Gezamelijke levering van dacarbazine en all-trans-retinoïnezuur (ATRA) met behulp van lipidenanoformuleringen voor synergetische antitumorwerking tegen kwaadaardig melanoom

Abstract

Maligne melanoom is een zeer agressieve huidkanker die verantwoordelijk is voor 80% van de mortaliteit, en de totale mediane overleving bij patiënten met gemetastaseerd melanoom is slechts 6-9 maanden. Combinatiebehandeling door gelijktijdige toediening van dubbele geneesmiddelen in een enkele nanodrager is aangetoond elegant en effectief te zijn bij de bestrijding van kanker. Hierin gebruiken we een combinatietherapie op basis van dacarbazine (DBZ), door de FDA goedgekeurd medicijn voor melanoom en all-trans-retinoïnezuur (ATRA), veelbelovende antikankermiddelen geladen op lipidenanoformuleringen (RD-LNF) als een nieuwe behandelingsstrategie voor kwaadaardig melanoom. We hebben met succes beide medicijnen ingekapseld in lipidenanoformuleringen en hebben in de loop van de tijd een gecontroleerde afgifte van nuttige lading aangetoond. We hebben aangetoond dat de gelijktijdige afgifte van DBZ en ATRA celproliferatie op een concentratieafhankelijke manier effectief zou kunnen verminderen. De combinatorische nanodeeltjes verminderden het kolonievormingsvermogen van B16F10-melanoomcellen aanzienlijk. Flowcytometeranalyse toonde aan dat RD-LNF een groter aandeel apoptosecellen induceerde met een significante remming van de voortgang van de celcyclus en celmigratie. Deze resultaten suggereren het veelbelovende potentieel van RD-LNF bij de behandeling van maligne melanoom met een hoge werkzaamheid.

Inleiding

Maligne melanoom is een van de agressieve maligniteiten die voornamelijk in de menselijke huid voorkomt [1]. Melanoom is verantwoordelijk voor 4% van alle dermatologische kankers, maar is verantwoordelijk voor 80% van de sterfte aan huidkanker en wordt een groeiend probleem in onderontwikkelde en ontwikkelingslanden [2, 3]. Melanoom heeft een hoge neiging tot uitzaaiing naar de verschillende delen van het lichaam, waaronder de hersenen, het hart en de longen, waardoor het een van de agressieve vormen van maligniteiten is [4]. Als de diagnose in een vroeg stadium wordt gesteld, behoort chirurgische excisie tot de mogelijke therapeutische opties. Chirurgische ingreep garandeert echter geen volledig herstel van melanoom [5]. Bovendien wordt de radiale groeifase van deze maligniteit resistent tegen de meeste andere behandelingsopties, waaronder chemotherapie en radiotherapie [6]. Om specifiek te zijn, peptidereceptoren worden tot overexpressie gebracht op het oppervlak van melanoomkanker, waardoor het een aantrekkelijk vooruitzicht is. Het is aangetoond dat de subtype-2 somatostatinereceptor (SSTR2) in hoge mate tot expressie komt in de melanoomcellen [7].

Dacarbazine (DBZ) of dimethyl-triazeno-imidazol carboxamide (DTIC), een DNA-alkylerend middel, is het enige en eerstelijns chemotherapeutische geneesmiddel dat is goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) [8]. DBZ is een sterk alkylerend middel dat de kankercellen doodt door de alkylgroepen toe te voegen aan het DNA of kernmateriaal van kankercellen [9]. Ondanks zijn krachtige werking, lijdt DBZ aan een slechte oplosbaarheid in water en een korte halfwaardetijd (41 min) in de bloedcirculatie, waardoor het therapeutische effect bij de behandeling van melanoom-maligniteiten wordt verminderd [10]. Bovendien werd een teleurstellend responspercentage tussen 10 en 25% waargenomen met minder dan 5% volledig kankerherstel, wat wijst op de beperking van een monotherapie [11, 12]. Daarom is er een dringende behoefte aan het ontwikkelen van een alternatieve strategie om de effectiviteit van de behandeling van DBZ te verbeteren.

