Apoptose-paden drijven cytotoxiciteit van verse vs. oude zinkoxide nanopartikelen

Samenvatting

Zinkoxide nanopartikelen (ZnO NPs) worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen inclusief industrie, commerciële producten en medisch veld. Talrijke mechanistische studies voor ZnO NPs toxiciteit werden uitgevoerd op pristine (verse) NPs. Echter, de cytotoxiciteit geïnduceerd door getransformeerde (oude) ZnO NPs en de onderliggende mechanismen blijven onduidelijk. Hier waarnemen we de fysicochemische transformatie van ZnO NPs die im loop van de tijd plaatsvindt, gevolgd door het evalueren van de cytotoxiciteit van verse en oude NPs. We vonden dat verse ZnO NPs hogere apoptose-niveaus induceerden dan hun oude tegenhangers. Diovereenkomstig toonden RNA-sequentie data van oude ZnO NP-behandelde mens-hamster hybride (A_L) cellen aan dat p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Oxytocine en Jak-STAT signaleringspaden verrijkt waren maar geen apoptose-pad. Kwantitatieve PCR-resultaten onthulden significant hogere mRNA-niveaus van IL1B en CD69 in verse NP-behandelde groepen vergeleken met die van oude ZnO NP- en zinkchloride-behandelde groepen. De bovengenoemde resultaten gaven aan dat de lagere cytotoxiciteit van oude ZnO NPs deels wordt toegeschreven aan hun verminderde potentie in het induceren van apoptose. De transcriptionele regulatie van meerdere signaalpaden geactiveerd door oude NPs kan helpen om de cellulaire homeostase op te bouwen. Samen genomen benadrukken onze bevindingen de invloed van het verouderingsproces (omgevings-transformatie) van ZnO NPs op hun toxiciteiten en biologische gevolgen.

Inleiding

Met de snelle ontwikkeling van nanotechnologie over de afgelopen decennia, zijn nanopartikelen (NPs) toegepast in verschillende velden, inclusief industrie, menselijk dagelijks leven en nanogeneeskunde. De Nanotechnologie Consumptieproduct Inventaris (CPI) toont een 30-voudige toename tussen 2005 en 2015 in het aantal nanoproducten, inclusief 762 gezondheidsproducten (fitness), 72 voedingsmiddelen (dranken) en 23 babyproducten. De groeiende toepassing van NPs in consumentenproducten en verschillende velden verhoogde de mogelijkheid van NPs het milieu binnen te dringen, wat veiligheidszorgen oproept met betrekking tot hun potentiële nadelige impacten. Zinkoxide (ZnO) NPs zijn onder de meest gebruikt NPs, en de wereldwijde jaarlijkse productie heeft bijna 3400 ton bereikt. Sommige stoffen die eerder als biologisch inert werden beschouwd, kunnen toxisch worden in hun nanopartikulaire toestand. Een toenemend aantal studies heeft uitgelegd dat ZnO NPs significante risico's kunnen poseren voor zoogdiercellen en dieren door significante toxiciteit te induceren.

Verschillende strategieën inclusief coating, oppervlaktefunctionaliserings- en oxidatietoestandsmodificatie zijn gebruikt om de potentiële toxiciteit van NPs te verzwakken door de fysieke en chemische eigenschappen van hen te modificeren (zoals de ontbinding, agglomeratie en perturbatie van celmembranen). Hoewel deze modificaties van NPs hun toxische effecten in een bepaalde mate verzwakken, is het gebruik van NPs niet altijd veilig, vooral onder bepaalde blootstellingscondities en omgevingen. Eigenlijk zijn veel soorten NPs niet stabiel en geneigd om "veroudering" of "omgevings-transformatie" te ondergaan na intentionele of onbedoelde vrijlating in het natuurlijke milieu. In de afgelopen jaren werd veel werk uitgevoerd om het omgevings-transformatieproces van NPs te verkennen; echter, het onderzoek naar de toxische effecten van "getransformeerde (oude)" NPs is nog steeds zeer beperkt, laat staan hun toxische mechanismen.

Als de typische vertegenwoordiger van niet-persistente NPs, hebben ZnO NPs een zeer hoge reactiviteit, en zijn geneigd om te transformeren in fysieke en chemische eigenschappen en toestandsvorm na het vrijgelaten worden in het milieu of geconsumeerd door dieren, wat hun toxicologische effecten significant kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld, studies hebben getoond dat het sulfideringsproces van ZnO NPs de lading, hydrofobiciteit en aggregatietoestand veranderde, resulterend in de adsorptie van sulfides toestands NPs in menselijke speeksel, zweet en bronchoalveolaire lavagevloeistof. Verder vormt het eiwit geadsorbeerd door ZnO NPs een specifieke eiwitkroon die meestal het biologische effect beïnvloedt. Fosfaten in fysiologische oplossingen konden ZnO NPs omzetten in metastabiele ZnHPO₄ en Zn₃(PO₄)₂ binnen ongeveer 5–10 uur. Het proces van complete transformatie van ZnO NPs (≤ 3 μg/mL) in het in vitro blootstellingssysteem aan humane T-lymfocyten (37 °C, celkweekmedium RPMI1640 bevattende 10% FBS gedurende 24 uur) werd onderzocht door gebruik te maken van synchrotronstraling Röntgenabsorptie nabij-rand structuurspectroscopie (XANES). De bovengenoemde studies suggereren de onderschatting van ZnO NPs milieu- en gezondheidsrisico's door uitsluitend de biologische effecten van pristine (verse) ZnO NPs te evalueren. In het licht van dit probleem, is er een dringende behoefte om de verouderings- en omgevings-transformatieprocessen van NPs volledig te begrijpen.

Onze eerdere studie onthulde dat ZnO NPs verouderd gedurende 40–120 dagen in ultrazuiver water fysicochemische transformatie ondergingen en omgezet werden in Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂, en Zn²⁺. Interessant genoeg, vertoonden oude ZnO NPs lagere cytotoxiciteit dan de verse tegenhangers, doch de toxiciteitsmechanismen van dergelijke variatie zijn onduidelijk. In de huidige studie zetten we uit om de onderliggende redenen van verschillende cytotoxiciteiten tussen verse en oude ZnO NPs te verkennen. ZnO NPs met twee verschillende deeltjesgroottes (20 nm en 90–200 nm) werden systematisch toegepast. De cytotoxiciteitsassays toonden aan dat oude ZnO NPs minder duidelijke morfologische abnormaliteiten en relatief hogere cellevensvatbaarheden induceerden dan hun verse tegenhangers. RNA-sequentie data onthulden dat apoptotische genen verrijkt waren in verse ZnO NP-behandelde cellen, terwijl deze genen veel minder beïnvloed waren door oude ZnO NP-behandelingen. Daarnaast toonden cellen blootgesteld aan oude ZnO NPs een verlaagd niveau van gespleten Caspase-3 eiwit, wat verder duidt op de hogere potentie van verse ZnO NPs in het oproepen van apoptose in gekweekte cellen. Gecombineerd met onze eerdere bevindingen, suggereerde deze studie dat de verminderde cytotoxiciteit van oude ZnO NPs wordt toegeschreven aan hun verzwakte vermogen om celdood te triggeren.

Materialen en methoden

Nanopartikelen en reagentia

Commercieel beschikbare ZnO nanopowders (ZnO NPs), met fabrikant gerapporteerde gemiddelde grootte 20 nm (99,5% zuiverheid, bijna sferisch) en 90–200 nm (99,9% zuiverheid, irreguliere morfologie), werden gekocht van Nanostructured & Amorphous Materials (Houston, TX). Behalve anders vermeld, werden alle reagentia en chemicaliën gebruikt in deze studie gekocht van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Nanopartikel dispersie, veroudering en karakterisering

ZnO NPs voorraadsuspensies (1 mg/mL) werden bereid door droge nanopowders op te lossen in Milli-Q H₂O (Millipore, 18 MΩ cm) en gesteriliseerd door autoclaven (120 °C, 30 min) en vervolgens opgeslagen bij 25 °C voor natuurlijke verouderingsperiode variërend van 0 tot 60 dagen. De 0- en 60-dagen natuurlijk getransformeerde ZnO NPs werden aangewezen als verse en oude NPs, respectievelijk. Om een goede dispersie te garanderen, werden de verse en oude suspensies gesonicatieerd (100 W) gedurende 30 min in een ultrasonisch bad vóór karakterisering of incubatie met cellen. De morfologie, deeltjesgrootte en aggregatie van verse en oude ZnO NPs werden gekarakteriseerd door gebruik te maken van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Japan). De kristalstructuur van verse en oude ZnO NPs werd bepaald door gebruik te maken van poeder Röntgendiffractie (XRD, PANalytical B.V., Shanghai, China) door te vergelijken met authentieke standaarden. De details van het natuurlijke verouderingsproces en karakterisering van ZnO NPs zijn eerder beschreven.

Celkweek en behandeling met ZnO NPs

A_L cellijn, een soort mens-hamster hybride cellen gevormd door fusie van de gly2A mutante van Chinese hamster ovary (CHO) en humane fibroblasten werd gebruikt in deze studie. Deze hybride cellen bevatten een standaard set CHO-K1 chromosomen en een enkele kopie van menselijk chroomsoom 11 en werden gekweekt in Ham's F12 medium (Hyclone, Grand Island, NY) aangevuld met foetale boviene serum (8%, Hyclone, Grand Island, NY), gentamicine (25 g/mL) en glycin (2 × 10⁻⁴ M) bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO₂ incubator. De voorraadsuspensies van verse en oude ZnO NPs werden gedispergeerd door 30 min ultrasonificatie (100 W) om agglomeratie te voorkomen, vervolgens verdund tot geschikte concentraties met celkweekmedia voor de blootstelling van cellen. Cellen onderhouden in celkweekmedia zonder NPs dienden als controle in elk experiment.

Assay voor het detecteren van de cytotoxiciteit

A_L cellen in een logaritmische groeifase werden gekweekt op glaasjes in 35-mm Petrischalen (6 × 10⁴ cellen/schaal) gedurende 24 uur vóór stimulatie, gevolgd door behandeling met 2 mL kweekmedium bevattende 1, 5, 10, 12, 15 en 20 µg/mL verse of oude ZnO NPs gedurende 72 uur. Na voltooiing van de behandelingstijd, werden de afbeeldingen van celmorfologie verkregen met behulp van een Leica DM4B microscoop (Leica, Duitsland). ZnCl₂ werd opgenomen als zinkionenreferentie voor het vergelijken van de cytotoxiciteit met ZnO NPs.

De celtellingskit (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) werd gebruikt voor het detecteren van de cellevensvatbaarheid. In detail, A_L cellen wurden gezaaid in 96-put platen (4 × 10³ cellen/put) met celkweekmedia gedurende 24 uur en behandeld met medium bevattende verschillende concentraties van ZnCl₂, verse en oude ZnO NPs gedurende 24, 48 en 72 uur, respectievelijk. Voor de werkoplossing was het volume van toegevoegde NPs uit de voorraadsuspensie minder dan 5% van het totale volume van het kweekmedium in elke put. Na voltooiing van de behandelingstijd, werd het kweekmedium geaspireerd, en de cellen werden geïncubeerd met 100 µL CCK-8 werkoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werd de absorbantie vastgelegd bij 450 nm met behulp van een Spectra Max M2 fluorescentielezer (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK). De cellevensvatbaarheid werd berekend als een percentage van absorbantie in putten, met elke concentratie van NPs genormaliseerd aan de absorbantie van controlecellen (100%).

RNA-extractie, reverse transcriptie en kwantitatieve PCR

A_L cellen in een logaritmische groeifase werden gezaaid in 35-mm diameter Petrischaal (6 × 10⁴ cellen/schaal) met celkweekmedia gedurende 24 uur. Dan werd het medium vervangen door 2 mL kweekmedium bevattende 12 µg/mL ZnCl₂, verse en oude ZnO NPs gedurende 72 uur. Na voltooiing van de behandelingstijd, werd het kweekmedium geaspireerd, en cellen werden 3 keer gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 mL Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) aan elke schaal toegevoegd om totaal RNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant. Concentratie en zuiverheid van totaal RNA verkregen na de extractie werden gekwantificeerd met behulp van een Q5000 UV-Vis Spectrofotometer (Quawell, VS). Na kwantificering, werd reverse transcriptie uitgevoerd met behulp van TransGene RT-PCR kit (TransGene Biotech, Beijing, China) om cDNA te verkrijgen van de RNA-sjabloon volgens de protocollen van de fabrikant. De resulterende cDNA-monsters werden gekwantificeerd door gebruik te maken van de Q5000 UV-Vis Spectrofotometer en vervolgens geanalyseerd met behulp van SYBR-Green als fluorescentiekleurstof (TransGene Biotech, Beijing, China) op Roche RT-PCR systeem (Applied Biosystems).

Het huishoudgen dat glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (Gapdh) codeert, werd gebruikt als interne controle voor het evalueren van Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun en MT1 mRNA-expressie. De resultaten werden uitgedrukt als de relatieve expressieverhouding tussen het doelgen en Gapdh. De primersequenties gebruikt in deze studie zijn verstrekt in Tabel 1.

RNA-sequentie data analyse

De totaal RNA-monsters van A_L cellen van controle groep, oude ZnO NP-behandelde groep en ZnCl₂ behandelde groep werden gesequenceerd door BangFei Bioscience (Beijing, China). Kortom, het totaal RNA van A_L cellen werd geëxtraheerd volgens de TRIZOL-protocollen, tot de isopropanol-neerslag. Dan werden de RNA-monsters heropgelost in de extractiepuffer vóór sequentiëring. De rauwe telling RNA-sequentie data werden geanalyseerd met behulp van R-pakket Deseq2. Het Venn-diagram werd gegenereerd door R-pakket VennDiagram. De significant gewijzigde genen werden gebruikt voor verdere pathway-verrijkingsanalyse. Experimenten werden drie onafhankelijke replicates gedaan. rRNA-genen, mitochondriale genen en de genen gedetecteerd minder dan 40 bp werden uitgesloten van de analyse.

De RNA-sequentie data, referentie series GSE97852, GSE60159 en GSE39444, werden verkregen van Gene Expression Omnibus. De Gene Set Enrichment Analysis plot werd gegenereerd door R (versie 3.6.2) met behulp van pakket fgsea. De apoptose-genen met 1,5-voudige significante verandering & p-waarde < 0,05 werden gebruikt voor verdere analyse. De heatmap met genboom werd gegenereerd door R-pakket "ComplexHeatmap". Gemiddelde koppeling werd gebruikt als clusteringsmethode, en Euclidische afstand werd gebruikt als afstandsmeetmethode. De pathway-verrijkingsanalyse werd voorafgegaan door STRING2.0.

Western Blotting

A_L cellen in een logaritmische groeifase werden gezaaid in 60-mm diameter Petrischaal (1,5 × 10⁵ cellen/schaal) met celkweekmedia gedurende 24 uur. Dan werd het medium vervangen door 4 mL kweekmedium bevattende 12 µg/mL verse of oude ZnO NPs gedurende 24 uur. Aan het einde van de blootstellingsperiode, werd het kweekmedium geaspireerd, en vervolgens werden cellen 3 keer gewassen met PBS en op ijs gelyseerd met RIPA lysatiebuffer (Beyotime, China) om cellulaire eiwitten te verzamelen. Gelijke hoeveelheden cellulaire eiwitten werden gescheiden op 12% SDS-PAGE gelden en vervolgens overgebracht naar een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan (Roche, Zwitserland). Kortom, na 2 uur blokkeren met 5% vetvrije melk in TBST bij 25 °C, werden de membranen vervolgens geïncubeerd met primaire antilichamen bij geschikte verdunningen (volgens de protocollen van de fabrikant) bij 4 °C overnacht, gevolgd door incuberen met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5000, Promega, Madison, VS) gedurende 2 uur bij 25 °C. Ten slotte werd immunolabeling gedetecteerd met behulp van een versterkte chemiluminescentie (ECL) (BOSTER, China) oplossing. De primaire antilichamen van anti-pro/gespleten Caspase-3 en anti-Actine werden gekocht van Cell Signaling Technology en ImmunoWay, respectievelijk.

Statistiek

Statistische analyse werd samengesteld op de gemiddelden van de resultaten verkregen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. Alle data werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD) en statistisch vergeleken met behulp van eenrichtingsvariatieanalyse (ANOVA). In alle grafieken werden p-waarden < 0,05 getoond als * en beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Karakterisering van ZnO NPs

Om de verschillen in gedetailleerde fysicochemische kenmerken tussen verse en oude ZnO NPs te bepalen, observeerden we eerst de morfologie van NPs met behulp van TEM (Fig. 1A). Onze resultaten gaven aan dat 20 nm verse ZnO NPs bijna sferische kristallen waren en 90–200 nm verse ZnO NPs irreguliere staaf-/kubische kristallen waren. De enkele deeltjesgrootte was consistent met de grootte verstrekt door de fabrikant. Duidelijk waren zowel 20 nm als 90–200 nm ZnO NPs geneigd om te agglomereren in ultrazuiver water. Ook, ongeacht de vorm en grootte van de oorspronkelijke NPs, werd de microstructuur van zowel 20 nm als 90–200 nm ZnO NPs dramatisch veranderd van een heldere kristalstructuur naar een amorphe of blad-/naald-achtige toestand na 60 dagen veroudering. Verder werden de kristallijne aard en fasezuiverheid van zowel verse als oude NPs bepaald door gebruik te maken van Röntgendiffractie (XRD) met Cu Kα straling (λ = 0,15418 nm) benadering bij 25 °C, zoals getoond in Fig. 1B. Het XRD-patroon van verse ZnO NPs gaf aan dat de monsters samengesteld waren uit kristallijne wurtziet-structuur en geen karakteristieke onzuiverheidspieken geïdentificeerd werden, wat suggereert een hoge kwaliteit van verse NPs. Voor oude NPs, vertoonde het XRD-patroon de neoformatie van Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (kaartnummer 00-011-0287) en Zn(OH)₂ (kaartnummer 00-003-0888) vaste fasen, wat de chemische transformatie van ZnO NPs (20 en 90–200 nm) tijdens het verouderingsproces aangeeft.

Morfologische observatie van A_L cellen blootgesteld aan verse en oude ZnO NPs

NPs-behandeling resulteert in een opvallende verandering in cellulaire vorm, of morfologie, in vitro. Daarom werden A_L cellen blootgesteld aan verse of oude ZnO NPs bij 10 & 15 µg/mL gedurende 72 uur onderzocht onder een stereoscopische microscoop. Zoals getoond in Fig. 2, bleef de celmorfologie in de controlegroep normaal. De cellen hechtten goed, met de meeste binnen 2 uur hechtend. De meeste cellen waren spindelvormig of polygoonvormig, met een paar net delende cellen die een meer transparant cytoplasma en betere dispersie vertoonden tijdens het hechtingsproces. Behandeling met 12 μg/mL verse ZnO NPs (20 nm & 90–200 nm) gedurende 72 uur veranderde de celmorfologie significant. Hoewel de meeste cellen binnen 3–5 uur hechtten, konden ze niet goed spreiden, en sommige cellen werden afgerond en verloren de polygoonvorm. Toen de concentratie van ZnO NPs werd verhoogd tot 15 μg/mL, atrofieerden de behandelde cellen en konden niet hechten, wat hun significant lagere cellevensvatbaarheid suggereerde dan die van de cellen behandeld met 10 μg/mL. Deze resultaten gaven aan dat de LC100 voor verse ZnO NPs waarschijnlijk minder dan 15 μg/mL is door een 72-uurs behandeling. In tegenstelling, was de celmorfologie in 20 nm en 90–200 nm oude NP-behandelde groepen (15 μg/mL) niet significant beïnvloed, en de meeste van de overlevende cellen konden hechten en spreiden, met minder dan de helft dode cellen waargenomen, onthullend dat oude ZnO NPs veel minder cytotoxisch zijn dan verse ZnO NPs.

