Voorstudies naar biologisch afbreekbare nanodeeltjes van zinkoxide gedoteerd met Fe als een mogelijke vorm van ijzerafgifte aan het levende organisme

Resultaten

Karakterisatie van nanodeeltjes

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) beelden van zoals gekristalliseerd in microgolf hydrothermisch proces ZnO:Fe nanokristallen worden getoond in Fig. 1. Het droge poeder dat na de synthese werd bewaard, werd in water gedispergeerd met behulp van een ultrasoonbad en vervolgens afgezet op de koperen 400 mesh. Suspensie als gevolg van de ultrasone behandeling werd 2 uur gelaten voor agglomeratie en sedimentatie van grote korrels. In het monster worden gewoonlijk ZnO-kristallen gezien in de vorm van langwerpige hexagonale prisma's. Kristallen zijn langwerpig in de richting van de groei van c-vlakken - [001]. Het snijpunt van prisma's is duidelijk te zien op de afbeelding:zeshoeken zijn 50-100 nm groot. In principe zijn nanodeeltjes geagglomereerd en vormen grotere structuren. In Fig. 1b wordt een dergelijke structuur van zwaar geagglomereerde en gegroepeerde ZnO:Fe-kristallen getoond. Het monster is ook samengesteld uit niet-uniforme korrels waarvan de grootteverdeling tussen honderden nanometers en micrometers bevat. Er is geen duidelijke indicatie van het bestaan ​​van een aparte, behalve de ZnO-fase, wat wijst op de afwezigheid van kristallisatie van de fase op ijzerbasis (bijv. ijzeroxide) [30].

Scanning-elektronenmicroscopiebeelden van ZnO:Fe NP's afgezet op kopergaas na sedimentatie van grote aggregaten. Vergroting 100 kx (a ) en 20 kx (b ). Suspensie met 1 mg ZnO-nanodeeltjes per milliliter water werd druppelsgewijs op het met polycarbonaat gecoate koperen gaas geplaatst om scanmicroscopie-waarnemingen met hoge resolutie mogelijk te maken

Thermogravimetrische analyse (TGA) en differentiële scanning calorimetrie (DSC) werden uitgevoerd onder de stroom van argon van kamertemperatuur tot 800 ° C en de verkregen resultaten worden getoond in Fig. 2. Het eerste massaverlies vond plaats tot 200 ° C en het veroorzaakte een afname van de monstermassa met 4,78% ten opzichte van de oorspronkelijke massa. Het tweede verlies werd geregistreerd tussen 200 en 400 ° C en de waarde is ongeveer 7,36%. Er waren geen andere massadalingen tot 800 °C. De eerste hield verband met de verdamping van aan het oppervlak geadsorbeerde watermoleculen en de tweede werd waarschijnlijk veroorzaakt door een reductie van hydroxylgroepen. DSC-curve toont endotherme piek bij 118,3 °C (− 0,6175 mW/mg, verdamping van water) en exotherme piek bij 283,1 °C (0,4356 mW/mg, ontleding van hydroxylgroepen). Een klein effect gerelateerd aan ontleding gaf aan dat bijna volledige kristallisatie van ZnO:Fe-nanodeeltjes plaatsvond in een hydrothermisch microgolfproces.

TGA/DSC van ZnO:Fe NP's verwarmd in argon

Figuur 3 toont fotoluminescentiespectra bij kamertemperatuur van ZnO:Fe NP's. Emissiespectrum (Fig. 3a) bestaat uit twee kenmerken:lage intensiteit narrow near band edge (NBE) luminescentie en zeer intense brede deep level emissie (DLE) luminescentie. De eerste piekt op ~ 380 nm, terwijl de tweede op 600 nm. Dominantie van DLE-intensiteit op het spectrum suggereert dat verkregen nanokristallen sterk defect waren op kristallografische niveau [31,32,33]. Excitatiespectrum (Fig. 3b) geeft het emissiemechanisme aan van diepe niveaus in de bandgap van ZnO:Fe.

Fotoluminescentie (PL) emissie (a , λ_exc =260 nm) en excitatie (b , _em =595 nm) spectra van ZnO:Fe NP's. Monsters werden losjes in de aluminiummatrix gegoten en vervolgens opnieuw gebalanceerd om PL-metingen mogelijk te maken. Tweede en hogere ordes van excitatiegolflengte werden gefilterd met spectrale banddoorlaatfilter

Kathodoluminescentiespectrum van ZnO:Fe NP's wordt getoond in Fig. 4; DLE/NBE-intensiteitsverhouding is ≈ 25. NBE-band piekt bij ca. 380 nm, DLE-band bevat vier componenten met een piek van ~ 570, 625, 653 nm en zeer zwak op 770 nm. Volgens McCluskey en Jokela [34] is de band van 570 nm gerelateerd aan zuurstofvacatures, terwijl andere werden toegewezen aan zinkvacatures in het wurtziet-type rooster [35].

Kathodoluminescentie (CL) spectrum van ZnO:Fe NP's. Droog nanopoeder werd gepelletiseerd om CL-spectrum te verkrijgen dat afkomstig was van een groot volume van het monster. Getoonde banden illustreren kwantiteit en kwaliteit van kristallografische defecten die aanwezig zijn in nanokristallen van zinkoxide

De hoeveelheid ijzer in het monster werd bepaald met behulp van twee technieken:atomaire absorptiespectroscopie (AAS) en energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX). In het geval van AAS werd de op dezelfde manier bereide suspensie als gebruikt in het knaagdierexperiment geanalyseerd om 3,98 atoom% Fe in het ZnO:Fe aan te geven. Met de EDX-methode werd droog poeder geanalyseerd in het kopergaas om te zien dat de ijzerconcentratie 4,5% bij was. in relatie tot de zinkionen.

De suspensie-eigenschappen werden gemeten met behulp van DLS- en TEM-methoden, met de verdeling van de diameters van nanodeeltjes weergegeven in Fig. 5. De verdeling is bimodaal:voor één populatie piekte de meest voorkomende diameter tussen 20 en 100 nm (TEM) en tussen 50 en 200 nm (DLS). De tweede populatie bevat een kleinere hoeveelheid grotere objecten 100-500 nm (TEM) en ca. 150-500 nm (DLS). Het bimodale karakter van nanodeeltjes wordt duidelijk waargenomen door beide getoonde methoden. Hoge spreiding van groottes in de grotere populatie geeft aan dat het overeenkomt met geagglomereerde nanodeeltjes. Statistieken getoond voor diameters boven 100 nm geven veel verschillende manieren aan waarop ZnO:Fe-nanodeeltjes agglomereren. De nanodeeltjes in watersuspensie waren negatief geladen, zoals blijkt uit zeta-potentiaal onder 0 V. Een waarde van ongeveer − 40 mV gaf ook aan dat de uiteindelijke watersuspensie stabiel was en nanodeeltjes geen affiniteit hadden voor agglomeratie.

Verdeling van de hydrodynamische stralen van nanodeeltjes zoals gemeten in watersuspensie (dots) en rechtstreeks genomen uit TEM-afbeeldingen langs kortere en langere zijden van de nanokristallen (zie tekst). Nanodeeltjes werden overgebracht naar watersuspensie door ultrasone hoorn met hoog vermogen. Concentratie van droog materiaal was 1 mg per 1 ml water. Nadat de sedimentatie was voltooid, werden tien mobiliteitsmetingen uitgevoerd om een ​​geloofwaardige grafiek van mobiliteit versus nanodeeltjesdiameter te verkrijgen. TEM-formaten zijn rechtstreeks uit afbeeldingen genomen:langs c as (langere zijden van ZnO-kristallen) en langs m en een assen (kortere zijden van kristallen)

In vitro toxicologische evaluatie van ZnO:Fe-nanodeeltjes

Beide cellevensvatbaarheidsanalyses (XTT en Trypan Blue) onthulden verminderde absorptie van Caco-2-cellen die waren geïncubeerd met ZnO:Fe NP's, wat direct correleerde met het aantal levensvatbare cellen. Statistisch significante veranderingen werden alleen waargenomen na 24-uurs blootstelling van geïncubeerde cellen aan de hoogste concentraties NP's (1,0 en 0,1 mg/ml), terwijl fysiologische niveaus van NP's-concentratie (0,01 en 0,001  mg/ml) geen significant effect hadden op celculturen (Fig. 6 en 7).

Levensvatbaarheid van de cellen (Caco-2-lijn) getest met de XTT-methode. Cellen werden 24 uur lang blootgesteld aan een suspensie van ZnO NP's gedoteerd met ijzer in verschillende concentraties als volgt:0,001 mg / ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; en 1 mg/ml. Resultaten vertegenwoordigen het gemiddelde percentage levensvatbare cellen (±SEM) voor controle- en experimentele groepen (n =4). Aanzienlijk verschil van **P ≤ 0,01 vs. controle werd gemarkeerd in de grafiek

Levensvatbaarheid van de cellen (Caco-2-lijn) getest met Trypan-blauwkleuring. Cellen werden 24 uur lang blootgesteld aan een suspensie van ZnO NP's gedoteerd met ijzer in verschillende concentraties als volgt:0,001 mg / ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; en 1 mg/ml. Resultaten vertegenwoordigen het gemiddelde percentage levensvatbare cellen (±SEM) voor controle- en experimentele groepen (n =3). Aanzienlijk verschil van **P ≤ 0,01 vs. controle werd gemarkeerd in de grafiek

IJzerdistributie in diermodel

Voor het beoordelen van een in vivo ijzertoegankelijkheid van ZnO:Fe NP's, muizen (n =4) oraal ontvangen suspensie van ZnO:Fe NP's en na 24 h werden de dieren geschoren met verdere verzameling van cruciale weefsels. Kwantitatieve evaluatie van het ijzergehalte in onderzochte weefsels werd geanalyseerd met de AAS-methode voor alle verzamelde organen en berekend met Micro Image-software (gebaseerd op Perl's kleuring) voor lever-, milt- en hersenweefsels. Gepresenteerd in Fig. 8, tonen de gegevens een verhoogd niveau van ijzergehalte (vs. controle) in hart-, skeletspier-, milt- en dunne darmweefsels 24 h na orale toediening van ZnO:Fe NP's (geen statistisch significante toename). In het geval van bot was het gemiddelde ijzergehalte in de experimentele groep slechts iets hoger dan in het controleresultaat. Het ijzergehalte in lever- en hersenweefsel was hoog significant verhoogd (P ≤ 0,01) 24 h na IG van ZnO:Fe NP's, vs. controlegroep (Fig. 8). In de nieren, het viscerale en onderhuidse vetweefsel en de longen daalden de Fe-spiegels 24  uur na toediening van ZnO:Fe NP's.

Verdeling van ijzer in geanalyseerde weefsels 24 uur na IG-toediening van ZnO:Fe NP's. Gegevens vertegenwoordigen een gemiddeld percentage Fe in geteste organen uit de experimentele groep (n = 4) vergeleken met de controlegroep (100%-horizontale lijn). Het ijzergehalte werd geanalyseerd met AAS. Aanzienlijk verschil van **P ≤ 0,01 vs. controle

Evaluatie van het ijzergehalte gekleurd met de methode van Perl in de lever onthulde een uiterst significante (P ≤ 0,001) verhoogd niveau van Fe bij alle experimentele versus controledieren (Fig. 9b). Evenzo toonden de resultaten verkregen voor de rode pulp van miltweefsel een extreem significante (P ≤ 0,001) toename van het ijzergehalte bij alle experimentele versus controledieren (Fig. 10b). Gegevens verkregen uit de analyse van hersenweefsel duidden op geen toename van Fe in de experimentele groep 24 uur na IG van ZnO:Fe NP's (Fig. 11b).

IJzergehalte in de lever berekend met Perl's kleuring en MicroImage-software. Resultaten berekend als een verhouding van gebied en intensiteit van ijzer-positieve vlekken tot het gebied van celkernen. Gegevens gepresenteerd als gemiddeld (±SEM) resultaat voor elk onderzocht dier (a ) en als gemiddelde (±SEM) waarde voor zowel controle- als experimentele groepen (b ). Aanzienlijk verschil van *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 en ***P ≤ 0,001

Iron content in the red pulp of the spleen calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens