Chondroïtinesulfaat/polycaprolacton/gelatine Electrospun-nanovezels met antitrombogeniciteit en verbeterde endotheelcelaffiniteit als een potentiële steiger voor de engineering van bloedvatweefsel

Abstract

Electrospun polymeer nanovezels hebben veel aandacht gekregen in de weefseltechniek van bloedvaten. Conventionele nanovezelmaterialen met de tekortkomingen van langzame endothelialisatie en trombose zijn echter niet effectief bij het bevorderen van herstel en regeneratie van bloedvatweefsel. Hierin werden biomimetische gelatine (Gt) / polycaprolacton (PCL) composiet nanovezels die een andere hoeveelheid chondroïtinesulfaat (CS) bevatten, ontwikkeld via elektrospintechnologie om hun effecten op antitrombogeniciteit en endotheelcelaffiniteit te onderzoeken. Variërende CS-concentraties in PG-nanovezels beïnvloeden de vezelmorfologie en -diameter. De CS/Gt/PCL-nanovezels hebben een geschikte porositeit (~ 80%) en PBS-oplossingsabsorptie (tot 650%). De introductie van CS in Gt/PCL-nanovezels verbetert hun anticoagulerende eigenschappen aanzienlijk, verlengt hun coagulatietijd en vergemakkelijkt celreacties. In het bijzonder vertonen 10% CS/Gt/PCL-nanovezels gunstige celhechting, verlenging en proliferatie. De Gt/PCL-nanovezels die een bepaalde hoeveelheid CS bevatten, zouden dus uitstekende kandidaten kunnen zijn als een veelbelovende weefseltechnologie-steiger bij het herstel en de regeneratie van bloedvaten.

Inleiding

De ontwikkeling van nanovezelmaterialen heeft veel aandacht gekregen als biomimetische steigers bij weefselherstel en -regeneratie vanwege hun unieke (bio)fysisch-chemische eigenschappen, waaronder hun extracellulaire matrix (ECM)-achtige ultrafijne vezelstructuur, uitstekende mechanische eigenschappen, groot specifiek oppervlak en hoge porositeit met interconnectiviteit [1, 2]. Er is aangetoond dat nanovezelstructuren een sleutelrol spelen bij het mediëren van cellulaire reacties, zoals celadhesie, morfologie (bijv. verspreiding, uitlijning, elongatie, enz.), rangschikking, migratie, proliferatie, fenotype en differentiatie via contactbegeleiding [3 ,4,5]. Hoewel talrijke strategieën voor nanofabricage (bijv. nanoskiving, sjabloonsynthese, fasescheiding, enz.) een beschikbare technologie hebben opgeleverd om nanovezelmaterialen te fabriceren, is elektrospinnen een van de meest effectieve methoden om nanovezels te vervaardigen uit verschillende materialen (metalen, keramiek, polymeer , composietmaterialen, enz.) op industriële schaal [6,7,8].

Naast (bio)fysische signalen kan de selectie van geschikte biomaterialen de celactiviteiten en weefselherstel en -regeneratie aanzienlijk beïnvloeden [9]. Enkele belangrijke kenmerken, zoals biocompatibiliteit, bioresorbeerbaarheid, mechanische eigenschappen en biofunctie, moeten worden overwogen [9, 10]. Vergeleken met natuurlijke/natuurlijke en synthetische/synthetische composieten, hebben composiet nanovezelmaterialen bestaande uit natuurlijke en synthetische polymeren meer aandacht gekregen vanwege de combinatie van de uitstekende biologische eigenschappen van natuurlijke polymeren en de mechanische sterkte van synthetische polymeren [9]. Onder hen is de combinatie gelatine (Gt)/polycaprolacton (PCL) een van de meest representatieve onderzochte natuurlijk-synthetische hybride systemen en wordt deze veel gebruikt in bloedvatweefselmanipulatie [11,12,13,14]. Gt/PCL composiet nanovezels hebben echter nog steeds enkele beperkingen, zoals langzame endothelialisatie en trombose. Onlangs is chondroïtinesulfaat (CS) een gesulfateerd polysacharide dat glycosaminoglycaan en galactosamine bevat, waarvan is aangetoond dat het een hoge adhesie aan endotheelcellen (EC's), een zwakke interactie met eiwitten en bloedplaatjes en een elektrostatische afstoting van negatief geladen bloedbestanddelen bezit [15] ,16,17]. Bovendien zou CS cellulaire apoptose kunnen remmen en de genezing van vaatwonden kunnen vergemakkelijken [18, 19]. Daarom zouden Gt/PCL (PG) elektrospun nanovezels met CS uitstekende kandidaten zijn als bio-instructieve weefseltechnologie-steiger voor bloedvatherstel en -regeneratie.