Gelijktijdige toediening van meerdere therapeutische middelen in een enkele toediening is effectiever gebleken in vergelijking met die van de individuele therapeutische middelen [13]. De gelijktijdige levering van therapeutische middelen in een enkelvoudig dragersysteem zal de synergetische activiteit, vergelijkbare farmacokinetische eigenschappen en een hogere werkzaamheid tegen kanker verlenen [14]. All-trans-retinoïnezuur (ATRA) is een veelbelovend middel tegen kanker dat wordt gebruikt bij de behandeling van verschillende vormen van kanker [15]. De ATRA vertoonde zijn therapeutische werkzaamheid door te binden aan de retinoïnezuurreceptoren in de kern van kankercellen, wat resulteerde in remming van groei, proliferatie, differentiatie en uiteindelijke celdood [16]. In tegenstelling tot andere chemotherapeutische middelen leidde ATRA niet tot bijwerkingen zoals cardiotoxiciteit of beenmerghypoplasie. Van ATRA is gemeld dat het de werkzaamheid tegen kanker verbetert bij gebruik in combinatie met een geschikt chemotherapeutisch middel. Nogmaals, lipofiele ATRA heeft een slechte oplosbaarheid in water en een snelle systemische klaring, waardoor een stabiel toedieningssysteem nodig is [17].

Het is aangetoond dat systemen voor het afleveren van nanodeeltjes de therapeutische werkzaamheid van ingekapselde therapieën verbeteren door het in de doeltumorweefsels af te geven en door het off-target-effect in de systemische circulatie te vermijden met behulp van een verbeterd permeatie- en retentieeffect (EPR) [18, 19]. De vaste lipide-nanodeeltjes (SLN) worden beschouwd als alternatief voor veel bestaande dragers, waaronder liposomen of micellen vanwege de opvallende kenmerken zoals verbeterde stabiliteit, gecontroleerde geneesmiddelafgifte, hoge laadefficiëntie en gemak van voorbereiding / opschaling [20] . Een van de belangrijke aspecten van SLN als drager van medicijnafgifte is het veiligheidsprofiel van lipiden met de GRAS-status, goed verdragen en fysiologische lipiden [21]. De stabiele opname van geneesmiddelen in de lipidekern verbetert de oplosbaarheid in water en verbetert het farmacokinetische profiel en verlengt de fysiologische stabiliteit in de systemische circulatie [22].

In deze studie behandelen we een veelbelovende strategie van co-afgifte van DBZ en ATRA met behulp van lipidenanoformuleringen voor de combinatiebehandeling bij melanoom-maligniteiten. De DBZ zal naar verwachting in de lipidekern worden geladen, terwijl ATRA naar verwachting een deel van de nanodeeltjesstructuur zal zijn. We bestudeerden de fysisch-chemische eigenschappen, cellulaire opname en in vitro cytotoxiciteit van gecombineerde nanodeeltjes. Bovendien werd het antikankereffect verder geëvalueerd door apoptose-assay, celcyclusanalyse, kolonievorming en celmigratie-analyse.

Conclusie

Concluderend hebben we met succes dacarbazine en all-trans-retinoïnezuur-beladen lipidenanoformuleringen geformuleerd. Onze resultaten tonen duidelijk aan dat de RD-LNF de proliferatie van melanoomcellen remt, opmerkelijke apoptose induceert en de voortgang van de celcyclus en celmigraties remt. Het futuristische werk zal zich richten op het bestuderen van de werkzaamheid tegen kanker in klinisch relevante diermodellen en het ontwikkelen van een gerichte therapie voor de maligniteit van melanoom. Dit is een voorstudie die is uitgevoerd in de melanoomcellen en brede onderzoeken in verschillende klinisch relevante diermodellen vormen het volgende deel van ons onderzoekswerk.