Oude ZnO NPs induceerden lagere cytotoxiciteit dan verse NPs

Om het verschil in cytotoxiciteit tussen verse en oude ZnO NPs verder te onderzoeken, onderzochten we de cellevensvatbaarheid door gebruik te maken van CCK-8 kits. Zoals getoond in Fig. 3, toonde incubatie van A_L cellen met gradient doses van verse en oude ZnO NPs (variërend van 0 tot 20 μg/mL, 20 nm en 90–200 nm) gedurende 24 uur, 48 uur of 72 uur een dosis-afhankelijke afname in cellevensvatbaarheid. Geen duidelijke cytotoxiciteit werd waargenomen door behandeling van cellen met ZnO NPs ≤ 10 μg/mL. Toen de dosering van verse en oude ZnO NPs steeg tot 12 en 15 μg/mL, toonde de cellevensvatbaarheid een tijds-afhankelijke afnamende tendens. Duidelijk was de cellevensvatbaarheid in oude NP-behandelde groepen significant hoger dan verse NP-behandelde groepen. Bovendien compromisde ZnCl₂-behandeling ook de cellevensvatbaarheid in een dosis- en tijds-afhankelijke manier, terwijl de cytotoxiciteit van ZnCl₂ veel minder was dan die van zowel verse als oude ZnO NPs.

Behandeling met verse ZnO NPs activeerde apoptose-paden en verhoogde de expressie van apoptotische genen

Om de onderliggende mechanismen te onthullen die leiden tot de lagere cytotoxiciteit van oude NPs, analyseerden we RNA-sequentie data van zowel verse als oude ZnO NPs. Zoals getoond in Fig. 4A, B, na behandeling met verse ZnO NPs, werd apoptose-pad geactiveerd in Jurkat-cellen (p = 0,017) en HMDM-cellen (p = 0,041). De apoptose-genen: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38 en ISG20 waren significant verrijkt in verse ZnO NP-behandelde Jurkat-cellen. De apoptose-genen: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D en SPTAN1 waren significant verrijkt in verse ZnO NP-behandelde HMDM-cellen (Fig. 4C, D). Aangezien Jurkat-cellen (perifere bloed T-lymfocten) en HMDM-cellen (humane monocyten-afgeleide macrofagen) verschillende soorten cellen zijn, kan de manier waarop ze apoptose triggeren anders zijn. Samengevat, toonden deze resultaten aan dat blootstelling aan verse ZnO NPs verschillende apoptose-paden in verschillende soorten cellen kan activeren.

Oude ZnO NPs verhoogden de expressie van apoptotische genen niet zoals verse ZnO NPs

Onze RNA-sequentie data van oude ZnO NP-behandelde A_L cellen toonden aan dat p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Oxytocine en Jak-STAT signaleringspaden verrijkt waren (Fig. 5A). De apoptose-genen verrijkt in Jurkat- en HMDM-cellen werden niet significant beïnvloed in de oude ZnO NP-behandelde cellen (Fig. 5B). Om de bevindingen te bevestigen, testten we de expressie van gerelateerde genen door real-time PCR. We vonden dat sommige van de apoptose-genen: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38 en IL1β ondetecteerbaar waren in oude ZnO NPs-behandelde A_L cellen (data niet getoond), waarschijnlijk omdat de meeste van deze genen geëxprimeerd zijn in immuunsysteemcellen. De andere opgereguleerde apoptose-genen (IL1α, IL1β en CD59) waargenomen in verse ZnO NP-behandelde groepen weren niet significant gewijzigd in expressieniveaus door oude ZnO NPs-behandeling. Terwijl MT1 die dient als positieve controle significant verhoogd was in expressieniveau, was de expressie van Caspase 3 niet significant gewijzigd (Fig. 5C). Deze data suggereerden dat oude ZnO NPs, in tegenstelling tot hun verse tegenhangers, minder potent zijn in het activeren van apoptose-pad genen in A_L cellen.

Verse maar niet oude ZnO NPs verhoogden het expressieniveau van het geactiveerde Caspase-3 eiwit

Detectie van genexpressie van Caspase 3 alleen kan niet direct de activatie van apoptose-pad aangeven. Om verder te analyseren of ZnO NPs-behandeling apoptotische eiwittenniveaus kon veranderen, werd de expressie van gespleten Caspase-3 eiwit, een veelgebruikte biomarker om de activatie van celdood aan te duiden, onderzocht door Western blotting analyse. Zoals getoond in Fig. 6, vergeleken met de controlegroep, verhoogde verse ZnO NPs (20 nm) behandeling het cellulaire niveau van gespleten Caspase-3 eiwit met 1,31 ± 0,023-voud, wat significant hoger was dan die van oude 20 nm ZnO NPs-behandelde groep (1,12 ± 0,039-voud). Toen de deeltjesgrootte van verse ZnO NPs werd verhoogd tot 90–200 nm, was de expressie van gespleten Caspase-3 eiwit geïnduceerd door verse NPs verhoogd met 1,46 ± 0,078-voud, significant groter dan die van oude NPs (1,07 ± 0,075-voud). Deze data illustreerden verder de hogere potentie van verse ZnO NPs in het induceren van celdood, in vergelijking met hun oude tegenhangers.

Discussie

ZnO NPs werden gerapporteerd om fysicochemische transformatie te ondergaan in Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ met de vrijgave van Zn²⁺ tijdens het natuurlijke verouderingsproces. Echter, de cytotoxiciteit geïnduceerd door de getransformeerde (oude) ZnO NPs en de onderliggende mechanismen blijven onduidelijk. Hier, om het mechanisme van diverse cytotoxiciteit tussen verse en oude ZnO NPs te onthullen, werden RNA-sequentie analyse en RT-PCR test uitgevoerd. Ook werd Western blotting toegepast om het eiwitniveau van Caspase-3, de sleutel-uitvoerer in celdood, te onderzoeken.

Onze data toonden aan dat oude ZnO NPs veel minder cytotoxiciteit induceerden dan verse ZnO NPs in A_L cellen. De LC₁₀₀ van zowel verse ZnO NPs (90–200 nm en 20 nm) in onze huidige studie was lager dan 15 μg/mL (Fig. 3), wat consistent was met eerdere bevindingen dat de LC₁₀₀ van ZnO NPs met 19–36 nm tot NIH-3T3 of MSTO cel ongeveer 15 μg/mL is. We bevestigden dat de omgevings-transformaties van fysicochemische eigenschappen in NPs hun toxiciteit dramatisch kunnen veranderen. Het is gerapporteerd dat het sulfideringsproces van ZnO NPs hun lading, hydrofobiciteit en aggregatietoestand verandert, resulterend in de adsorptie van sulfides toestands NPs in menselijke speeksel, zweet en bronchoalveolaire lavagevloeistof. En het eiwit geadsorbeerd door ZnO NPs vormde een specifieke eiwitkroon, wat het biologische effect beïnvloedde. Fosfaten wijd aanwezig in fysiologische oplossingen (zoals speeksel) konden ZnO NPs omzetten in metastabiele ZnHPO₄ en Zn₃(PO₄)₂ binnen ongeveer 5–10 uur en toonden cytotoxiciteit aan spijsverteringsepitheelcellen. Ivask et al. bewijzen de voorkoming van complete transformatie van ZnO NPs (≤ 3 μg/mL) in het in vitro blootstellingssysteem aan humane T-lymfocyten (37 °C, celkweekmedium RPMI1640 bevattende 10% FBS gedurende 24 uur) met behulp van synchrotronstraling Röntgenabsorptie nabij-rand structuurspectroscopie (XANES). Het spectrum en de cytotoxiciteit van de transformatieproducten waren consistent met die van ZnSO₄. Onze resultaten onthulden de dosis- en tijds-afhankelijke toxiciteit van ZnCl₂ aan A_L cellen, waar de cytotoxiciteit veel lager is dan zowel verse als oude ZnO NPs (Fig. 3). De observatie verduidelijkt verder de bevinding dat de cytotoxiciteit van verse ZnO NP niet volledig toegeschreven kan worden aan de vrijgekomen Zn²⁺.

Onze eerdere studie toonde ook aan dat oude ZnO NPs een hogere potentie vertoonden in het oproepen van ROS (reactieve zuurstofsoorten), alsook een verzwakte capaciteit in het doden van cellen vergeleken met verse ZnO NPs. We redeneren dat de lagere cytotoxiciteit geïnduceerd door oude ZnO NPs meer draagbaar kan zijn in zoogdiercellen. De huidige studie van RNA-sequentie data illustreerde dat apoptotische genen opgereguleerd zijn in verse ZnO NP-behandelde cellen, waar ze veel minder beïnvloed waren in oude NP-behandelde groepen. IL1α en IL1β zijn leden van de interleukine-1 cytocinefamilie. De vrijgave van IL1α en IL1β activeert Caspase-8 gedeeltelijk afhankelijke apoptose. CD69 codeert voor een lid van de calcium-afhankelijke lectine superfamilie van type II transmembraanreceptoren. Verhoogde CD69-expressie was geassocieerd met een verhoogde expressie van de apoptose-annexine V en CD95 (Fas) marker. JUN is een AP-1 transcriptiefactor-subeenheid. Verhoogde JUN-activiteit proteolytisch splist alpha-fodrine, een substraat van het interleukine-1bêta-converterend enzym (ICE), en CED-3 familie van cysteïne-proteases, wat verder geprogrameerde celdood veroorzaakt. De verhoogde expressie van deze apoptotische genen onthulde dat verse NPs apoptose in verschillende manieren triggeren. Na de verhooging van deze apoptotische genexpressies, worden apoptose-processen uiteindelijk uitgevoerd door apoptotische eiwitten (Fig. 7). Caspase-3 is de kern-protease voor diverse apoptotische scenario's; splitsing van dit eiwit is nodig om zowel extrinsieke als intrinsieke apoptotische paden te activeren. Daarom is detectie van gespleten caspase-3 een veelvoorkomende methode voor het identificeren van apoptose geïnduceerd door een wijd verscheidenheid aan apoptotische signalen. Onze Western blotting data onthulden dat, voor zowel 20 nm als 90–200 nm ZnO NPs, subletale blootstelling het niveau van Pro-caspase-3 in alle behandelingsgroepen niet veranderde. In tegenstelling, was gespleten Caspase-3 significant verhoogd door verse NPs-behandeling, waar oude NPs weinig (zoals) effecten toonden op het niveau van gespleten caspase-3 (Fig. 6). Gecombineerd met RNA-expressieanalyse, onthulden onze resultaten duidelijk de hogere potentie van verse ZnO NPs in het induceren van celdood.

Conclusies

In de huidige studie werd de natuurlijke fysicochemische transformatie van ZnO NPs in ultrazuiver water bevestigd, en variaties in cytotoxiciteit geïnduceerd door verse & oude NPs onderzocht. We focussten op RNA-sequentie data van onze oude ZnO NP-behandelde A_L cellen en die van verse NPs uit database. We vergeleken die signaleringspaden specifiek verrijkt in oude NP-behandelde groep, wat anders is dan die van verse NP- of ZnCl₂-behandelde groepen. Onze data gaven aan dat de lagere cytotoxiciteit van oude ZnO NPs nauw verbonden is met zijn verzwakte vermogen om apoptose te induceren, terwijl de transcriptionele regulatie van de meerdere paden geactiveerd door NPs de vestiging van cellulaire homeostase in zoogdiercellen bevordert.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

NPs:

Nanopowders

ZnO:

Zinkoxide

Zn₅(CO₃)₂(OH)₆:

Hydrozinciet

Zn(OH)₂:

Zinkhydroxide

ZnCl₂:

Zinkchloride

ZnSO₄:

Zinksulfide

ZnHPO₄:

Zinkwaterstoffosfaat

Zn₃(PO₄)₂:

Zinkfosfaat

A_L cellen:

Mens-hamster hybride cellen

CHO cellen:

Chinese hamster ovary cellen

Jurkat cellen:

Perifere bloed T-lymfocten

HMDM cellen:

Humane monocyten-afgeleide macrofagen

NIH-3T3 cellen:

Muizen embryonale cellen

MSTO cellen:

Humane longkankercellen

RPMI1640:

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE:

Interleukine-1bêta-converterend enzym

CED-3:

Caenorhabditis elegans dood-gen

IL1α:

Interleukine-1alpha

IL1β:

Interleukine-1bêta

mRNA:

Messenger ribonucleïnezuur

cDNA:

Complementaire desoxyribonucleïnezuur

FBS:

Foetale boviene serum

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

XRD:

Röntgendiffractie

RT-PCR:

Real-time polymeraseketenreactie

CPI:

De Nanotechnologie Consumptieproduct Inventaris

XANES:

Synchrotronstraling Röntgenabsorptie nabij-rand structuurspectroscopie

RIPA:

Radio-immunoprecipitatie-assay

SDS-PAGE:

Polyacrylamidegelelektroforese

PVDF:

Polyvinylidene fluoride

ECL:

Versterkte chemiluminescentie

CCK-8:

Celtellingskit-8