In het huidige werk werden biomimetische PG-composiet nanovezels met verschillende CS-verhoudingen ontwikkeld via eenstaps-elektrospinning. De morfologie, de porositeit van het chemisch kenmerk en de afbraak en van CS/PG-composiet nanovezels werden gedetecteerd met verschillende karakteriseringstechnieken. Het anticoagulans van PG/CS composiet nanovezels werd geëvalueerd. Verder werden deze composiet nanovezels met verschillende CS-verhoudingen gezaaid met menselijke aorta-endotheelcellen (HAEC's) om hun effecten op cellulaire reacties te onderzoeken.

Materialen en methoden

Materialen

CS (boviene luchtpijp, type A, zuiverheid:95%) werd geleverd door Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). PCL werd verkregen van Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China). Gt (runderhuid, type B) werd verkregen van Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (China). De kit met geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT) werd gekocht bij Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). Azijnzuur (zuiverheid:99,5%) werd gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China). De humane aorta-endotheelcellen (HAEC's) werden verkregen van het aangesloten ziekenhuis van de Qingdao University (China). Kweekmedium Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium/voedingsmengsel F-12 (DMEM/F-12), foetaal runderserum (FBS), 0,25% trypsine-EDTA werden gekocht bij Biological Industries (Israël). Alle reagentia werden gekocht bij Sigma Aldrich (China), tenzij anders vermeld. Het water dat in alle experimenten werd gebruikt, was gedeïoniseerd.

Elektrospinning van nanovezels

PCL (10% w/v) werd gedurende 4 uur onder mechanisch roeren bij kamertemperatuur opgelost in azijnzuur. Gt (10% w/v) werd 2 uur onder constant roeren opgelost in 90% azijnzuur. CS in verschillende concentraties werd aan de Gt-oplossing toegevoegd en gedurende 1 uur zachtjes bij kamertemperatuur geroerd om de homogene oplossingen te verkrijgen die 5, 10 en 15 gew.% CS bevatten ten opzichte van de totale polymeerconcentratie. Vervolgens werd de PG-oplossing bereid door twee bovenstaande oplossingen te mengen in een gewichtsverhouding van 50/50 (w/w) onder roeren gedurende 2 uur, genaamd 5%CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG .

De bereide homogene oplossingen werden onderworpen aan het elektrospinproces, uitgerust met een injectiespuit van 1 ml met een naald van 21 G en een collector bedekt met aluminiumfolie. In deze studie werd de afstand tussen de collectorplaat en de naaldpunt vastgesteld op ongeveer 18 cm, de spanning werd ingesteld op 23 kV en de polymere oplossingen werden weggepompt met een snelheid van 1 ml / uur. Alle oplossingen werden electrospun in een electrospinning instrument (Technology, Tk602TH, China) bij kamertemperatuur en zorgvuldig gecontroleerde vochtigheid (<-40%). Voorafgaand aan verdere experimenten werden de monsters ten minste 72 uur in een vacuümdroogoven geplaatst om eventueel achtergebleven oplosmiddel te verwijderen.

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)

De morfologie van CS@PG nanovezelsteigers werd onderzocht door een SEM (VEGAS, TESCAN, Czech) bij een versnellingsspanning van 20 kV bij kamertemperatuur. De diameter van nanovezels (n = 100) werd verder gemeten aan de hand van SEM-beelden met behulp van beeldanalysesoftware (Afbeelding J).

De TEM-waarnemingen en energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDS) -analyses werden uitgevoerd met een JEOL JEM-2100 plus (Japan).

