Water-gedispergeerde PEG-Polymeer Complexen van 4-Thiazolidinon Chemotherapeutica Versterken Pro-Apoptotische Activiteit Tegen Rat Glioma C6 Cellen

Samenvatting

Doel

Onderzoeken of waterformulering van het complex van 4-thiazolidinon-derivaten met een PEG-bevattende polymere nanodrager hun pro-apoptotische actie tegen rat glioma C6 cellen versterkt.

Methoden

Mecanismen van antineoplastische effecten van 4-thiazolidinon-derivaten werden in vitro onderzocht met rat glioma C6 cellen. Celvitaliteit, celcycluspatroon en Annexin V-expressie werden geëvalueerd en DNA-schade werd geschat door DNA-komeetanalyse. Een nieuwe water-gebaseerde formulering van 4-thiazolidinon-derivaten gecomplexeerd met een polymere nanodrager werd gebruikt voor het versterken van pro-apoptotische actie tegen C6 cellen.

Resultaten

De bestudeerde 4-thiazolidinon-derivaten gebruiken apoptosemechanismen voor het doden van rat glioma C6 cellen, bevestigd door FACS-analyse van deze cellen in pre-G1-stadium, het verschijnen van Annexin V-positieve C6 cellen en een verhoogd aantal DNA-kometen van hogere klassen. Complexatie van de bestudeerde verbindingen met een PEG-bevattende polymere nanodrager verhoogde de pro-apoptotische effecten in rat glioma C6 cellen significant, gemeten door alle bovenstaande methoden.

Conclusie

Complexatie van 4-thiazolidinon-derivaten met een PEG-bevattende polymere nanodrager voorzag hen van wateroplosbaarheid en versterkte pro-apoptotische effecten in rat glioma C6 cellen.

Inleiding

Chemotherapie is de hoofdbehandelingsmodaliteit voor veel tumoren, en chemotherapeutica worden gekozen als laatste optie, met name in gevallen waar kanker al gemetastaseerd is. Echter, de ernste negatieve bijwerkingen verminderen de klinische effectiviteit van veel huidige antikankermiddelen. Daarom is er een continue en cruciale behoefte om alternatieve of synergistische antikankermiddelen te ontwikkelen met gereduceerde of minimale bijwerkingen.

De lage wateroplosbaarheid van antikankermiddelen is een veelvoorkomend en serieus probleem dat hun ontwikkeling en klinische toepassing belemmert, en veel hoog actieve en veelbelovende chemotherapeutische agenten zijn uitgesloten vanwege hun lage wateroplosbaarheid. Tensiden en co-solventen worden in hoge concentraties gebruikt om water-onoplosbare antikankeragenten op te lossen; echter, deze stoffen kunnen ook nadelige bijwerkingen produceren, wat het gebruik van veel antikankermiddelen beperkt.

Een grote uitdaging voor de ontwikkeling van farmaceutische middelen is het elimineren of tenminste verminderen van de negatieve bijwerkingen van hoog actieve middelen, met name de antitumorale agenten die algemene toxiciteit in het lichaam vertonen die hun gebruik aanzienlijk beperkt. Een effectieve manier om dit probleem op te lossen is het gebruik van een multifunctionele nanodrager van het medicament die toestaat dat de toxische antitumorale agenten binden op de plaats van hun afgifte aan doelcellen in specifieke organen of weefsels. De kleine grootte, gecontroleerde specifieke structuur, grote oppervlakte en vorm van nanopartikelen voorzien hen in diverse voordelen ten opzichte van andere materialen. Bij het gebruik van nanopartikelen is het mogelijk om efficiëntie te optimaliseren, negatieve bijwerkingen te minimaliseren en kankertherapie te verbeteren. Dus middelen die eerder faalden door hoge algemene toxiciteit kunnen nu een tweede kans krijgen voor klinisch gebruik, door hun opname in een leveringssysteem dat verbeterde biobeschikbaarheid en gecontroleerde afgifte heeft. Derdergelijke medicijn-drager complexen penetreren gemakkelijker door natuurlijke barrières zoals bloed-hersenbarrières of membranen van individuele cellen. Het grote oppervlak van nanopartikelen maakt het mogelijk voor hen om complexen te vormen met specifieke vector biomoleculen die helpen bij medicijnafgifte aan het doelorgaan, leiden tot een significante reductie of zelfs volledige eliminatie van negatieve bijwerkingen, staan een toename van de minimale effectieve dosis toe tijdens een enkele toediening van het medicijn, verbeteren de effectiviteit van de medicijnactie en geven een nieuwe stimulus voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde farmacotherapie. Bovendien kunnen nanopartikelen moleculen encapsuleren die oplosbaarheid, stabiliteit en absorptie van bepaalde geneesmiddelen verbeteren. Medicijnafgiftesystemen kunnen verlengde circulatie van een medicijn in het bloed bieden, de capaciteit voor het medicijn om te accumuleren tijdens het pathophysiologische proces, en het vermogen om het molecuul van de actieve stof effectief in de cellen en organellen van de cellen over te brengen. De nanopartikelen moeten stabiel zijn, hun chemische structuur voor een bepaalde tijdperk behouden, en tegelijkertijd in staat zijn tot bio-afbraak.

Om nieuwe antikankermiddelen te evalueren, is het belangrijk om hun cytotoxische activiteit en potentie te meten met behulp van diverse humane kankercellijnen en experimentele tumormodellen in vivo. Chemotherapie faalt vaak door een tekortkoming in het apoptoseproces dat een cruciale rol speelt in medicijn-geïnduceerde celdood opvolgend of voortvloeiend uit een verandering in tumorgenese.

Omdat veel maligne cellen apoptotische dood kunnen ontlopen, moet een rationele benadering worden gebruikt in het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe antikankermiddelen. De belangrijkste doelen voor het creëren van nieuwe antikankermiddelen zijn: (1) manieren vinden om mutaties van individuele kankercellen te overwinnen die onafhankelijke mechanismen van medicijnactie beïnvloeden; en (2) chemotherapieregimes ontwerpen die in staat zijn om onafhankelijke pathways tegelijkertijd te targeten. Een beter begrip van de relatie tussen kankergenetica en behandelingsgevoeligheid is een sleutelvraag voor het ontwikkelen van nieuwe effectieve antikankermiddelen.

In eerdere studies hebben we aangetoond dat synthetische 4-thiazolidinon-derivaten (Les-3288, Les-3833 en Les-3882) waarschijnlijk andere werkingsmechanismen gebruiken dan andere antikankeragenten om rat C6 glioma en humane U251 glioblastoma cellen in vitro te doden, in tegenstelling tot doxorubicine (Dox). Les-3288 beïnvloedde het niveau van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de behandelde cellen niet significant. Het moet benadrukt worden dat deze krachtige antitumorale agenten minder algemene toxiciteit in het lichaam van experimentele dieren vertoonden, zoals gedemonstreerd door de gemeten biochemische parameters van hun toxische actie in tumorcellen en dieren, vergeleken met die van Dox. Dus, de binding van een antitumoramedicijn met een polymere nanodrager (PNC) en toepassing van het medicijn in de vorm van een stabiel waterleveringssysteem kan de toxische effecten in de organen van dieren verminderen, vergeleken met de actie van deze stoffen in vrije vorm.

Het doel van dit werk was om apoptose-inductie in rat glioma cellen van de C6-lijn in vitro en in vivo te bestuderen door water-gebaseerde formuleringen van complexen van 4-thiazolidinon-derivaten met een PEG-bevattende PNC, en de apoptose-inductie te vergelijken met deze derivaten in vrije vorm.

Materialen en Methoden

Antikankermiddelen

De heterocyclische 4-thiazolidinon-derivaten (verbindingen Les-3288 en Les-3833, Fig. 1) werden gesynthetiseerd aan de Afdeling Farmaceutische, Organische en Bio-organische Chemie van de Danylo Halytsky Lviv Nationale Medische Universiteit, Oekraïne, zoals eerder beschreven.

Polymere Nanodrager

De PNC voor medicijnafgifte werd gesynthetiseerd aan de Afdeling Organische Chemie van de Lviv Polytechnische Nationale Universiteit, Oekraïne, met een eerder beschreven methodologie. Synthese van poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG werd uitgevoerd via opeenvolgende stadia als volgt. Poly(VEP-co-GMA) werd gesynthetiseerd door radicale copolymerisatie van 5-tert-butylperoxy-5-methyl-l-hexen-3-yn (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (peroxide monomeer gesynthetiseerd door de beschreven methode) en glycidylmethacrylaat (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich, VS) in ethylaacetaat (7,9 mL) (Merck, Darmstadt, Duitsland) met azoisobutyronitrile (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Duitsland) als radicale initiator. De polymerisatie werd uitgevoerd bij 343 K tot maximaal conversie van 65% bereikt was. Poly(VEP-co-GMA) werd gebruikt als ruggengraat voor de heching van zijde PEG-ketens via additiereacties van poly(ethyleenglycol) methylether (mPEG) met zijde epoxidegroepen. Boortrifluoride-etheraat (0,027 mL, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) werd toegevoegd aan de oplossing van copolymeer (1,0 g) in dioxaan (20 mL; Merck, Darmstadt, Duitsland) bij 313 K en 3 uur geroerd. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, VS) werd opgelost in dioxaan (15 mL) en de oplossing werd gemengd met de oplossing van ruggengraatpolymer en 6 uur geroerd bij 313 K. Ongereageerde mPEG werd verwijderd met dialysezakken met poriegrootte van molecuulgewicht afsnijpunt (MWCO) van 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, VS). Het resulterende kam-achtige poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG werd gedroogd bij kamertemperatuur onder vacuum tot constant gewicht. De structuren en enkele kenmerken van de PNC worden gepresenteerd in Fig. 2 en waren eerder beschreven.

Om de water-gebaseerde PNC-oplossingen te bereiden, werd 0,09 g PNC opgelost in 0,9 mL DMSO. Deze PNC-oplossing werd toegevoegd aan 8,0 mL 0,9% NaCl-oplossing. Vervolgens werd de oplossing 0,5 uur geroerd en 10 s geultrasondeerd. Waterdispersies van de complexen werden verkregen door de DMSO-oplossing van 4-thiazolidinonen en PNC in het water te druppelen in de volgende volgorde: 0,045 g PNC werd opgelost in 0,15 mL DMSO (Sigma-Aldrich, VS), en 0,0015 g Les-3288 (of Les-3833) werd opgelost in 0,10 mL DMSO. De oplossingen van PNC en 4-thiazolidinonen werden gemengd en toegevoegd aan 4,25 mL 1% waterige NaCl-oplossing en 10 s geultrasondeerd.

Deze oppervlakte-actieve PNC bevat de hydrofiele PEG-ketens gegrifte aan de hydrofobe ruggengraat (Fig. 2a). In waterige oplossingen vormt de amphifiele PNC micel-achtige structuren die water-onoplosbare verbindingen (bijv. geneesmiddelen) kunnen oplossen of deze verbindingen kunnen geadsorbeerd worden op het oppervlak van de nanopartikelen, wat hun biocompatibiliteit verhoogt. De techniek die ontwikkeld is voor het verkrijgen van hoog stabiele waterdispersies van de 4-thiazolidinon-gebaseerde chemotherapeutica bestaat uit de nucleatie van nanoschaal medicijndeeltjes die optreedt wanneer de gedilueerde oplossingen in DMSO overgebracht worden in de neerslagsalzoplossing die polymere surfactant PNC bevat dat polymere coating voor het nanopartikelaoppervlak biedt. Als resultaat, door aggregatie en sedimentatie, werd het complex gestabiliseerd en de dispersie voorkomen. Bovendien zijn de nanoschaal complexen van 4-thiazolidinon-derivaten beschermd tegen mogelijke interacties met de omringende biologische micro-omgeving. Deze bescherming laat ze langer in het lichaam blijven zonder stabiliteitsverlies en accumuleren in het doelweefsel of orgaan zonder negatieve bijwerkingen te veroorzaken. Dus dergelijke modificatie biedt verbeterde aggregatie- en sedimentatiestabiliteit van waterdispersies van de antikankerstoffen nanopartikelen.

De groottes van de polymere micellen van PNC en van de complexen van PNC met de heterocyclische 4-thiazolidinonen werden gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Duitsland) en DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, VS) en door fotoncorrelatiespectra met niet-invasieve back scatter (NIBS) technologie bij 25°C. De monsters voor DLS-metingen werden bereid zoals hierboven beschreven, en indien nodig, verdund met bi-gedistilleerd water, pH 6,5-7,0. Drie-vijf metingen werden uitgevoerd voor elk monster (elke meting bestond uit 5 cycli en het bereik tussen metingen was 5 min). Figuur 3 toont de groottedistributie van micellaire structuren van de PNC en de nanopartikelen van de complexen van PNC met de heterocyclische 4-thiazolidinonen (Les-3833 en Les-3288) geanalyseerd door DLS. De grootte en morfologie van PNC-micellen alsook van PNC-gecoate 4-thiazolidinon-nanopartikelen werden bestudeerd met een transmissie-elektronenmicroscoop JEM-200A (JEOL, Japan) bij een versnellingsspanning van 200 kV. De monsters werden bereid zoals hierboven beschreven, en indien nodig, verdund met bi-gedistilleerd water. Monsters werden bereid door de geteste oplossing op een substraat te sproeien met behulp van de ultrasonische dispersant UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Oekraïne), wat een uniforme coating op het substraat vergemakkelijkt. Een dunne amorfe koolstoffilm op een koperen grid werd als substraat gebruikt. De groottes en morfologie van PNC-micellen en de complexen met de heterocyclische 4-thiazolidinonen (Les-3288 en Les-3833) bestudeerd door de methoden van DLS en TEM worden gepresenteerd in Fig. 3.

De DLS- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) studies toonden aan dat de groottes van PNC-micellen 50 ± 25 nm waren en de nanopartikelen gevormd door complexen van PNC met de heterocyclische 4-thiazolidinonen Les-3833 en Les-3288 140 ± 25 nm en 155 ± 30 nm respectievelijk waren. De dispersies van complexen van de PNC met 4-thiazolidinon-derivaten zijn hoog stabiel en beschermd tegen aggregatie en sedimentatie door de geadsorbeerde PNC-schil op het thiazolidinon-nanopartikelaoppervlak. Zoals getoond in Fig. 4, zijn veranderingen in groottes van de nanopartikelen gedispergeerd in het watersysteem verwaarloosbaar bij meervoudige verdunningen met water, alsook na 6 maanden veroudering van de watersystemen van complexen van PNC met 4-thiazolidinonen.

Celkweek

Rat glioma cellen van de C6-lijn werden verkregen van de Celkweekcollectie aan het Instituut voor Moleculaire Biologie en Genetica, Nationale Academie van Wetenschappen van Oekraïne (Kiev, Oekraïne). Cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, Sigma, VS) aangevuld met 10% fetale kalvesserum (Sigma, VS). Cellen werden gegroeid in een CO₂-incubator bij 37°C, 5% CO₂ en 95% vochtigheid. De heraanplanting van cellen werd uitgevoerd met een verhouding van 1:5 één keer in de 2-3 dagen.

Evaluatie van Cytotoxische Actie van Bestudeerde Stoffen

Cellen wurden gezaaid in 24-putplaten met een concentratie van 100.000 cellen/mL in één put. De stoffen onder studie werden toegevoegd bij 0,1, 0,5 en 1,0 µM concentraties na een 24-uurs adaptatieperiode die startte na celsaeien. Celteellen werden regelmatig geteld in de hematocytometrische telkam met Trypan Blau kleurstof (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, VS) bij 0,01% eindconcentratie, 2 min na toevoeging aan de celsuspensie. Dode cellen namen deze kleurstof op door schade aan hun plasma-membraan.

Stroomcytometrie

Voor het bestuderen van celcyclus en apoptose, werden C6 cellen behandeld met Les-3288, Les-3833 en hun complexen met PNC, alsook met PNC in vrije vorm, gewassen met fosfaatgebufferde saline (PBS, pH 7,4), gecentreveerugd door centrifugatie bij 1000 toer/min voor 5 min bij 4°C en hersuspenseerd in koud PBS (2 miljoen cellen per 1 mL PBS). Vervolgens werden cellen gefixeerd door toevoeging van aliquoten van 4 mL absolute ethanol afgekoeld tot −20°C met zacht mengen. De gefixeerde monsters werden bij −20°C bewaard tot gebruik (niet langer dan 1 week). Voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) analyse, werden celmonsters gecentreveerugd bij 1000 toer/min voor 5 min bij 4°C, het supernatant verwijderd en het celpellet hersuspenseerd in 1 mL PBS. Honderd microliter DNase-vrije RNase (Sigma, VS) werd aan die suspensie toegevoegd, en monsters werden geïnculeerd bij 37 °C voor 30 min. Vervolgens werd elk monster aangevuld met 100 μl propidiumiodide (PI) (Sigma, VS, 1 mg/mL), en geïnculeerd bij kamertemperatuur voor 10 min. Tenslotte werden de monsters overgebracht naar plastic Falcon-buizen, en de celsuspensie werd gemonitord met een FACSCalibur stroomcytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA, VS) en Summit v3.1 software (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, VS) voor het meten van de parameters van celcyclus en apoptose.

Meting van de Annexin V-positieve (apoptotische) cellen werd uitgevoerd met FACS-analyse. Rat glioma C6 cellen werden behandeld met 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL en 1 mg/mL concentraties van PNC, Les-3288, Les-3833 en hun polymere conjugaten zoals aangegeven onder de figuren. Aan het einde van het experiment werden de cellen losgemaakt van de bodem van de schaal met Trypsine-EDTA-oplossing, tweemaal gewassen met PBS, en gekleurd met Annexin V-FITC met behulp van Apoptose Detectie Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, VS), volgens de instructies van de fabrikant. Gewassen cellen werden 15 min geïnculeerd in de Annexin V-bindingsbuffer (BD Pharmingen), bevattende 1/50 volume FITC-geconjugeerde Annexin V-oplossing. Vervolgens werden de monsters tweemaal verdund met een geschikt volume van de Annexin V-bindingsbuffer en onmiddellijk gemeten op de FL1/FL2 (FITC-PI) kanaal van een stroomcytometer (Becton Dickinson, VS). De Annexin V-enkelvoudig positieve cellen werden geclassificeerd als apoptotisch.

DNA Komeetanalyse

De DNA-komeetanalyse werd uitgevoerd onder alkalische condities. Tienduizend cellen werden gemengd in 75 μl laag-smeltpunt agarose (0,5%) per monster. Na mengen werd het monster op een objectglas gepipetteerd dat vooraf bedekt was met 1,5% normaal smeltpunt agarose. De monsters werden geïnculeerd bij 4 °C gedurende 18 uur in lysesoplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Om ontwinding van het DNA en de expressie van alkalisch-labiele schade toe te staan, werden objectglazen geïnculeerd in een alkalische oplossing bij kamertemperatuur voor 20 min (uitgevoerd in het donker). Voor electroforese (~74 V/cm voor 30 min) werden objectglazen overgebracht naar een horizontale kamer en 1x electroforesebuffer (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) toegevoegd. De objectglazen werden vastgezet in ijs-koud, 100% methanol en gedroogd. Objectglazen werden gekleurd met 80 μL 1× ethidiumbromide (EtBr) voor 5 min en vervolgens in gekeld gedistilleerd water gedoopt om overmatige kleurstof te verwijderen. De DNA-kometen werden gevisualiseerd met een microscoop (Carl Zeiss, Duitsland), en de beelden werden geanalyseerd met de software 'CASP' (Casplab-1.2.3b2 software, CASPlab, Wroclaw, Polen). Honderd kometen per monster geteld. DNA-schade werd gecategoriseerd in vijf niveaus van genotoxiciteit volgens de komeetstaartgrootte: 0 (0-5% schade), 1 (5-25% schade), 2 (25-45% schade), 3 (45-70% schade) en 4 (meer dan 70% schade). De schade-index (DI) werd berekend, zoals eerder beschreven.

DNA-intercalatieanalyse met Methyl Groen Kleurstof

De verbindingen Les-3288 en Les-3833 werden onderzocht op de capaciteit om in het DNA-molecuul te intercaleren door middel van methyl groen assay. Salmzaad DNA (10 mg/mL) werd 1 uur geïnculeerd bij 37 °C met 15 μL methyl groen oplossing (1 mg/mL in H₂O). De verbindingen werden toegevoegd bij 1 μg/mL en geïnculeerd bij 37 °C in het donker voor 2 uur. De totale eindvolume van de monsters was 1 mL. Absorptie van methyl groen werd gemeten bij 630 nm, na monsterincubatie voor 2 uur bij 37 °C, met een BioTek 76 883 multi-kanaal microfotometer (BioTek, Winooski, VT, VS). EtBr werd gebruikt als positieve controle.

Data-analyse en Statistiek

Alle experimenten werden driemaal herhaald met drie parallelle in elke variant. Variantie-analyse (ANOVA) werd gebruikt voor vergelijking van groepen. Data van de verdeling van C6 rat glioma cellen in verschillende fasen van de celcyclus werden geanalyseerd door eenvoudige ANOVA, gevolgd door Tukey's post hoc meervoudige vergelijkingstest. Alle data worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Een p-waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Cytotoxisch Effect (Trypan Blau Uitsluitingstest) van 4-Thiazolidinon-derivaten in Vrije Vorm en in Complex met de Polymere Nanodrager

De resultaten van de Trypan blau uitsluitingstest toonden aan dat de water-gebaseerde vormen van Les-3288 en Les-3833 complexen met de PNC versterkte toxiciteit tegen glioma C6 cellen hadden (24 u en 48 u behandeling) vergeleken met de cytotoxiciteit waargenomen bij gebruik van de vrije vorm van deze verbindingen (Fig. 5 en 6). Het hoogste cytotoxiciteitseffect werd waargenomen bij 0,1 en 0,5 µM doses van Les-3288 en Les-3833 verbindingen in hun complexen met de PNC, terwijl bij de hoogste dosis (1,0 µM) van deze verbindingen een versterking van complexatie met de PNC alleen gedetecteerd werd in het geval van Les-3288 voor 24 u (Fig. 5 en 6).

Complexatie van Les-3833 en Les-3288 Verbindingen met Polymere Nanodrager Versterkt Hun Pro-Apoptotische Activiteit In Vitro Tegen Rat Glioma C6 Cellen

Twee alternatieve benaderingen werden gebruikt om de modulerende invloed van de PNC op het cytotoxische potentieel van de geselecteerde 4-thiazolidinon-derivaten te beoordelen. Eerst werd celcyclusanalyse uitgevoerd om de impact van de medicijn-PNC complexen op celcycling te onderzoeken. Bovendien werd Annexin V/PI dubbele kleuring gebruikt om het exacte type celdood geïnduceerd door deze nanocomposieten te onderscheiden.

Les-3288 en Les-3833 verbindingen bij lage doses (0,1 μg/mL en 0,5 μg/mL) produceerden geen zichtbaar effect op noch celcyclusvoortgang noch inductie van apoptose, zoals getoond in Fig. 7 en Tabel 1. Echter, complexatie van beide verbindingen met de PNC verhoogde het aantal cellen in pre-G₁-fase significant (4-voudig voor Les-3288 en 6-voudig voor Les-3833), wat een grote boost van hun pro-apoptotische potentieel aangeeft. Het moet benadrukt worden dat PNC in vrije vorm geen impact had op celcycling of apoptose-inductie; dus de waargenomen verschijning van een grote populatie pre-G1 cellen onder behandeling met de thiazolidinon-nanodrager complexen kan niet verklaard worden door een simpel synergistisch effect van de PNC en de experimentele geneesmiddelen.

Om te bevestigen dat de waargenomen sub-G1 piek bestaat uit apoptotische cellen, werden de resultaten van de Annexin V/PI kleuringsanalyse geanalyseerd. We observeerden geen significante externalisatie van fosfatidylserine (hoofdmaker van vroege apoptose, gedetecteerd door FITC-geconjugeerde Annexin V) tijdens C6 glioma behandeling met lage (0,1 en 0,5 μg/mL) en hoge doses van Les-3288 (1,0 μg/mL), wat suggereert dat deze verbinding een zwakke inducer van apoptose is. In plaats daarvan vonden we een toename in de necrotische celpopulatie (van 1,2% in controle tot 11,25% voor Les-3288, 1,0 μg/mL), wat kan wijzen op het feit dat Les-3288 tenminste deels necrotische celdood veroorzaakt. Echter, complexatie van Les-3288 met de PNC veranderde de werkingswijze van dit medicijn volledig. Er was een massale toename in het aantal vroege apoptotische (Annexin V(+)/PI(−)) en late apoptotische cellen (Annexin V(+)/PI(+)), terwijl de algehele hoeveelheid zuiver necrotische cellen op het niveau van controle (onbehandelde) cellen bleef (Fig. 8a). Dus, binding van Les-3288 met de PNC versterkt niet alleen sterk zijn pro-apoptotische activiteit tegen glioma cellen, maar vermindert ook zijn potentieel pro-necrotisch celdoodmechanisme. Deze bevindingen kunnen van cruciaal belang zijn voor de klinische praktijk omdat pro-necrotische geneesmiddelen niet aanbevolen worden voor gebruik door massale inductie van inflammatie wat ongemakkelijk is voor patiënten.

Verassend observeerden we niet hetzelfde effect voor het Les-3833+PNC complex. In feite was de pro-apoptotische activiteit van het Les-3833+PNC complex lager vergeleken met Les-3288 in vrije vorm bij alle geteste concentraties (Fig. 8b). Een dergelijke drastische verschil tussen beide verbindingen kan worden verklaard door specificiteit van hun chemische structuur, en we speculeren dat in het geval van Les-3833, de structuur van het polymeer geoptimaliseerd moet worden om betere resultaten te bereiken.

Komeetanalyse van DNA-schade in Rat Glioma C6 Cellen Veroorzaakt door 4-Thiazolidinon-derivaten in Vrije Vorm en Gecomplexeerd met de PNC

Alkalische komeetanalyse stelt de detectie van enkelstreng DNA-breuken in alkalisch-labiele DNA-plaatsen in staat. De verkregen resultaten werden geschat met de gemiddelde waarde van de Olive-staartmoment (OTM). Onze data toonden aan dat behandeling van C6 rat glioma cellen met Les-3288, Les-3833 en PNC (concentratie 0,5 μg/mL) gedurende 3 u (Fig. 9 en 10) geen significante DNA-schade veroorzaakte (OTM = 0,7299 ± 0,1276, OTM = 1,466 ± 0,3086, OTM = 0,5846 ± 0,1078 respectievelijk), vergeleken met onbehandelde cellen in de controle (OTM = 0,4541 ± 0,07273). Echter, celbehandeling met het Les-3833 + PNC complex (OTM = 2,3880 ± 0,2212) veroorzaakte meer significante DNA-schade dan celbehandeling met de vrije vorm van Les-3833. Een dergelijke toename in schade werd niet waargenomen voor de actie van het Les-3288+PNC complex (Fig. 9 en 10).

Een toename van celincubatietijd tot 6 u (Fig. 11 en 12) veroorzaakte grotere DNA-schade in alle experimentele groepen: Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC en Dox (positieve controle). Echter, de effecten van de Les-3288+PNC en Les-3833+PNC complexen leken lager te zijn dan de effecten van de vrije vormen van Les-3288 en Les-3833. Het moet opgemerkt worden dat het DNA-schadelijke effect van de complexen van beide derivaten met de PNC minder was dan zulk effect van deze derivaten in vrije vorm.

De resultaten werden geëvalueerd met de gemiddelde waarde van de TailDNA%. De verkregen data tonen aan dat incubatie van C6 rat glioblastoma cellen met stof Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833 en PNC (alle bij concentratie van 0,5 μg/mL) gedurende 3 u (Fig. 13) niet leidt tot significante DNA-schade (TailDNA% van 4,157 ± 0,682; TailDNA% van 3,530 ± 1,012, 8,807 ± 0,878; 3,298 ± 0,514 respectievelijk) vergeleken met controle (TailDNA% = 3,638 ± 0,406), maar celbehandeling met het Les-3833+PNC complex (TailDNA% = 19,53 ± 1,48) veroorzaakt meer significante DNA-schade dan de vrije vorm van Les-3833. Een toename van de incubatietijd tot 6 u (Fig. 14) leidt in alle gevallen tot grotere schade aan het DNA. Opnieuw was het niveau van TailDNA% gedetecteerd uit de actie van complexen van beide derivaten met de PNC lager dan het niveau van die indicator voor de actie van deze derivaten in vrije vorm.

We hebben ook een alternatief, vijf-categorie classificatiesysteem gebruikt om DNA-migratie te classificeren en de DI berekend. Tabel 2 vat de percentages van rat glioma C6 cellen voor elk niveau van genotoxiciteit gedurende 3 u behandeling samen. In de controle (onbehandelde cellen) werden hogere percentages cellen in niveaus 0 (81,3%) en 1 (18,6%) gedetecteerd vergeleken met deze niveaus in Les-3288 en PNC-behandelde cellen. Complexatie van Les-3288 met de PNC leidde niet tot een grote verandering in het verdelingspatroon van de DNA-kometen. In tegenstelling, Les-3833-behandelde cellen toonden een lager percentage cellen in 0-niveau (38,6%) en een hoger percentage cellen in niveau 1 (60,0%), terwijl Les-3833 + PNC-behandelde cellen een significant lager percentage cellen in niveau 0 (8,0%) en veel hogere percentages cellen met niveaus 1 (76,0%), 2 (13,3%) en 3 (2,6%) demonstreerden. De integratieve indicator van DNA-schade (DI) in het geval van toepassing van zowel Les-3288 als zijn complex met de PNC verschilde niet significant van die voor controle of gebruik van vrije PNC, terwijl de DI van het gebruik van zowel Les-3833 als zijn complex met de PNC zelfs hoger was dan de DI van het gebruik van Dox.

Tijdens dit tijdsinterval demonstreerden Les-3833 + PNC-behandelde cellen een hoger percentage cellen met niveau 4 (5,3%) DNA-schade dan cellen behandeld met Les-3288 en de andere experimentele verbindingen, maar de percentages cellen in niveaus 2 en 3 waren lager (16,0% en 12,0% respectievelijk) dan die van behandeling met andere verbindingen (Tabel 2). Tabel 3 vat de percentages van rat glioma C6 cellen met DNA-schade na 6 u behandeling samen. In het algemeen werd een neiging gedetecteerd voor het verschijnen van DNA-kometen van hogere klassen wanneer complexen van Les-3833 en Les-3288 gebruikt werden, vergeleken met een spectrum van DNA-komeetklassen geïnduceerd door vrije vormen van deze agenten (Tabel 3). Echter, de integratieve indicator van DNA-schade (DI) berekend voor de actie van complexen van Les-3833 en Les-3288 werd lager gevonden dan zulk indicator voor de actie van vrije vormen van deze agenten. Een mogelijke verklaring zou een zeer hoog DI-niveau bij 6 u actie van bestudeerde agenten kunnen zijn dat zelfs hoger is dan zulk indicator gevonden voor de actie van Dox (Tabel 3). Dus we observeerden tijdsafhankelijkheid van DNA-schade veroorzaakt door complexen van Les-3833 en Les-3288: bij 3 u behandeling was er een toename van de DI in het geval van actie van Les-3833 complexen, vergeleken met de actie van de vrije vorm van Les-3833; echter, bij 6 u behandeling was er een afname in DNA-schade voor de actie van complexen van zowel Les-3833 als Les-3288, vergeleken met zulk schade waargenomen voor de actie van de vrije vormen van deze agenten. Er was geen significante tijdsafhankelijkheid voor de actie van de PNC, terwijl een significante tijdsafhankelijke (van 3 tot 6 u) toename in de DI werd waargenomen voor de actie van Dox (van 41,2 + 0,40 tot 185,2 + 0,23).

DNA-intercalatie door 4-Thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833

Les-3288 en Les-3833 verbindingen toonden een zekere capaciteit voor het intercaleren van DNA-moleculen met ongeveer 15% en 10% respectievelijk vervanging van methyl groen kleurstof. EtBr, een bekende DNA-intercalerende agent, werd gebruikt als positieve controle en toonde de methyl groen kleurstof veel efficiënter te vervangen (70%) (Fig. 15). Dus, Les-3288 en Les-3833 zijn niet in staat om effectief te intercaleren tussen twee complementaire basenparen in dubbelstrengs DNA.

Discussie

Er zijn twee grote problemen die de toename van de efficiëntie van behandeling voor kankerpatiënten belemmeren: (1) niet-adresseerde acties van veel antikankermiddelen die leiden tot algemene toxiciteit en ernstige negatieve bijwerkingen door schade aan normale weefsels en organen; (2) snelle (6-12 maanden) ontwikkeling van resistentie van tumorcellen tegen toegepaste antikankermiddelen die leidt tot verlies van effectiviteit van medicijnactie. Daarnaast is er een derde, technisch probleem van slechte wateroplosbaarheid van veel antikankermiddelen. Echter, het binden van deze geneesmiddelen met specifieke dragers van nanoschaal grootte kan helpen het oplosbaarheidsprobleem op te lossen.

In deze studie hebben we het eerste en derde van de bovengenoemde problemen aangepakt door (a) het selecteren van nieuwe synthetische stoffen (4-thiazolidinon-derivaten: Les-3288 en Les-3833) die zowel hoge antikankeractiviteit als minder algemene toxiciteit in tumor-dragende dieren bezitten en (b) het toepassen van een nieuw medicijnafgiftplatform dat stabiele water-gebaseerde vormen van de complexen van de water-onoplosbare 4-thiazolidinon-derivaten met een PEG-gepolymeeriseerde polymer biedt.

De 4-thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833 – zijn heterocyclische verbindingen met molecuulmassa van 400-600 Da. Deze en andere gerelateerde derivaten werden gesynthetiseerd aan de Lviv Nationale Medische Universiteit (Oekraïne), en de meeste van hen zijn getest onder het Developmental Therapeutic Program aan het National Cancer Institute in Bethesda, MA, (VS). Op basis van deze evaluaties van hun antineoplastische activiteit werden de meest veelbelovende stoffen geselecteerd voor verdere studie van de mechanismen van hun cytotoxische actie en antikankereffecten. Les-3833 toonde hoge toxiciteit tegen B16F10, WM793 en SK-Mel-28 melanoomcellen, en tegen humane long A549, borst MCF-7, dikke darm HCT116 en ovarium SKOV3 kankercellen en leukemiecellijnen (L1210, Jurkat, HL-60 lijnen). Les-3288 en Les-3833 toonden hoge toxiciteit tegen zoogdier glioma cellen (C6, U251, U373 lijnen).

Eerder vonden we dat Les-3288 en Les-3833 de meest toxische waren onder de andere bestudeerde 4-thiazolidinon-derivaten tegen rat glioma C6 cellen en humane glioblastoma U251 cellen, hoewel hun toepassing voor celbehandeling zeer gecompliceerd was door hun absolute onoplosbaarheid in water. Alleen het gebruik van DMSO met additionele verwarming was effectief voor het bereiden van een oplosbare vorm van de derivaten (zie de "Materialen en Methoden" sectie). Dus was het redelijk om te zoeken naar een manier om de afgifte van deze derivaten aan doelcellen te verbeteren, en we gebruikten een synthetische PNC om deze taak te volbrengen. De complexatie van de bestudeerde derivaten van 4-thiazolidinon met de toegepaste PNC versterkte ook de effectiviteit van hun antineoplastische actie. De mechanismen van de pro-apoptotische actie van deze verbindingen werden gedemonstreerd met western blot en FACS-analyses. Het moet opgemerkt worden dat in gezonde experimentele dieren, Les-3288 en Les-3833 veel minder negatieve bijwerkingen produceerden zoals cardiotoxiciteit, hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit dan de breed gebruikte antikanker chemotherapeutische agent Dox.

In een eerdere studie toonden we aan dat Les-3288 geen ROS-productie induceerde tijdens zijn pro-apoptotische actie in vitro en effecten in experimentele laboratoriumdieren, terwijl de actie van Les-3833 tot dergelijke productie leidde; echter, het was minder dan dat van Dox. ROS worden beschouwd als de hoofdeffectoren van negatieve bijwerkingen van antikankermiddelen, met name Dox. Dus, de Les-3288 en Les-3833 verbindingen zouden perspectiefvolle antikankermiddelen kunnen zijn omdat ze antitumorale activiteit bezitten, maar geen algemene toxiciteit tonen op het niveau kenmerkend voor effectieve antikankergeneesmiddelen zoals Dox.

Een grote belemmering voor het promoten van Les-3288 en Les-3833 als antikankermiddelen is hun slechte wateroplosbaarheid. Dit probleem bestaat ook voor andere antikankergeneesmiddelen, zoals taxolen. Voor paclitaxel werd dit probleem opgelost door een speciaal olie te gebruiken voor het bereiden van de medicamenteuze formulering. Echter, specifieke leveringsplatforms worden beschouwd als veelbelovender voor het creëren van "slimme" geneesmiddelen die effectieve actie in het organisme bezitten. Specifieke functionele polymere surfactanten met blok-, kam-achtige en blok/vertakte architecturen, inclusief PEG-bevattende, alsook afgeleide water-gebaseerde vormen zijn ontwikkeld en voorgesteld voor toepassing als dragers voor de afgifte van Dox en het metaal chemotherapeutische middel KP-1019 aan de Afdeling Organische Chemie van de Lviv Polytechnische Nationale Universiteit.

Omdat de 4-thiazolidinon-derivaten water-onoplosbare verbindingen zijn, werd DMSO gebruikt om hun water-oplosbare vormen te bereiden. Om de negatieve gevolgen van het gebruik van een giftige oplosmiddel zoals DMSO te vermijden, complexeerden we deze derivaten met de bovengenoemde PNC. Hoog gedispergeerde en stabiele nanoschaal waterdispersies van deze stoffen werden verkregen en toegepast voor behandeling van rat glioma C6 cellen.

Het gebruik van complexen van 4-thiazolidinon-derivaten met de PNC leidde tot verminderde algemene toxiciteit van deze verbindingen in experimentele dieren. Eerder vonden we dat wanneer experimentele antitumorale agenten (Les-3288, Les-3833, Les-3882) in een complex met een synthetische polymere drager toegepast werden, hun actie vergezeld werd door veel kleinere veranderingen in de biochemische parameters in bloedserum die kenmerkend zijn voor cardiotoxiciteit, hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit, vergeleken met die voor Dox. Dus, complexatie van deze antitumorale agenten met de PNC en hun toepassing in de vorm van water-oplosbare stabiele leveringssystemen vermindert hun toxische effecten in experimentele dieren, vergeleken met de actie van deze stoffen in vrije vorm. Verschillende systemen voor paclitaxel-afgifte zijn voorgesteld inclusief polymere nanopartikelen, lipide-gebaseerde formuleringen, polymerconjugaten, anorganische nanopartikelen, koolstofnanobuisjes, nanokristallen en cyclodextrine nanopartikelen.

Dus, complexatie van Les-3288 met de PNC verhoogde de pro-apoptotische activiteit van dit experimentele medicijn significant, waardoor we het kunnen vooruitbrengen naar preklinische studies op diertumormodellen. Complexatie van Les-3833 met hetzelfde type nanodrager was minder efficiënt, en dus een ander type polymeer moet worden gebruikt.

De ontwikkelde water-gebaseerde vormen van de complexen, alsook de vrije derivaten, werden toegepast voor behandeling van rat glioma C6 cellen. Het werd gevonden dat deze water-gebaseerde vormen van de complexen van de PNC met de 4-thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833 – de pro-apoptotische actie van deze verbindingen versterkten. In een andere studie toonden we aan dat de inductie van apoptose door Les-3288 niet vergezeld werd door ROS-inductie, in tegenstelling tot de actie van Dox en Les-3833. Dus, hoge antitumorale activiteit van Les-3288 samen met zijn lage algemene toxiciteit bij het targeten van de maligniteit in NK/Ly lymfoom-dragende muizen suggereren groot potentieel voor dit experimentele antikankermiddel. De gepresenteerde data voorspellen ook de potentiële bruikbaarheid van Les-3288 en Les-3833 verbindingen gecomplexeerd met de PNC voor glioma-behandeling.

Celdeling, differentiatie en dood zijn de voornaamste fysiologische processen die weefselhomeostase in multicellulaire organismen regelen. Een storing van genoomintegriteit en verstoorde regulatie van celdood kunnen beide leiden tot onbeheerste celgroei. Een gecompromitteerd celdoodproces kan ook genoomstabiliteit bevorderen. Het wordt duidelijk dat dysregulatie van de celcyclus en celdoodprocessen een cruciale rol speelt in de ontwikkeling van grote aandoeningen zoals kanker, hart- en vaatziekten, infectie, inflammatie en neurodegeneratieve ziekten.

We hebben gevonden dat sommige van de 4-thiazolidinon-derivaten, namelijk Les-3288 en Les-3833, zelfs effectiever waren dan Dox in de inductie van apoptose in rat C6 glioma en humane U251 glioblastoma cellen in vitro. Het moet opgemerkt worden dat hersentumoren behoren tot maligniteiten die het meest resistent zijn tegen toegepaste chemotherapieën, en overlevingspercentages in patiënten met deze tumoren zijn extreem laag.

Het is getoond dat de complexatie met deze PNC de pro-apoptotische actie van 4-thiazolidinon-derivaten (Les-3288 en Les-3833) versterkte. In een andere studie toonden we aan dat de inductie van apoptose door Les-3288 niet vergezeld werd door ROS-inductie, in tegenstelling tot de actie van Dox en deels in tegenstelling tot die van Les-3833. Deze data kunnen de lagere algemene toxiciteit van Les-3288 vergeleken met die van Dox verklaren.

De resultaten van FACS-analyse zijn in overeenstemming met de suggestie dat een versterking van de pro-apoptotische actie van de bestudeerde 4-thiazolidinon-derivaten te wijten is aan hun complexatie met een nieuwe PNC. Zulke complexatie van Les-3288 en Les-3833 verhoogde de verhouding van pre-G1 cellen in de populatie van behandelde rat glioma C6 cellen, verlaagde de verhouding van G1 cellen en verhoogde de actie van G2/M cellen. Deze data suggereren een versterking van zowel cytotoxische actie (apoptose) als cytostatische actie (blokkade in G2/M-fase van celcyclus) van de bestudeerde derivaten gecomplexeerd met de PNC. In het algemeen werd het apoptosemechanisme van glioma-celdood door het Les-3288 + PNC complex en het Les-3833 + PNC complex gedemonstreerd door de resultaten van FACS-analyse van de verschijning van Annexin V enkelvoudig-positieve rat glioma C6 cellen.

Betrokkenheid van de apoptosemechanismen in de actie van de bestudeerde 4-thiazolidinon-derivaten werd ook bevestigd door de resultaten van de DNA-komeetanalyse. Het werd gevonden dat de complexatie van Les-3833 met de PNC leidde tot een afname (vergeleken met vrije Les-3833) in de verhouding van rat glioma C6 cellen in "0" DNA-kometen en gelijktijdige toename in de verhouding van "1," "2," en "3" kometen (3-u behandeling van cellen). Bij 6 u behandeling door het Les-3833+PNC complex was er een grote toename (vergeleken met vrije Les-3833) in de verhouding van "1" kometen, een toename in de verhouding van cellen met de meest uitgesproken DNA-schade ("4" kometen), en een afname in de verhoudingen van "2" en "3" kometen. Het moet opgemerkt worden dat de DNA-schadelijke effecten van Les-3288 en Les-3833 gemeten bij 6 u hoger waren dan zulk effecten van complexen van deze derivaten met de PNC (zie Tabel 3). Een mogelijke verklaring hier kan een zeer hoog niveau van de DI bij 6 u actie van bestudeerde agenten zijn dat zelfs hoger is dan het niveau van die indicator gevonden voor de actie van Dox (Tabel 3). Er was geen tijdsafhankelijkheid in de actie van de PNC, terwijl een significante tijdsafhankelijke (van 3 tot 6 u) toename (van 41,2 + 0,40 tot 185,2 + 0,23) in de DI werd gedetecteerd voor de actie van Dox.

Dus, een complexatie van 4-thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833 – met een PNC versterkte het cytotoxische effect van deze verbindingen tegen rat glioma C6 cellen, en dat effect werd bereikt via de apoptosemechanismen inclusief DNA-schade waargenomen als DNA-kometen in de geëlectroforeerde cellen.

We gebruikten de DNA-intercalatietest om de directe targeting van DNA door de 4-thiazolidinon-derivaten te onderzoeken en onthulden slechts zwakke vervanging van methyl groen kleurstof (15% en 10% vervanging voor Les-3288 en Les-3833 respectievelijk) die geïntercaleerd in het DNA van salmzaad, vergeleken met de vervanging door EtBr, gebruikt als positieve controle (70%).

Dus, het uitvoeren van de cytotoxiciteitsexperimenten in vitro met de 4-thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833 – was comfortabeler door het gebruik van de water-gebaseerde vormen van de 4-thiazolidinon-derivaten – Les-3288 en Les-3833 – gecomplexeerd met de nieuwe PNC. Bovendien hebben we aangetoond dat de nieuwe synthetische 4-thiazolidinon-derivaten (Les-3833 en Les-3288) behandelingseffecten in vivo bezitten tegen NK/Ly lymfoom gegrifteerd aan BALB/C muizen, en die effecten waren vergelijkbaar met zulk effecten van Dox. Tegelijkertijd leidde de actie van deze derivaten tot veel minder negatieve bijwerkingen gemeten als veranderingen in het aantal erythrocyten, neutrofielen en lymphocyten in het bloed van de dieren en de activiteit van aspartaat- en alanine-aminotransferasen in hun bloedserum, vergeleken met de actie van Dox.

Conclusies

De complexatie van Les-3288 en Les-3833 met de PEG-bevattende PNC versterkte hun cytotoxische actie tegen rat glioma C6 cellen. De cytotoxische actie werd gerealiseerd door apoptosemechanismen en bevestigd door FACS-analyse als de aanwezigheid van de pre-G1-fractie in de rat glioma C6 cellen en van Annexin V-enkelvoudig-positieve cellen. DNA-komeetanalyse onthulde enkelstreng breuken in het kern-DNA van behandelde glioma C6 cellen die waarschijnlijk niet veroorzaakt werden door de intercalatie van de bestudeerde verbindingen in het DNA-molecuul. De Les-3288 en Les-3833 gestabiliseerd door de amphifiele PEG-bevattende PNC resulteerden in de water-gebaseerde vormen en leverden versterking van hun antitumorale effect in vitro in vergelijking met de vrije vorm van de geneesmiddelen.

Afkortingen

DMSO:

Dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide)

Dox:

Doxorubicin (doxorubicinen)

EtBr:

Ethidium bromide (ethidiumbromide)

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting (fluorescentie-geactiveerde celsortering)

ROS:

Reactive oxygen species (reactieve zuurstofsoorten)

PBS:

Phosphate buffered saline (fosfaatgebufferde saline)

PEG:

Polyethylene glycol (polyethyleenglycol)

PI:

Propidium iodide (propidiumiodide)

PNC:

Polymeric nanocarrier (polymere nanodrager)

SEM:

Scanning electron microscopy (scanning elektronenmicroscopie)

TEM:

Transmission electron microscopy (transmissie elektronenmicroscopie)

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in (2-tert-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-yn)