Materialen en methoden

Voorbereiding van met DBZ/ATRA geladen lipidenanoformuleringen

De met geneesmiddel beladen lipidenanodeeltjes werden bereid door de ultrasoonapparaatmethode. In het kort werden 10 mg DBZ en 10 mg ATRA opgelost in 2 ml chloroformoplossing die 50 mg Egg l-α-fosfatidylcholine (PC) en 2 mg DSPE-methyl(polyethyleenglycol)-2000 (mPEG₂₀₀₀ ). Het organische oplosmiddel werd gedroogd onder gebruikmaking van blootstelling aan argongas gedurende 20 minuten. Aan het gedroogde geneesmiddel + lipide-mengsel werd 80 mg trimyristine (Tm) toegevoegd en gedurende 1 uur bij 65°C geïncubeerd. Aan dit oliemengsel werd 5 ml van een 4% poloxameeroplossing toegevoegd en onmiddellijk werd de sonde gedurende 6 minuten gesoniceerd bij 80 W. De resulterende emulsie werd 30 min op ijs gekoeld. De nanodeeltjes werden onderworpen aan Amicon Ultra 0,5 centrifugale filtereenheid (3 kDa cutoff; Merck, Duitsland) bij 12000×g gedurende 20 minuten. De hoeveelheid vrij DBZ en ATRA in het filtraat werd geëvalueerd met de HPLC-methode en de laadefficiëntie en laadcapaciteit werden berekend. Waters HPLC-systeem bestaande uit een Waters 1525 binaire pomp, Waters 2487 UV-detector, Waters 2475 fluorescentiedetector, 1500 kolomverwarmer en een Symmetry C18-kolom werd gebruikt voor de geneesmiddelanalyse. Voor ATRA bestond de mobiele fase uit acetonitril en trifluorazijnzuur in een verhouding van 90/10 v/v bij een stroomsnelheid van 1 ml/min en gedetecteerd bij 348 nm. Voor DBZ werden acetonitril en 0,05 M dinatriumwaterstoffosfaat in een verhouding van 30/70 v/v met 0,5% TEA gebruikt. De pH van de mobiele fase werd op pH 3,7 gehouden en er werd een stroomsnelheid van 1 ml/min gebruikt.

Analyse van deeltjesgrootte en morfologie

De deeltjesgrootteverdeling van gecombineerd nanodeeltje werd geëvalueerd door Malvern Zetasizer Nano ZS90 met een He-Ne-laser (633 nm). Alle monsters werden verdund met gedestilleerd water en de experimenten werden in drievoud bij 24°C uitgevoerd. De morfologie van het nanodeeltje werd geëvalueerd met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM; JEOL JEM200CX bij 120 kV). De verdunde deeltjes werden gekleurd met 2% fosfowolfraamzuur, gedroogd en bekeken onder TEM.

In vitro geneesmiddelafgifte van met geneesmiddel geladen nanoformuleringen

De afgifte van ingekapselde geneesmiddelen werd geëvalueerd door middel van de dialysemethode. Twee milliliter met geneesmiddel beladen nanodeeltjes die een equivalent van 1 mg ATRA en 1 mg DBZ bevatten, werden verzegeld in een dialysemembraan (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa). De dialysebuis werd in een 25 ml afgiftebuffer geplaatst en bij 37°C op een rotatie van 100 rpm gehouden. Met een vooraf bepaald tijdsinterval tot 72 uur werd 1 ml monsters genomen en vervangen door verse buffer van gelijke hoeveelheid. De hoeveelheid DBZ en ATRA werd geëvalueerd met de HPLC-methode zoals hierboven beschreven.

Celcultuur en cellulaire opnameanalyse

Muizenhuidmelanoomcellen (B16F10) werden gekocht bij China Infrastructure of Cell Line Resources (Beijing, China). De cellen werden gekweekt in RPMI-1640-medium aangevuld met 10% FBS en 1% van het antibioticummengsel. Mediums werden regelmatig om de 2 dagen vervangen en gekweekt na 90% confluentie. Voor cellulaire opnameanalyse werden B16F10-cellen gezaaid in een plaat met 6 putjes gedurende 24 uur incubatie. De nanodeeltjes werden geladen met Coumarine-6 als een fluorescerende tracker. Het oude medium werd verwijderd en vervangen door een vers medium dat de Coumarine-6-lipidenanodeeltjes bevat en gedurende 1-3 uur in omgekeerde volgorde geïncubeerd. De cellen werden gewassen en verwijderd met een celschraper. De cellen werden gedurende 5 minuten bij 1200 rpm gecentrifugeerd en de celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in 1 ml koude PBS. De monsters werden beoordeeld door AccuriTM C6 flowcytometer (BD Co., VS).

In vitro cytotoxiciteitstest

Het cytotoxische effect van vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF op B16F10-cellen werd geëvalueerd met MTT-assay. De cellen (1 × 10⁴ ) werden in elk putje van de plaat met 96 putjes gezaaid en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden eerst behandeld met verschillende concentraties vrij ATRA en DBZ en testten het antikankereffect op de melanoomcellen. Gevolgd door werden cellen behandeld met een vaste concentratie van vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF van respectievelijk 25 g/ml en 50 g/ml. De cellen werden 24 uur geïncubeerd en vervolgens werd het medium voorzichtig verwijderd en tweemaal gewassen met PBS. Aan het einde werden de cellen behandeld met 100 l 5 mg/ml MTT-oplossing en 4 uur geïncubeerd. Het kweekmedium werd voorzichtig verwijderd en 100 l isopropanol werd toegevoegd en gedurende 15 minuten onder schuddende omstandigheden geïncubeerd. De opgeloste formazankristallen werden bestudeerd bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer. Niet-behandelde cellen werden gebruikt als controle en berekeningen werden gemaakt op basis van de cellevensvatbaarheid van controles.

Apoptose-assay—Flowcytometer

Het apoptose-effect van vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF in B16F10-cellen werd geëvalueerd na de kleuring met PE-annexine V en op 7AAD gebaseerde apoptosekit. De cellen werden gezaaid in een plaat met 12 putjes met een celdichtheid van 2 × 10⁵ cellen/putje en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 g/ml-equivalenten van vrije ATRA-, DBZ-, D-LNF- en RD-LNF-formuleringen en onbehandelde cellen werden als een controle beschouwd. Na 24 uur blootstelling aan de behandeling werden cellen gekleurd volgens het protocol van de fabrikant. AccuriTM C6 flowcytometer werd gebruikt voor PE- en 7AAD-expressie en er werden minimaal 10.000 events geregistreerd in de flowcytometer. PE-positieve en 7AAD-negatieve cellen waren vroeg apoptotisch; PE-positieve en 7AAD-positieve cellen waren laat apoptotisch.

Celcyclusanalyse—Flowcytometer

De cellen werden gezaaid in een plaat met 12 putjes met een celdichtheid van 2 × 10⁵ cellen/putje en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 g/ml-equivalenten van vrije ATRA-, DBZ-, D-LNF- en RD-LNF-formuleringen en onbehandelde cellen werden als een controle beschouwd. Na 24 uur werden de behandelde cellen gewassen en verzameld door trypsinisatie en gedurende 2 uur bij 4 ° C gefixeerd met 70% ethanol. Cellen werden vervolgens behandeld met ribonuclease om eventuele RNA-verontreinigingen te verwijderen. Nu werden de cellen gekleurd met propidiumjodide (PI) gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de incubator. De fluorescentie van PI-gekleurde cellen werd bepaald door de AccuriTM C6 flowcytometer. De celcyclusfase was verdeeld in subG1-, G1-, S- en G2/M-fase.

Kolonievormingstest

De cellen werden gezaaid in platen met 12 putjes met een celdichtheid van 2 × 10⁵ cellen/putje en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden behandeld met 25 g/ml-equivalenten van vrije ATRA-, DBZ-, D-LNF- en RD-LNF-formuleringen. De behandelde cellen werden getrypsiniseerd, gewassen en geteld met behulp van een celteller. De cellen werden vervolgens uitgezaaid in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 1500 cellen/putje. De cellen werden vervolgens gedurende 12 dagen onder omgevingsomstandigheden van 37 ° C geïncubeerd totdat de kolonies zichtbaar waren. De cellen werden gewassen met PBS en gefixeerd met methanol op azijnzuur tot water (1:1:8) gedurende 10 minuten, gevolgd door kleuring met 0,1% kristalvioletkleuring gedurende 45 minuten. De gekleurde cellen werden vervolgens bekeken onder een lichtmicroscoop.

Cell Migration Assay

Voor deze test werd een transwell-kamer met twaalf putjes met een poriegrootte van 8 m gebruikt. Om het onderzoek te starten, 5 × 10⁴ cellen / putje werd gezaaid in de bovenste kamer. Het bovenste medium is verstoken van FBS, terwijl het onderste kamermedium uit 10% FBS bestaat. Na 24 uur werd de hoeveelheid cellen die naar het onderste membraanoppervlak waren gemigreerd, gefixeerd en gekleurd met 0,5% kristalviolette kleurstof. Het aantal cellen werd geteld in vijf velden die willekeurig werden geselecteerd onder een lichtmicroscoop; het gemiddelde aantal cellen werd geregistreerd en geanalyseerd.

Statistische analyse

Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en worden in drievoud uitgevoerd, tenzij en anders afzonderlijk vermeld. Twee groepen werden vergeleken met behulp van ongepaarde t tests, terwijl de vergelijking van meer dan twee groepen werd gedaan met behulp van eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Turkije. Statistieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism-software en een verschil van p <0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van DBZ/ATRA-geladen lipidenanoformuleringen

De behandeling van melanoom blijft een grote uitdaging en standaardbehandelingsopties, waaronder chemotherapie of radiotherapie of chirurgische resectie, zullen alleen effectief zijn op de solide bulktumoren die gepaard gaan met een slechte prognose. De FDA heeft geneesmiddelen zoals paclitaxel of de combinatie ervan goedgekeurd, maar het heeft de algehele impact op de overleving van de patiënt en de genezing van kanker niet verbeterd. Dacarbazine (DBZ) is de eerste keus van chemotherapeutische geneesmiddelen die zijn goedgekeurd door de FDA; DBZ lijdt echter aan slechte fysisch-chemische eigenschappen en resulteerde in een teleurstellend responspercentage tussen 10 en 25%. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een nieuwe therapeutische strategie ontwikkeld voor combinatie met ATRA en DBZ in lipidenanoformuleringen (Fig. 1). We veronderstelden dat de combinatie van twee therapeutische componenten de antitumorwerking bij melanoommaligniteiten zal verbeteren. Het is vermeldenswaard dat ATRA, hoewel het de eigenschappen tegen kanker vertoont, niet resulteerde in enig nadelig effect in de systemische omgeving [23]. Omdat de DBZ hydrofoob van aard is, hebben we lipidenanoformuleringen ontworpen die de hydrofobe geneesmiddelen stabiel in de lipidekern kunnen opnemen en ATRA zal worden geladen als een structurele component van de nanodeeltjes. De lipide-nanodeeltjes die de therapeutische componenten dragen, zullen helpen in de verre diepe tumor in het lichaam. De laadefficiëntie van DBZ en ATRA was respectievelijk 91,2 ± 1,25% en 95,8 ± 1,14%. De laadcapaciteit van DBZ en ATRA in RD-LNF was respectievelijk 7,07 ± 0,65% w/w en 7,48 ± 1,05% w/w. De deeltjesgrootte van D-LNF bleek 121,5 ± 1,65 nm te zijn met een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,134 en een zeta-potentiaal van -23,5 ± 0,85 mV. De deeltjesgrootte van RD-LNF was 138,2 ± 1,28 nm met een PDI van 0,159 en een zeta-potentiaal van − 25,4 ± 0,58 mV. De toename van de totale deeltjesgrootte werd voornamelijk toegeschreven aan de structurele belasting van ATRA; de uiteindelijke grootte van RD-LNF was echter minder dan 150 nm, waardoor bij voorkeur de kwaadaardige melanoomtumoren konden worden geaccumuleerd vanwege het EPR-effect. Bovendien zal de aanwezigheid van hydrofiel PEG de aggregatie van deeltjes voorkomen en de opname ervan door het reticulo-endotheliale systeem (RES) verminderen en daardoor de systemische prestaties in het lichaam verbeteren. De oppervlaktelading rond – 25 mV zorgt voor een uitstekende opslagstabiliteit. De deeltjesmorfologie werd onderzocht met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (Fig. 2). Zoals te zien is, zijn zowel D-LNF als RD-LNF perfect bolvormig en gelijkmatig verdeeld in het koperen rooster. Het verschil in grootte tussen D-LNF en RD-LNF was consistent met de DLS-waarneming. Gebrek aan deeltjesafval, kleine deeltjes en aggregatie duidt op het succes van het formuleringsproces.