Fourier Transform Infrarood Spectroscopie (FTIR)

FTIR werd uitgevoerd door een Nicolet iN10 FTIR-spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) om de karakteristieke functionele groepen van CS, PG-nanovezel en CS@PG-nanovezels te evalueren. De spectra van samples zijn opgenomen met de transmissiemodus over een golflengtebereik van 4000-500 cm⁻¹ met een resolutie van 2 cm⁻¹ .

Porositeit en de absorptie van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)

De porositeit van nanovezels werd uitgevoerd met behulp van de vloeistofverdringingsmethode. Ten eerste werd het droge gewicht van nanovezels gewogen als W₁ . Vervolgens werden vier groepen nanovezels gedurende 2 uur bij 25 °C in ethanol ondergedompeld en gewogen als W₂ . De ethanol op het monsteroppervlak werd verwijderd door filtreerpapier en de gewichten van de monsters werden vervolgens genoteerd als W₃ . De porositeit van de nanovezels werd berekend met de volgende formule:

$${\text{Porositeit}}\left( \% \right) =\left( {W_{3} - W_{1} } \right)/\left( {W_{3} - W_{2} } \right) \times 100$$

Voor de PBS-oplossingsabsorptietest werden de verkregen nanovezels in droge toestand gewogen en geregistreerd als Wd. Vervolgens werden de nanovezels 24 uur bij 25 ° C in PBS geweekt en het gewicht in natte toestand werd geregistreerd als Ww na verwijdering van de overtollige vloeistof op het monsteroppervlak. De zwelverhouding kan worden gemeten met de volgende vergelijking:

$${\text{PBS}}\;{\text{absorptie}}\left( \% \right) =\left( {W_{{\text{W}}} - W_{{\text{d} }} } \right)/W_{{\text{d}}} \times 100$$

Alle waarden in de bovenstaande experimenten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 3).

In vitro afbreekbaarheidsgedrag

Om de weerstand van de verkregen nanovezels tegen lysozym te bepalen, werd de afbreekbaarheid van de monsters gemeten op een gepland tijdstip (1, 4, 7, 10 en 14 dagen). Het aanvankelijke gewicht van de nanovezels werd geregistreerd als W_i . Vervolgens werden de monsters ondergedompeld in PBS-oplossing (pH 7,4) die lysozyme (500 g/ml) bevatte en in vitro bij 37 °C geïncubeerd. Op de vooraf bepaalde afbraakintervallen werd elke groep monsters verwijderd en gewassen met gedeïoniseerd water en gevriesdroogd om het uiteindelijke gewicht te verkrijgen (W _f ). De lysozyme-oplossing werd driemaal per week ververst. De resterende massa (%) van de nanovezel-steigers werd geschat zoals gedefinieerd in de volgende formule:

$${\text{Mass}}\;{\text{remaining}}\left( \% \right) =\left( {1 - \frac{{w_{i} - w_{f} }}{{ w_{i} }}} \right) \times 100\%$$

Om het afbraakgedrag van het monster na 7 dagen te evalueren, werd de morfologie van nanovezels waargenomen door SEM.

Bloedcompatibiliteitsanalyse

Coagulatietijden

Geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT) werd gebruikt om de activiteit van intrinsieke en gemeenschappelijke coagulatieroutes te beoordelen door de stollingstijden van bloedplaatjesarm plasma (PPP) te testen na incubatie met elektrospun nanovezels op dekglaasjes. Hiervoor werd ontstold bloed (ongeveer 10 ml) verzameld en 20 minuten bij 3000 tpm gecentrifugeerd om bloedplaatjesarm plasma (PPP) te verkrijgen. Elk monster werd gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd met 200 μL PPP en geanalyseerd met behulp van de APTT-kit volgens de instructies van de fabrikant (n = 3).

Hemolysetest

De hemolysesnelheid werd geëvalueerd door de concentratie van hemoglobine te meten die in de oplossingsfase vrijkwam uit erytrocyten in verdund volbloed dat was blootgesteld aan de elektrospun nanovezels. De monsters op dekglaasjes werden afzonderlijk in platen met 24 putjes geplaatst en gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 2 ml PBS ondergedompeld. De negatieve controlegroepen bevatten slechts 2 ml PBS, terwijl positieve controlegroepen 2 ml gedeïoniseerd water bevatten om maximale lysis van erytrocyten te induceren (n = 3 voor elke testgroep). Vervolgens werd 40 L van het bovengenoemde anti-gecoaguleerde vers volbloed aan elk putje toegevoegd en 60 minuten bij 37 ° C geïncubeerd, waarna de suspensies in centrifugebuizen werden verwijderd en bij 100 × g werden gecentrifugeerd. gedurende 5 min. De supernatanten werden onderworpen aan het meten van de absorptie bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer (SynergyH1/H1M, BioTek, China).

Thrombogeniciteit

Het trombogene potentieel werd in vitro geëvalueerd na incubatie van electrospun-monsters met het bloedplaatjesrijke plasma (PRP). PRP werd bereid door centrifugeren (1500 rpm, 20 min) en de bovenste helft van het plasma werd weggegooid. Vervolgens werden de nanovezels op dekglaasjes 2 uur geïncubeerd in 100 μL PRP bij 37 ° C en driemaal voorzichtig gespoeld met PBS voor daaropvolgende experimenten. Om de bloedplaatjesactiviteit te evalueren na te zijn geïncubeerd met PRP, werden elektrospun nanovezels gedurende 2 uur en 24 uur in de DMEM bewaard, aangevuld met 10% FBS, en vervolgens werd een CCK-8-assaykit gebruikt om de levensvatbaarheid van trombocyten op de nanovezels te meten. CCK-8 (20 L) werd toegevoegd aan 200 μL serumvrij DMEM-medium in platen met 24 putjes en 1 uur geïncubeerd. Ten slotte werden suspensies gemeten door een microplaatlezer bij een golflengte van 450 nm.

Celcultuur en cellevensvatbaarheid

Menselijke aorta-endotheelcellen (HAEC's) werden gekweekt in DMEM aangevuld met FBS (10%, v/v) en streptomycine/penicilline (1%, v/v) in een atmosfeer van 37 °C en 5% CO2 . Het kweekmedium werd driemaal per week vervangen. De cellen werden over het algemeen gedurende 3 minuten geïsoleerd met 0,05% trypsine/EDTA, gecentrifugeerd bij 1000 tpm en gesuspendeerd in het verse medium om celpassage of celzaaien uit te voeren.

Voorafgaand aan het zaaien van cellen werden alle nanovezelmaterialen in een plaat met 24 putjes gedurende 1 uur onder UV-straling gesteriliseerd en gedurende 1 uur ondergedompeld in 75% ethanol (v / v, %). Vervolgens werden de nanovezels vier keer gespoeld met PBS-oplossing en 12 uur geweekt in DMEM in CO₂ broedmachine. De cellen werden gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per putje op nanovezels en het medium werd elke dag vervangen. Na 24 uur samen gekweekt te hebben, werden de cellen driemaal gewassen met PBS-oplossing en vervolgens gekleurd met een Calcein-AM/PI Double Stain Kit (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). PI werd gebruikt om dode cellen te kleuren en Calcein-AM werd gekleurd voor levende cellen.

Celmorfologie op de nanovezels

Om de celadhesie op de nanovezels te observeren, werd de morfologie van de cellen waargenomen na 24 uur co-gecultiveerd door fluorescentiemicroscoop (Nikon A1 MP, Japan). Eerst werden de cellen 30 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Vervolgens werd 0,5% Triton X-100-oplossing gedurende 5 minuten gebruikt om het celmembraan te permeabiliseren. Ten slotte werd 4′6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) gebruikt om celkernen te kleuren en rhodamine-phalloidin werd gebruikt om de F-actine te kleuren. Kwantitatieve analyse (celdichtheid, eencellig gebied, celverlenging) werd verder uitgevoerd met Image J.

Celproliferatie

Celproliferatie-activiteit op de composiet nanovezels werd uitgevoerd met een CCK-8 Assay Kit. De HAEC's werden gezaaid op nanovezels met een dichtheid van 8 × 10³ cellen/put. Het kweekmedium werd om de twee dagen ververst. Na 1, 4, 7 dagen gezamenlijk kweken werden de cellen gewassen met een PBS-oplossing om niet-hechtende cellen te verwijderen. Vervolgens werd 20 L CCK-8 en het volledige medium met een volumeverhouding van 1:10 gedurende 1 uur in de incubator aan de 24-wells-plaat toegevoegd. De absorptie is getest door Elisa Reader bij 450 nm.

Celkleuring met DAPI en rhodamine-phalloidin werd uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop om direct de veranderingen van celaantallen te observeren na co-cultuur met verschillende nanovezels gedurende twee dagen en zes dagen.

Statistische analyse

Alle monsters in de experimenten werden in drievoud verwerkt. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD). Statistische analyse van monsters werd bepaald door middel van eenrichtingsanalysevariantie (ANOVA) om verschillen te vergelijken met significantie die is toegewezen op p < 0.05.

Resultaat en discussie

Voorbereiding en karakterisering van CS@PG-nanovezels

Figuur 1 toonde het schematische diagram van het elektrospinproces voor CS@PG nanovezel-steigers en in vitro evaluatie van anticoagulatie en cytocompatibiliteit. Om gemanipuleerde vasculaire weefselsteigers te ontwikkelen voor het bevorderen van de proliferatie van endotheelcellen, werden verschillende verhoudingen van CS (5, 10 en 15 gew.%) opgenomen in PG (10%, v/v) oplossingen tot gefabriceerde composiet nanovezels via een elektrospinproces.

Schematische illustratie van de fabricage van nanovezels en in vitro evaluatie

SEM werd uitgevoerd om de structuur van CS@PG elektrospun nanovezels te observeren. Zoals getoond in Fig. 2 vertoonden de SEM-afbeeldingen van PG, 5% CS @ PG, 10% CS @ PG, 15% CS @ PG nanovezels de dichte vezelachtige architectuur, met continue, gladde en nano-geschaalde vezels door middel van elektrospintechniek . De PG-nanovezels (Fig. 2a) vertoonden veel onregelmatige kralen op nanovezels door het proces van elektrospinnen, met een gemiddelde diameter van 406.01 ± 146.28 nm. Het zou kunnen worden verklaard dat 10% w/v electrospun-oplossing een lage viscositeit vertoonde, wat resulteerde in de vorming van inhomogene nanovezels die bolletjes bevatten [20]. Door de hoeveelheid CS in de polymere oplossing te verhogen van 5 tot 10 gew.%, konden homogene nanovezels zonder kralen worden bereikt vanwege de verhoogde viscositeit van de oplossing (figuur 2b, c). Dienovereenkomstig vertoonden 5%CS@PG en 10%CS@PG een kleinere gemiddelde diameter van respectievelijk 382,35 ±-152,99 nm en 300,29 ± 100,85 nm. Dit resultaat is voornamelijk omdat de toename van het CS-gehalte de geleidbaarheid van de elektrospinoplossing [20] dienovereenkomstig verbeterde. Wanneer de polymeerconcentratie echter tot 15% was, is de viscositeit van de polymeeroplossing te hoog om in het elektrische veld te worden uitgerekt. Bij dezelfde stroomsnelheid van 1 ml / uur als de vorige groepen, zagen we dat onder de aangelegde spanning van 23 kV het fenomeen van de naaldpuntobstructie verscheen en de Taylor-kegel niet kon worden waargenomen. Daarom werden de stroomsnelheid van de electrospun-oplossing en de aangelegde spanning aangepast tot respectievelijk 0,9 ml/h en 20 kV. De 15% CS@PG-nanovezels werden met succes geproduceerd met een gemiddelde diameter van 266,92 ± 105,43 nm.

SEM-afbeeldingen en diameterverdeling van CS@PG elektrospun-steigers bij verschillende CS-verhoudingen. een PG, b 5%CS@PG, c 10%CS@PG, d 15%CS@PG

Zoals weergegeven in figuur 3a, werd gevonden dat CS uniform was verdeeld in de 5% CS@PG en 10%CS@PG nanovezels. Er werd echter CS-aggregatie gedetecteerd in de 15% CS@PG-vezels. Zoals aangegeven in Fig. 3b, werd EDX-elementanalyse uitgevoerd om het zwavelgehalte van bereide vezels te detecteren. Zoals verwacht nam het zwavelgehalte toe met een verhoogde concentratie CS in de verkregen vezels.

TEM-afbeeldingen (a ) en EDX-elementanalyse van CS@PG elektrospun-steigers bij verschillende verhoudingen van CS, d.w.z. PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG

FTIR-spectra-analyse

FTIR-spectra-analyse werd uitgevoerd om de karakteristieke absorptiepieken van de chemische groep van geprepareerde nanovezelsteigers te bepalen. Het FTIR-spectrum van PG en CS werd beschouwd als de controlegroep om te vergelijken met CS@PG-nanovezelgroepen. In het PG-spectrum, sterke absorptiebanden die verschenen bij 3300 cm⁻¹ en 2935 cm⁻¹ kan worden toegeschreven aan de –NH₂ en –OH uitrekkende vibratie, en CH₂ asymmetrisch rekken, respectievelijk. Er verschenen verschillende karakteristieke absorptiepieken bij 1652 cm⁻¹ (amide I) voor C=O strektrilling, 1542 cm⁻¹ (amide II) voor N–H buigtrillingen, 1441 cm⁻¹ voor CH₂ uitrekken, en 1267 cm⁻¹ (amide III) voor C-N rektrillingen [21, 22]. Het CS-spectrum voerde een karakteristieke absorptieband uit bij 1245 cm⁻¹ , wat de S=O-rektrilling weergeeft in negatief geladen SO₄ ²⁻ [23, 24].

Zoals getoond in Fig. 4 vertoonden de FTIR-spectra van 5% CS@PG, 10%CS@PG en 15%CS@PG nanovezels karakteristieke pieken van PCL, Gt en CS samen. Vergeleken met de spectra van de PG-groep vertoonden CS@PG-groepen de karakteristieke band van CS bij 1245 cm⁻¹ en de intensiteit van de CS-band nam toe door de aanwezigheid van CS in nanovezels. Deze bevinding bevestigde de aanwezigheid van verschillende gehaltes aan CS in de CS@PG elektrospun nanovezels.

FT-IR-spectrum van de CS@PG elektrospun-steigers

Porositeit, zwellingsverhouding en afbreekbaarheid van nanovezels

De hoge porositeit van de vezel geeft aan dat het materiaal een uitstekende interconnectiviteit heeft, wat bevorderlijk is voor de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen in de poriën en celinfiltratie bevordert [25, 26]. Figuur 5a toonde de porositeit van nanovezelfilms. De porositeit van verkregen nanovezels met verschillende CS-verhoudingen was ongeveer tot 80%. De hoge poreuze architectuur verkregen door elektrospun nanovezels kan de natuurlijke ECM nabootsen, waardoor een gunstige 3D-micro-omgeving voor cellen ontstaat [27]. Er is gemeld dat scaffolds in tissue engineering met een porositeit tot 80% gunstig waren voor het transport van voedingsstoffen en metabolieten.

een De porositeit van geprepareerde nanovezels. b PBS-absorptie van bereide nanovezels. c Massarest van CS@PG-nanovezels na afbraak in PBS-oplossing gedurende maximaal 14 dagen. d SEM-microfoto's van nanovezelfilms in PBS-oplossing bij 37 °C gedurende 7 dagen

De PBS-absorptieverhouding van de CS@PG-nanovezel-steigers werd vergeleken om het effect van CS op de PBS-opname van de films te evalueren. Zoals aangegeven in Fig. 5b, was de PBS-absorptieverhouding van de PG-steiger 586,34 ± 49,44%, en de 5%CS@PG en 10%CS@PG nanovezels waren respectievelijk 492,86 ± 21,99% en 510,04 ± 69,55%. De PBS-absorptieverhouding van 15% CS@PG-groepen (665,07 ± -59,81%) was significant hoger dan die van 5% CS@PG en 10%CS@PG. Dit resultaat gaf aan dat het verhoogde gehalte aan CS in de composiet nanovezels de PBS-opname-eigenschap van de films zou kunnen verbeteren, wat te wijten zou kunnen zijn aan de hoge hydrofiliciteit in CS-moleculen die hydrofiele groepen (carboxyl en hydroxyl) bevatten [28].

De gegevens van het in vitro afbreekbaarheidsexperiment werden weergegeven in Fig. 5c, en er werd gevonden dat met de toename van de CS-verhouding ook de afbraaksnelheid van CS@PG-nanovezelsteigers werd verhoogd. Dit kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van SO₄ ²⁻ groepen [29]. Zoals aangetoond in Fig. 5c, begon de afbraaksnelheid van de meeste steigers na 7 dagen toe te nemen, en de afbraakresultaten op dag 14 waren 8,45%, 11,39%, 13,97% en 15,10% voor PG, 5% CS@PG, 10 respectievelijk %CS@PG en 15%CS@PG nanovezelsteigers. De SEM-afbeeldingen van nanovezelige steigers (figuur 5d) vertoonden een lichte zwelling na 7 dagen onderdompeling in PBS-oplossing. De SEM-afbeeldingen geven aan dat de ontwikkelde nanovezels stabiel genoeg waren om ernstige degradatie en expansie tot 7 dagen te voorkomen, waardoor de celrespons in vivo of in vitro werd beïnvloed.

Hemocompatibiliteitsevaluatie

APTT is een eenvoudige en betrouwbare methode om het bloed of plasma te detecteren via het intrinsieke stollingsmechanisme. APTT werd getest om de invloed van de electrospun nanovezels op de mogelijke vertraging van de bloedstolling te meten. De door APTT gedetecteerde stollingstijd vertoonde een statistisch significante afname van de coagulatietijden tussen controle-PG en 5%CS@PG en 10%CS@PG-nanovezels. Daarentegen werd een verlengde APTT gevonden na incubatie van 15% CS@PG-nanovezels met PPP, wat wijst op de verbeterde antistollingsfunctie. Zoals weergegeven in figuur 6a, was de impact van bloedstolling afhankelijk van de diameter van nanovezelmonsters. De laagste APTT-coagulatietijd werd gevonden na interactie met 5% CS@PG nanovezel en de hoogste APTT met electrospun 10%CS@PG, vergelijkbaar met de mate van hemolyse. De coagulatietijd werd verlengd met de toename van de CS-ratio.

een APTT van CS@PG nanovezels. b Hemolysesnelheid van de monsters. c Bloedplaatjes metabolische activiteit op de nanovezels. n = 3, *p < 0.05

Volgens de ASTM F756-00 (2000) moet de hemolysesnelheid van de biomaterialen < 5% zijn [30]. De mate van hemolyse in dit onderzoek werd uitgevoerd met behulp van een colorimetrische test van vrijgekomen hemoglobine uit erytrocyten en kan worden berekend met de vergelijking:Hemolyse (%) = (OD_sam − OD_neg )/(OD_pos − OD_neg ) × 100%. Zoals aangegeven in Fig. 6b, waren alle monsters niet-hemolytisch en resulteerden ze niet in een duidelijke hemolyse (hemolysepercentage is minder dan 5%).

De gegevens van het experiment met de levensvatbaarheid van bloedplaatjes worden getoond in Fig. 6c. Na 2 uur was de metabole activiteit van aangehechte trombocyten het hoogst met maximale waarden die werden bereikt na interactie van PRP met nanovezels, met name PG-nanovezels. Interessant is dat na 24 uur de bloedplaatjesactiviteit in alle monsters verminderde. Dit resultaat kan te wijten zijn aan de snelle activering van trombocyten door de structuur van nanovezels, wat resulteert in een snelle consumptie en afgifte van groeifactoren in vergelijking met stabiele en langdurige activering van bloedplaatjes bij contact met het gladde oppervlak [31]. De normale levensduur van trombocyten is ongeveer 8-10 dagen en wordt korter naarmate de bloedplaatjes geactiveerd worden.

Live/Dead Cell-kleuring

De invloed van CS op de cytocompatibiliteit van de nanovezels werd onderzocht door middel van cellevensvatbaarheid, adhesieve morfologie en proliferatie van HAEC's-evaluatie op nanovezels gedurende 6 dagen. De aangehechte cellen werden beoordeeld met behulp van de Calcein-AM/PI dubbele kleuringskit, DAPI-kleuring en CCK-8-assaykit.

Figuur 7a-e toonde de fluorescentiebeelden van levende en dode HAEC's die aan de verschillende nanovezels waren bevestigd. Calcein-AM (groen) en PI (rood) werden gebruikt om respectievelijk de levende cellen en dode cellen te kleuren. Er kon worden waargenomen dat levende cellen werden gehecht aan de CS@PG composiet nanovezels, wat erop wees dat de nanovezels die verschillende verhoudingen van CS bevatten geen toxiciteit hadden voor HAEC's. Verdere kwantitatieve analyse van het aantal levende / dode cellen op de nanovezels werd onderzocht door Image J (figuur 7f). Vergeleken met het aandeel levende en dode cellen op PG-nanovezels, vertoonden de andere drie groepen PG met verschillende CS-verhoudingen, vooral 10% CS@PG en 15%CS@PG-groepen een groter percentage levende cellen, en het percentage was verhoogd met de toename van de CS-concentratie. Deze uitkomst toonde aan dat de aanwezigheid van CS in de nanovezels gunstig was voor het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen [32].

Cellevensvatbaarheid van HAEC's op de CS@PG-steigers. een Weefselkweekplaat (TCP), b PG, c 5%CS@PG, d 10%CS@PG, e 15%CS@PG, f Het percentage levende/dode celaantallen van verschillende nanovezelsteigers, n = 3

Celadhesiegedrag op nanovezels

Nanovezelige steigers met goede biocompatibiliteit worden beschouwd als de primaire vereiste voor het genereren van bloedvaten. PCL met goede biologische afbreekbaarheid en natuurlijke Gt met uitstekende biocompatibiliteit werden veel gebruikt in weefselengineering met verschillende structuren, waaronder hydrogels, elektrospun nanovezels en driedimensionale steigers [21, 33, 34]. De morfologie van HAEC's op de composiet nanovezels en cel-materialen interactie na 24 uur werd waargenomen met een fluorescentiemicroscoop. De celdichtheid 10%CS@PG en 15%CS@PG was statistisch significant dan PG en 5%CS@PG, wat aangaf dat de toevoeging van CS op een hoger niveau celadhesie bevordert. Zoals getoond in figuur 8c, was het eencellige gebied van 5% CS@PG en 15%CS@PG groter dan de andere groepen nanovezels. De celverlenging van 10% CS@PG was echter significant hoger dan PG, 5% CS@PG en 15%CS@PG (Fig. 8d). Deze uitkomst zou kunnen worden verklaard dat de toevoeging van CS bij een concentratie van 10% de verspreiding van HAEC's kan vergemakkelijken. Het bleek dat de HAEC's goed konden hechten, verspreiden en groeien op de composiet nanovezels, met name 10%CS@PG en 15%CS@PG. Deze twee nanovezelmaterialen kunnen dus worden beschouwd als een veilig en veelbelovend kandidaat-vasculair materiaal voor klinische toepassing.

een Celadhesiemorfologie van HAEC's op de CS@PG-steigers (DAPI:celkernen; Rhodamine-Phalloidin:cytoskelet). b Celdichtheid. c Eencellig gebied, d Celverlenging in verschillende groepen nanovezels

Celproliferatie

Celgroei en levensvatbaarheid op CS@PG-nanovezels werden in vitro onderzocht met een fluorescentiemicroscoop en CCK-8-test (Fig. 9a-c). De electrospun PG-steiger werd geselecteerd als de positieve controle. The results of the CCK-8 assay for different nanofibrous films are displayed in Fig. 9c. In 2, 4, 6 days of cells culturing, the cell number increased with the culture time for all groups. On day 6, the OD value of 10%CS@PG nanofibers was significantly higher than that of the PG scaffold. The cell proliferation comparison of 5%CS@PG, 10%CS@PG, and 15%CS@PG indicated that the cell proliferation rate was increased as the CS presence in composite nanofibers in a certain range. However, the cell proliferation capability was also influenced by the surface morphology of nanofibrous materials. Since the 15%CS@PG nanofiber exhibited strong viscosity due to the higher CS ratio in electrospinning polymeric solution, cell proliferation might be affected.