekleurd met 0,5% kristalvioleetkleurstof. Het aantal cellen werd geteld in vijf willekeurig geselecteerde velden onder een lichtmicroscoop; het gemiddelde aantal cellen werd vastgelegd en geanalyseerd.

Statistische Analyse

Data worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en in drievoud uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Twee groepen werden vergeleken met ongepaarde t-toetsen, terwijl de vergelijking van meer dan twee groepen werd gedaan met one-way ANOVA met Turkey's multiple-comparison test. Statistieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism software en een verschil van p < 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten en Discussie

Bereiding en Karakterisering van DBZ/ATRA-Geladen Lipide Nanoformuleringen

De behandeling van melanoom blijft een grote uitdaging en standaardbehandelopties zoals chemotherapie, radiotherapie of chirurgische resectie zijn alleen effectief op solide bulktumoren met een slechte prognose. De FDA heeft geneesmiddelen zoals paclitaxel of combinaties ervan goedgekeurd, maar deze hebben de algehele impact op patiëntenoorzaak en kankergenezing niet verbeterd. Dacarbazine (DBZ) is de eerste keuze chemotherapeuticum goedgekeurd door de FDA; DBZ lijdt echter aan slechte fysicochemische eigenschappen en resulteerde in een teleurstellende responsratio van 10-25%. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een nieuwe therapeutische strategie ontwikkeld van combinatie van ATRA en DBZ in lipide nanoformuleringen. We stelden de hypothese dat de combinatie van twee therapeutische componenten de antitumorale effectiviteit in melanoommaligniteiten zal verbeteren. Het is opvallend dat ATRA, ondanks antikankereigenschappen, geen nadelige effecten in de systemische omgeving veroorzaakt. Aangezien DBZ hydrofoob is, hebben we lipide nanoformuleringen ontworpen die hydrofoobe geneesmiddelen stabiel in de lipide kern kunnen incorporeren, terwijl ATRA geladen wordt als structureel component van de nanodeeltjes. De lipide nanodeeltjes die de therapeutische componenten dragen, helpen bij de levering in diep gelegen tumoren in het lichaam.

De laadefficiëntie van DBZ en ATRA was respectievelijk 91,2 ± 1,25% en 95,8 ± 1,14%. De laadcapaciteit van DBZ en ATRA in RD-LNF was respectievelijk 7,07 ± 0,65% w/w en 7,48 ± 1,05% w/w. De deeltjesgrootte van D-LNF was 121,5 ± 1,65 nm met een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,134 en zetapotentiaal van -23,5 ± 0,85 mV. De deeltjesgrootte van RD-LNF was 138,2 ± 1,28 nm met een PDI van 0,159 en zetapotentiaal van −25,4 ± 0,58 mV. De toename in algemene deeltjesgrootte werd voornamelijk toegeschreven aan de structurele lading van ATRA; de uiteindelijke grootte van RD-LNF was echter minder dan 150 nm, wat preferentiële accumulatie in maligne melanoomtumorens mogelijk maakt door het EPR-effect. Bovendien voorkomt de aanwezigheid van hydrofiel PEG aggregatie van deeltjes en vermindert de opname door het reticulo-endotheliale systeem (RES), wat de systemische prestaties in het lichaam verbetert. Het oppervlakte lading van ongeveer -25 mV zorgt voor uitstekende opslagstabiliteit. De deeltjesmorfologie werd onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Zowel D-LNF als RD-LNF zijn perfect sferisch en gelijkmatig verdeeld op het koperen rooster. Het grootteverschil tussen D-LNF en RD-LNF was consistent met de DLS-waarneming. Het ontbreken van deeltjesdebris, kleine deeltjes en aggregatie duidt op het succes van het formulatieproces.

Stabiliteitsanalyse en In Vitro Geneesmiddelafgifte van D-LNF en RD-LNF

RD-LNF vertoonde uitstekende stabiliteit bij zowel pH 7,4 (PBS) als serum (10% FBS) condities. De deeltjesgrootte toonde geen significante toename in beide condities gedurende de studietijd, wat de stabiliteit van de nanodeeltjes aangeeft. De vermogen om geneesmiddelen op tijd vrij te geven, bepaalt de effectiviteit van geladen nanodeeltjessystemen. We hebben de vrijgavekinetiek van DBZ en ATRA uit D-LNF en RD-LNF in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) uitgevoerd. Er werd geen burst release of gefaseerde vrijgave van geneesmiddel waargenomen uit een van de twee nanodeeltjessystemen, wat duidt op stabiele lading in de kern van de nanodeeltjes en niet op het oppervlak. Er werd geen significant verschil in de vrijgave van DBZ waargenomen tussen D-LNF en RD-LNF, wat aangeeft dat de aanwezigheid van ATRA het vrijgavepatroon niet vertraagt of verandert. Een lichte vertraging in de vrijgave van DBZ uit RD-LNF kan worden toegeschreven aan het verhoogde padlengte door ATRA in de lipide structuur. Het is opvallend dat ATRA significant langzamer vrijkwam dan DBZ in het RD-LNF drager systeem. Significante verschillen begonnen na 24 uur tot 72 uur te verschijnen, voornamelijk toegeschreven aan de extreme hydrofoobe aard van ATRA en het deel uitmaken van het structurele component. Over het algemeen zal het ontbreken van burst release en gecontroleerde vrijgave van therapeutische componenten de melanoomkankerbehandeling ten goede komen.

In Vitro Cellulaire Opname

Hogere of verbeterde cellulaire opname van nanodeeltjes bepaalt de therapeutische effectiviteit in kankercellen. We hebben de cellulaire opname van RD-LNF in B16F10-kankercellen uitgevoerd en Coumarine-6 als fluorescente tracker gebruikt. Opvallende internalisatie van nanodeeltjes werd waargenomen na 1 uur incubatie en de opname nam consistent toe tot 3 uur. De opvallende opname van lipide nanoformuleringen is consistent met de hogere cellulaire opname van lipide-gebaseerde dragersystemen. Er werd gespeculeerd dat passieve diffusie en endocytose-gebaseerde mechanismen verantwoordelijk kunnen zijn voor de hogere cellulaire opname. De nanodeeltjes bereiken na endocytose de lysosoom waar de geencapsuleerde geneesmiddelen vrijkomen en hun respectieve farmacologische werking uitoefenen.

In Vitro Cytotoxiciteitsassay

MTT-assay werd uitgevoerd op B16F10-cellen na behandeling met respectieve formuleringen om het antikankereffect van individuele therapeutische middelen te evalueren. Allereerst werd de cytotoxiciteit van individuele vrije DBZ en ATRA geëvalueerd. DBZ vertoonde een concentratie-afhankelijk cytotoxisch effect in melanoomkankercellen, terwijl ATRA een significant hoger cytotoxisch effect in B16F10-cellen vertoonde. Bij 100 μg/ml vertoonde DBZ ~45% celviabiliteit vergeleken met ~22% celviabiliteit voor ATRA, wat de uitstekende therapeutische effectiviteit van ATRA aangeeft. Om te bewijzen dat co-delivery van DBZ en ATRA potentiëel kankerprogressie kan remmen, werden DBZ+ATRA-geladen lipide nanoformuleringen (RD-LNF) behandeld aan melanoomcellen. DBZ-geladen lipide nanoformuleringen (D-LNF) met enkelvoudig geneesmiddel werd gebruikt als referentiegroep om de synergistische effectiviteit van ATRA te benadrukken. Zoals verwacht vertoonde ATRA bij 25 μg/ml vaste concentratie iets lagere celviabiliteit dan DBZ, terwijl nanodeeltjes-gebaseerde D-LNF het antikankereffect van DBZ niet verbeterde en ver van effectief was. Zoals verwacht vertoonde RD-LNF significant lagere celviabiliteit en hoger antikankereffect vergeleken met D-LNF, wat een duidelijke synergistische therapeutische effect van de dubbele componenten naar melanoomkankerceldood aangeeft. RD-LNF vertoonde een significant hoger antikankereffect vergeleken met enige andere behandelgroep. Het kan verwacht worden dat langzame en sustained vrijgave van DBZ samen met langzame vrijgave van ATRA uit het nanodragersysteem kan bijdragen aan het synergistische therapeutische effect.

Kolonievormingsassay

De kolonievormingsassay werd uitgevoerd om het tumorigene potentieel van melanoomcellen te evalueren. Zoals getoond, hebben vrije DBZ en ATRA een beperkte rol in het remmen van kolonievorming en D-LNF was oneffectief in het controleren van kolonievorming. Zoals verwacht, resulteerde de combinatie van DBZ + ATRA in significante potentiëring van inhibitie van kolonievorming vergeleken met individuele vrije geneesmiddelen of enkelvoudig geladen nanodeeltjes. De kolonievormingsassay bevestigt de superieure antikankereffectiviteit van RD-LNF boven vrije geneesmiddelen.

In Vitro Apoptose-assay en Celcyclusanalyse

De apoptose-inductie van B16F10-cellen na behandeling met D-LNF en RD-LNF werd bestudeerd met een stroomcytometer na kleuring van de cellen met Annexin V-FITC/PI-mengsel. Zoals getoond, veroorzaakten ATRA en DBZ slechts 10-12% apoptose van kankercellen en veel cellen bleven intact. Een lichte toename in vroege apoptotische cellen werd waargenomen na D-LNF-behandeling, wat het effect van de afgifte-drager kan suggereren. Belangrijk is dat RD-LNF een groter deel apoptotische cellen induceerde met een groter deel cellen in late apoptose en vroege apoptose, wat de superieure antikankereffectiviteit van combinatienanodeeltjes aangeeft. RD-LNF liet zien dat late apoptotische cellen met 21,5% toegenomen, vroege apoptotische cellen tot 18,3% toegenomen en het aandeel levende cellen gedaald was van 95% naar 52%, wat suggereert dat de combinatie van DBZ + ATRA bijdroeg aan apoptose van kankercellen en de proliferatie van B16F10-melanoomcellen kon remmen. Het apoptose-effect van formuleringen werd verder bevestigd door celcyclusanalyse. Zoals getoond, vertoonden DBZ en ATRA een lichte toename in de sub-G0-populatie, terwijl D-LNF een relatief hogere sub-G0-populatie vertoonde vergeleken met individuele vrije geneesmiddelen. Opvallend was een opmerkelijke toename in de sub-G0-populatie waargenomen voor RD-LNF-behandelde melanoomcellen, wat duidt op gemarkeerde apoptose van de kankercellen. Het is bekend dat DBZ de p21, caspase-3 en gespleten PARP-expressieniveaus kan verhogen en daarbij celdood bevordert door stabilisatie van p53. De inductie van p53 zal de celcyclusvoortgang remmen. De combinatie van DBZ + ATRA wordt verwacht het apoptose-mechanisme te potentiëren en de celcyclusvoortgang van kankercellen te stoppen en de antikankereffectiviteit te vertonen.

Effect van Combinatienanodeeltjes op Celmigratie

De celmigratie werd geanalyseerd door het transwell-membraan en de migrerende cellen waargenomen door kristalvioletterkleuring. Na 24 uur hadden controlecellen bijna complete migratie van kankercellen bereikt. ATRA lijkt celmigratie relatief beter te remmen dan DBZ-behandelde cellen. D-LNF vertoonde ook een opvallend inhibitorisch effect op celmigratie; het meest opvallende celmigratie-effect werd echter waargenomen in RD-LNF-behandelde B16F10-melanoomcellen. Er werd een manifold afname in celmigratie waargenomen vergeleken met niet-behandelde controlecellen. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat RD-LNF potentiëel de aberrante maligne celproliferatie vermindert en celmigratie efficiënt onderdrukt.

Conclusie

Concluderend hebben we met succes dacarbazine en all-trans retinozuur-geladen lipide nanoformuleringen geformuleerd. Onze resultaten tonen duidelijk aan dat RD-LNF melanoomcelproliferatie remt, opvallende apoptose induceert en celcyclusvoortgang en celmigratie remt. Toekomstig werk zal zich richten op het bestuderen van de antikankereffectiviteit in klinisch relevante diermodellen en het ontwikkelen van een gerichte therapie naar de melanoommaligniteit. Dit is een voorlopige studie uitgevoerd in melanoomcellen en een breed scala studies in verschillende klinisch relevante diermodellen zijn het volgende deel van ons onderzoeksarbeid.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Niet van toepassing

Afkortingen

DBZ:

Dacarbazine

ATRA:

All-trans retinozuur

D-LNF:

DBZ-geladen lipide nanoformuleringen

RD-LNF:

ATRA/DBZ-geladen lipide nanoformuleringen

SLN:

Vaste lipide nanodeeltjes