Structuur van dacarbazine (DBZ) en all-trans-retinoïnezuur (ATRA). Schematische illustratie van DBZ/ATRA-geladen lipide nanoformuleringen wordt gepresenteerd. De lipide-nanoformulering werd bereid door middel van ultrasone trillingen. Zowel de DBZ als ATRA zijn hydrofobe moleculen met een molecuulgewicht van minder dan 300 g/mol. Verwacht wordt dat de hydrofobe moleculen zich concentreren in de kern van de nanodeeltjes die worden gestabiliseerd door een oppervlakteactieve stof

Morfologische analyse van D-LNF en RD-LNF met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Representatief beeld dat de nauwkeurige morfologie weergeeft, wordt gepresenteerd

Stabiliteitsanalyse en in vitro geneesmiddelafgifte van D-LNF en RD-LNF

De RD-LNF vertoonde een uitstekende stabiliteit bij zowel pH 7,4 (PBS) als serum (10% FBS) omstandigheden (figuur 3a). De deeltjesgrootte vertoonde geen significante toename in beide omstandigheden gedurende de onderzoeksperiode, wat wijst op de stabiliteit van nanodeeltjes. Het vermogen van medicijnafgifte op een tijdige manier bepaalt de effectiviteit van de met medicijnen beladen nanodeeltjessystemen. We hebben de afgiftekinetiek van DBZ en ATRA uit D-LNF en RD-LNF in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) uitgevoerd. Zoals weergegeven in figuur 3b, werd geen uitbarstingsafgifte of gefaseerde afgifte van het geneesmiddel waargenomen vanuit een van de systemen met twee nanodeeltjes, wat wijst op de stabiele belasting in de kern van de nanodeeltjes en niet in het oppervlak van de nanodeeltjes. Er werd geen significant verschil in de afgifte van DBZ waargenomen tussen D-LNF en RD-LNF, wat erop wijst dat de aanwezigheid van ATRA het afgiftepatroon van het geneesmiddel niet vertraagt of verandert. Een lichte vertraging in de geneesmiddelafgifte van DBZ uit RD-LNF kan worden toegeschreven aan de verhoogde padlengte die wordt toegeschreven aan de ATRA in de lipidenstructuur. Het is interessant om op te merken dat ATRA aanzienlijk langzamer vrijkomt in vergelijking met die van DBZ in het RD-LNF-draagsysteem. Significante verschillen begonnen te verschijnen na 24 uur tot 72 uur, voornamelijk toegeschreven aan de extreme hydrofobe aard van ATRA en als onderdeel van de structurele component. Over het algemeen zal het ontbreken van burst-afgifte en gecontroleerde afgifte van therapeutische componenten de behandeling van melanoomkanker ten goede komen.

een Stabiliteitsanalyse van RD-LNF in pH 7,4 en serum (10% FBS) omstandigheden. b In vitro geneesmiddelafgifte van DBZ uit D-LNF; en in vitro geneesmiddelafgifte van DBZ en ATRA uit RD-LNF. Het afgifteonderzoek werd uitgevoerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) gedurende een onderzoeksperiode van 72 uur. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviaties (n =4)

In vitro cellulaire opname

Hogere of verhoogde cellulaire opname van het nanodeeltje bepaalt de therapeutische werkzaamheid in de kankercellen. We hebben de cellulaire opname van RD-LNF in B16F10-kankercellen uitgevoerd en Coumarine-6 werd gebruikt als een fluorescerende tracker. Zoals getoond in Fig. 4, werd opmerkelijke internalisatie van nanodeeltjes waargenomen na 1 uur incubatie van nanodeeltjes en de opname nam consequent toe tot 3 uur. De opmerkelijke opname van lipidenanoformuleringen is consistent met de hogere cellulaire opname van het op lipiden gebaseerde dragersysteem. Er werd gespeculeerd dat het op passieve diffusie en endocytose gebaseerde mechanisme verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de hogere cellulaire opname. De nanodeeltjes na de endocytose zullen het lysosoom bereiken waar de ingekapselde medicijnen worden vrijgemaakt en hun respectieve farmacologische werkingen vertonen.

In vitro cellulaire opnameanalyse van B16F10-melanoomcellen. De kankercellen werden behandeld met RD-LNF en de incubatietijden werden gevarieerd van 1 uur tot 3 uur en de cellulaire opname werd geanalyseerd met behulp van een flowcytometer. De Coumarin-6 werd gebruikt als een fluorescerende tracker

In vitro cytotoxiciteitstest

MTT-assay werd uitgevoerd op B16F10-cellen na behandeling met respectieve formuleringen om het antikankereffect van individuele therapeutische middelen te evalueren (Fig. 5a). In eerste instantie werd de cytotoxiciteit van individueel vrij DBZ en ATRA geëvalueerd. DBZ vertoonde een concentratie-afhankelijk cytotoxisch effect in de melanoomkankercellen, terwijl ATRA een significant hoger cytotoxisch effect vertoonde in de B16F10-cellen. Bij 100 g/ml vertoonde DBZ een levensvatbaarheid van ~ 45% in vergelijking met ~ 22% cellevensvatbaarheid voor de ATRA, wat wijst op de uitstekende therapeutische werkzaamheid van ATRA. Om te bewijzen dat de gelijktijdige levering van DBZ en ATRA mogelijk de kankerprogressie zou kunnen remmen, werden met DBZ+ATRA geladen lipidenanoformuleringen (RD-LNF) behandeld voor melanoomcellen. DBZ-geladen lipide-nanoformuleringen (D-LNF) die het geneesmiddel met één entiteit bevatten, werden gebruikt als referentiegroep om de synergetische werkzaamheid van ATRA te benadrukken (figuur 5b). Zoals verwacht vertoonde ATRA bij 25 μg/ml vaste concentratie een iets lagere levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met die van DBZ, terwijl op nanodeeltjes gebaseerde D-LNF het antikankereffect van DBZ niet verbeterde en verre van effectief bleef. Zoals verwacht vertoonde RD-LNF een significant lagere levensvatbaarheid van de cellen en een hoger antikankereffect vergeleken met dat van D-LNF, wat wijst op een schijnbaar synergetisch therapeutisch effect van dubbele componenten op de melanoomkankerceldood. RD-LNF vertoonde een significant hoger antikankereffect vergeleken met dat van andere behandelingsgroepen. Het zou kunnen worden verwacht dat langzame en aanhoudende afgifte van DBZ samen met de langzame afgifte van ATRA uit het nanodragersysteem zou kunnen bijdragen aan het synergetische therapeutische effect. In deze studie was dacarbazine (DBZ) het belangrijkste chemotherapeutische medicijn en werd ATRA gebruikt als een structurele component van lipidenanodeeltjes, waardoor er geen aparte groep voor R-LNF werd gecreëerd. We hebben het antikankereffect van kale ATRA en DBZ in de kankercellen bestudeerd. Bovendien zijn veel gepubliceerde rapporten het bewijs voor het kankerbestrijdende effect van ATRA; daarom hebben we ATRA gebruikt als een structurele component die ook de werkzaamheid tegen kanker van ingekapselde therapieën op een synergetische manier zou kunnen verbeteren.

een In vitro cytotoxiciteitstest van vrij DBZ en ATRA op een concentratieafhankelijke manier. b In vitro cytotoxiciteit van vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF bij een vaste concentratie van 25 g/ml en 50 μg/ml

Kolonievormingstest

De kolonievormingstest werd uitgevoerd om het potentieel van tumorigenese van melanoomcellen te evalueren. Zoals aangetoond, spelen vrije DBZ en ATRA een beperkte rol bij het remmen van kolonievorming en evenzo was D-LNF niet effectief bij het beheersen van de kolonievorming (Fig. 6). Zoals verwacht resulteerde de combinatie van DBZ + ATRA in een significante versterking van de remming van kolonievorming in vergelijking met die van individuele vrije medicijnen of enkelvoudige medicijn-geladen nanodeeltjes. De kolonieformuleringstest herhaalt verder de superieure werkzaamheid tegen kanker van RD-LNF ten opzichte van vrije geneesmiddelen.

Effect van vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF op de kolonievorming. B16F10-cellen werden behandeld met respectievelijke formuleringen en kolonievorming werd gefotografeerd na kristalvioletkleuring

In vitro apoptose-assay en celcyclusanalyse

De apoptose-inductie van B16F10-cellen na behandeling met D-LNF en RD-LNF werd bestudeerd met behulp van een flowcytometer na het kleuren van de cellen met Annexine V-FITC / PI-mengsel (figuur 7a). Zoals aangetoond, veroorzaakten ATRA en DBZ slechts 10-12% van de apoptose van kankercellen en veel van de cellen blijven intact. Een lichte toename van vroege apoptotische cellen werd waargenomen na D-LNF-behandeling, wat zou kunnen wijzen op het effect van de afgiftedrager. Belangrijk is dat RD-LNF een groter aandeel apoptosecellen induceerde met een groter aandeel cellen in late apoptose en vroege apoptose, wat wijst op de superieure werkzaamheid tegen kanker van combinatorische nanodeeltjes. RD-LNF toonde aan dat late apoptose-cellen met 21,5% toenamen, terwijl vroege apoptose-cellen toenamen tot 18,3% en het aandeel levensvatbare cellen daalde van respectievelijk 95 tot 52%, wat suggereert dat de combinatie van DBZ + ATRA bijdroeg aan de apoptose van kankercellen en kon remmen de proliferatieve remming van B16F10-melanoomcellen. Het apoptose-effect van formuleringen werd verder bevestigd door celcyclusanalyse. Zoals getoond, vertoonden DBZ en ATRA een lichte toename van de sub-G0-populatie, terwijl D-LNF een relatief hogere sub-G0-populatie vertoonde in vergelijking met die van individuele vrije medicijnen (figuur 7b). Met name werd een opmerkelijke toename in de sub-G0-populatie waargenomen voor met RD-LNF behandelde melanoomcellen, wat wijst op de duidelijke apoptose van de kankercellen. Het is algemeen bekend dat DBZ de p21-, caspase-3- en gesplitste PARP-expressieniveaus zou kunnen verhogen en daardoor de celapoptose zou bevorderen door de stabilisatie van p53. De inductie van p53 zal de voortgang van de celcyclus remmen [24, 25]. De combinatie van DBZ + ATRA zal naar verwachting het apoptosemechanisme versterken en de celcyclusprogressie van kankercellen stoppen en de werkzaamheid tegen kanker vertonen.

een Illustratie van apoptose van B16F10-cellen na behandeling met vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF. De onbehandelde cellen werden als een geschikte controle beschouwd. De apoptose werd geanalyseerd met behulp van een flowcytometer. b Illustraties van celcyclusanalyse uitgevoerd in B16F10-cellen na behandeling met respectievelijke formuleringen

Effect van gecombineerde nanodeeltjes op celmigratie

De celmigratie werd geanalyseerd door het transwell-membraan en observeerde de migrerende cellen door kristalviolette kleuring (Fig. 8). Na 24 uur hadden controlecellen bijna de volledige migratie van kankercellen bereikt. ATRA lijkt celmigratie relatief beter te remmen dan met DBZ behandelde cellen. D-LNF vertoonde ook een opmerkelijk remmend effect op celmigratie; het meest opmerkelijke celmigratie-effect werd echter waargenomen in met RD-LNF behandelde B10F16-melanoomcellen. Zoals te zien was, werd een veelvoud afgenomen in celmigratie waargenomen in vergelijking met die van de niet-behandelde controlecellen. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat RD-LNF mogelijk de afwijkende kwaadaardige celproliferatie vermindert en celmigratie efficiënt onderdrukt.

Representatieve microfoto's van de celmigratietest van B16F10-cellen na behandeling met vrij ATRA, DBZ, D-LNF en RD-LNF en de kwantificering ervan

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing

Afkortingen

DBZ:: Dacarbazine
ATRA:: All-trans retinoïnezuur
D-LNF:: DBZ-geladen lipidenanoformuleringen
RD-LNF:: ATRA/DBZ-geladen lipidenanoformuleringen
SLN:: Vaste lipide nanodeeltjes

Hoogwaardige AlGaN dubbelkanaals HEMT's met verbeterde afvoerstroomdichtheid en hoge doorslagspanning Bindervrije elektroden en hun toepassing voor Li-Ion-batterijen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal