Verbeterde pro-apoptotische effecten van in water gedispergeerde complexen van op 4-thiazolidinon gebaseerde chemotherapie met een PEG-bevattende polymere nanodrager

Materialen en methoden

Medicijnen tegen kanker

De heterocyclische 4-thiazolidinonenderivaten (verbindingen Les-3288 en Les-3833, Fig.1) werden gesynthetiseerd bij de afdeling Farmaceutische, Organische en Bioorganische Chemie van Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Oekraïne, zoals eerder beschreven [25].

Structuur van de onderzochte verbindingen - Les-3288 en Les-3833

Voor gebruik in celcultuur werden deze verbindingen opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO, Arterium, Lviv, Oekraïne). De oplossing werd bovendien gedurende 5 minuten in een kokend waterbad gehouden en verdund in gedestilleerd water om de werkconcentraties te bereiken. De eindconcentratie van het DMSO in kweekmedium was lager dan 0,1%. Dox is gekocht in een plaatselijke apotheek van een vertegenwoordiger van Pfizer (Italië) in Oekraïne.

Polymere nanodrager

De PNC voor medicijnafgifte werd gesynthetiseerd op de afdeling Organische Chemie van de Lviv Polytechnic National University, Oekraïne, met behulp van een eerder beschreven methodologie [26, 27]. Synthese van poly(VEP-co -GMA)-transplantaat-PEG werd als volgt via opeenvolgende stadia uitgevoerd. Poly(VEP-co -GMA) werd gesynthetiseerd door radicale copolymerisatie van 5-tert butylperoxy-5-methyl-l-hexeen-3-yne (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (peroxidemonomeer gesynthetiseerd met de beschreven methode [28]) en glycidylmethacrylaat (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich , VS) in ethylacetaat (7,9 ml) (Merck, Darmstadt, Duitsland) met azoisobutyronitril (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Duitsland) als de radicaalinitiator. Polymerisatie werd uitgevoerd bij 343K totdat de maximale omzetting van 65% was bereikt. Poly(VEP-co -GMA) werd gebruikt als de ruggengraat voor de bevestiging van zij-PEG-ketens via additiereacties van poly(ethyleenglycol)methylether (mPEG) met zij-epoxidegroepen. Boortrifluoride-etheraat (0,027 ml, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) werd toegevoegd aan de oplossing van copolymeer (1,0 g) in dioxaan (20 ml; Merck, Darmstadt, Duitsland) bij 313 K en 3 uur geroerd. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, VS) werd opgelost in dioxaan (15 ml) en de oplossing werd gemengd met de oplossing van ruggengraatpolymeer en 6 uur geroerd bij 313 K. Niet-gereageerde mPEG werd verwijderd met behulp van dialysezakken met poriegrootte van molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, VS). Resulterende kamachtige poly(VEP-co -GMA)-transplantaat-PEG werd bij kamertemperatuur onder vacuüm gedroogd tot constant gewicht. De structuren en enkele kenmerken van de PNC zijn weergegeven in Fig. 2 en werden eerder beschreven [29].

Schematische structuur van de PNC — poly(VEP-co- GMA)-transplantaat -PEG met de hoofdketen op basis van een co-polymeer van onverzadigd peroxide van 2-tert -butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in (VEP, aangeduid met “k”), met zijketens van glycidylmethacrylaat (GMA, aangeduid met “l”) en polyethyleenglycol (PEG, aangeduid met “m” )

Om de op water gebaseerde PNC-oplossingen te bereiden, werd 0,09 g PNC opgelost in 0,9 ml DMSO. Deze oplossing van PNC werd toegevoegd aan 8,0 ml 0,9% NaCl-oplossing. Vervolgens werd de oplossing 0,5 uur geroerd en gedurende 10 seconden gesoniceerd. Waterdispersies van de complexen werden verkregen door de DMSO-oplossing van 4-thiazolidinonen en PNC in de volgende volgorde in het water te druppelen:0,045 g PNC werd opgelost in 0,15 ml DMSO (Sigma-Aldrich, VS) en 0,0015 g Les -3288 (of Les-3833) werd opgelost in 0,10 ml DMSO. De oplossingen van PNC en 4-thiazolidinonen werden gemengd en toegevoegd aan 4,25 ml 1% waterige NaCl-oplossing en gedurende 10 seconden gesoniceerd.

Deze oppervlakteactieve PNC bevat de hydrofiele PEG-ketens die op de hydrofobe ruggengraat zijn geënt (figuur 2a). In waterige oplossingen vormt de amfifiele PNC micelachtige structuren die in water onoplosbare verbindingen (bijv. Geneesmiddelen) kunnen oplossen of deze verbindingen kunnen worden geadsorbeerd op het oppervlak van de nanodeeltjes, waardoor hun biocompatibiliteit wordt vergroot. De techniek die is ontwikkeld voor het verkrijgen van zeer stabiele waterdispersies van de op 4-thiazolidinon gebaseerde chemotherapeutica bestaat uit de kiemvorming van geneesmiddeldeeltjes op nanoschaal die optreedt wanneer de verdunde oplossingen in DMSO worden overgebracht naar de precipiterende zoutoplossing die polymere oppervlakteactieve stof PNC bevat die een polymeercoating voor de oppervlak van nanodeeltjes. Hierdoor werd door aggregatie en sedimentatie het complex gestabiliseerd en werd de dispersie voorkomen. Bovendien worden de nanoschaalcomplexen van 4-thiazolidinonderivaten beschermd tegen mogelijke interacties met de omringende biologische micro-omgeving. Door deze bescherming kunnen ze langer in het lichaam blijven zonder de stabiliteit te verliezen en zich ophopen in het doelweefsel of orgaan zonder negatieve bijwerkingen te veroorzaken. Een dergelijke modificatie zorgt dus voor een verbeterde aggregatie- en sedimentatiestabiliteit van waterdispersies van de nanodeeltjes tegen kanker.

De afmetingen van de polymeermicellen van PNC en van de complexen van PNC met heterocyclische 4-thiazolidinonen werden gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met behulp van een Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Duitsland) en DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, VS) en door fotoncorrelatiespectra met behulp van niet-invasieve back scatter (NIBS) -technologie bij 25 ° C. De monsters voor DLS-metingen werden bereid zoals hierboven beschreven en, indien nodig, verdund met dubbel gedestilleerd water, pH 6,5-7,0. Er werden drie tot vijf metingen gedaan voor elk monster (elke meting bestond uit 5 cycli en het bereik tussen metingen was 5 minuten). Figuur 3 toont de grootteverdeling van micellaire structuren van de PNC en de nanodeeltjes van de complexen van PNC met de heterocyclische 4-thiazolidinonen (Les-3833 en Les-3288) geanalyseerd door DLS. De grootte en morfologie van PNC-micellen en van met PNC gecoate 4-thiazolidinon-nanodeeltjes werden bestudeerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop JEM-200А (JEOL, Japan) bij een acceleratiespanning van 200 kV [30, 31]. De monsters werden bereid zoals hierboven beschreven, en indien nodig verdund met dubbel gedestilleerd water. Monsters werden bereid door de geteste oplossing op een substraat te sproeien door middel van het ultrasone dispergeermiddel UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Oekraïne), dat een uniforme coating op het substraat mogelijk maakt. Als substraat werd een dunne amorfe koolstoffilm afgezet op een koperen rooster gebruikt. De afmetingen en morfologie van PNC-micellen en de complexen met de heterocyclische 4-thiazolidinonen (Les-3288 en Les-3833) bestudeerd met de methoden van DLS en TEM worden weergegeven in Fig. 3.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beelden van de PNC (links) en complex van PNC + Les-3833 (rechts)

De DLS- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-onderzoeken toonden aan dat de grootte van PNC-micellen 50 ± 25 nm was en dat de nanodeeltjes gevormd door complexen van PNC met de heterocyclische 4-thiazolidinonen Les-3833 en Les-3288 140 ± 25 nm en 155 waren. ± 30 nm, respectievelijk. De dispersies van complexen van de PNC met 4-thiazolidinonderivaten zijn zeer stabiel en worden beschermd tegen aggregatie en sedimentatie door de geadsorbeerde PNC-schaal op het oppervlak van de thiazolidinon-nanodeeltjes. Zoals getoond in Fig. 4, zijn veranderingen in grootte van de nanodeeltjes gedispergeerd in het watersysteem verwaarloosbaar bij meerdere verdunningen met water, evenals na 6 maanden veroudering van de watersystemen van complexen van PNC met 4-thiazolidinonen.

DLS-studie van hydrodynamische diameters van PNC en complexen (a ) en afhankelijkheid van gemiddelde grootte van PNC-geneesmiddelcomplexen van dispersieverdunning (b ):waterdispersies van PNC (1), complexen van Les-3833+PNC (2) en Les-3288+PNC (3), evenals hydrodynamische afmetingen van Les-3833+PNC (1-3) en Les- 3288+PNC (4–6) dispersies na opslag gedurende 2 dagen (1.4), 4 maanden (2.5) en 6 maanden (3.6) (c )

Celcultuur

Gliomacellen van ratten van de C6-lijn werden verkregen van Cell Culture Collection van het Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Science of Ukraine (Kiev, Oekraïne). Cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's-medium (DMEM, Sigma, VS) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Sigma, VS). Cellen werden gekweekt in een CO₂ -incubator bij 37°C, 5% CO₂ , en 95% luchtvochtigheid. Het opnieuw zaaien van cellen werd eenmaal in 2-3 dagen uitgevoerd in een verhouding van 1:5.

Evaluatie van de cytotoxische werking van onderzochte stoffen

Cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes met een concentratie van 100.000 cellen/ml in één putje. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, VS). De onderzochte stoffen werden toegevoegd in concentraties van 0,1, 0,5 en 1,0 M na een aanpassingsperiode van 24 uur die begon na het zaaien van cellen. Celtelling werd met regelmatige tussenpozen uitgevoerd in de hemocytometrische telkamer met behulp van Trypan Blue-kleurstof (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, VS) bij een eindconcentratie van 0,01%, 2 minuten na toevoeging aan de celsuspensie . De dode cellen namen deze kleurstof op vanwege schade aan hun plasmamembraan.

Flowcytometrie

Voor het bestuderen van celcycli en apoptose werden C6-cellen behandeld met Les-3288, Les-3833 en hun complexen met PNC, evenals met PNC in vrije vorm, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4), gepelleteerd door centrifugatie bij 1000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C en opnieuw gesuspendeerd in koude PBS (2 miljoen cellen per 1 ml PBS). Vervolgens werden de cellen gefixeerd door het toevoegen van hoeveelheden van 4 ml absolute ethanol, afgekoeld tot -20°C onder voorzichtig mengen. De vaste monsters werden tot gebruik bij -20 °C bewaard (niet langer dan 1 week). Voor analyse door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) werden celmonsters gedurende 5 minuten bij 4°C bij 1000 rpm gecentrifugeerd, het supernatant werd weggegooid en de celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS. Honderd microliter DNase-vrij RNase (Sigma, VS) werd aan die suspensie toegevoegd en monsters werden 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd. Vervolgens werd elk monster aangevuld met 100 μl propidiumjodide (PI) (Sigma, VS, 1 mg / ml) en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ten slotte werden de monsters overgebracht naar plastic Falcon-buizen en werd de celsuspensie gevolgd met een FACSCalibur-flowcytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA, VS) en Summit v3.1-software (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) voor het meten van de parameters van celcycli en apoptose.

Meting van de Annexine V-positieve (apoptotische) cellen werd uitgevoerd met behulp van FACS-analyse. Rat-glioom C6-cellen werden behandeld met 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml en 1 mg/ml concentraties van PNC, Les-3288, Les-3833 en hun polymere conjugaten zoals aangegeven in de figuren. Aan het einde van het experiment werden de cellen losgemaakt van de bodem van de schaal met Trypsine-EDTA-oplossing, tweemaal gewassen met PBS en gekleurd met Annexin V-FITC met behulp van Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, VS) , volgens de instructies van de fabrikant. Gewassen cellen werden gedurende 15 minuten geïncubeerd in de annexine V-bindingsbuffer (BD Pharmingen), die 1/50 volume FITC-geconjugeerde annexine V-oplossing bevatte. Vervolgens werden de monsters tweemaal verdund met een geschikt volume van de Annexin V-bindingsbuffer en onmiddellijk gemeten op het FL1/FL2 (FITC-PI) kanaal van een flowcytometer (Becton Dickinson, VS). De enkele positieve Annexine V-cellen werden geclassificeerd als apoptotisch.

DNA-komeettest

De DNA-komeettest werd uitgevoerd onder alkalische omstandigheden. Tienduizend cellen werden gemengd in 75 l agarose met laag smeltpunt (0,5%) per monster. Na het mengen werd het monster gepipetteerd op een objectglaasje dat vooraf was bedekt met 1,5% normaal smeltpunt agarose. De monsters werden gedurende 18 uur bij 4 ° C geïncubeerd in lysis-oplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Om het afwikkelen van het DNA en de expressie van alkali-labiele schade mogelijk te maken, werden de objectglaasjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een alkalische oplossing geïncubeerd (uitgevoerd in het donker). Voor elektroforese (~ 74 V/cm gedurende 30 min), werden objectglaasjes overgebracht naar een horizontale kamer en 1x elektroforesebuffer (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH> -13) werd toegevoegd. De objectglaasjes werden gefixeerd in ijskoude, 100% methanol en gedroogd. Dia's werden gekleurd met 80 μL 1 x ethidiumbromide (EtBr) gedurende 5 minuten en vervolgens gedompeld in gekoeld gedestilleerd water om overtollige vlek te verwijderen. De DNA-kometen werden gevisualiseerd met behulp van een microscoop (Carl Zeiss, Duitsland) en de beelden werden geanalyseerd met behulp van de software 'CASP' (Casplab-1.2.3b2-software, CASPlab, Wroclaw, Polen). Per monster werden honderd kometen geteld. DNA-schade werd ingedeeld in vijf niveaus van genotoxiciteit volgens de grootte van de komeetstaart:0 (0-5% schade), 1 (5-25% schade), 2 (25-45% schade), 3 (45-70% schade ), en 4 (meer dan 70% schade) [32]. De schade-index (DI) werd berekend, zoals eerder beschreven [33].

DNA-intercalatietest met methylgroene kleurstof

De verbindingen Les-3288 en Les-3833 werden onderzocht op het vermogen om in het DNA-molecuul te intercaleren met behulp van de methylgroentest [34]. DNA van zalmsperma (10 mg/ml) werd gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd met 15 L methylgroene oplossing (1 mg/ml in H₂ O). De verbindingen werden toegevoegd met 1 μg / ml en gedurende 2 uur bij 37 ° C in het donker geïncubeerd. Het totale eindvolume van de monsters was 1 ml. Absorptie van methylgroen werd gemeten bij 630 nm, na monsterincubatie gedurende 2 uur bij 37 ° C, met behulp van een BioTek 76 883 meerkanaals microfotometer (BioTek, Winooski, VT, VS). EtBr werd gebruikt als een positieve controle.

Gegevensanalyse en statistieken

Alle experimenten werden drie keer herhaald met drie parallellen in elke variant. Variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor het vergelijken van groepen. Gegevens van de verdeling van C6-rattenglioomcellen in verschillende fasen van de celcyclus werden geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. Alle gegevens worden weergegeven als een gemiddelde ± SD. Een p waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Cytotoxisch effect (Trypan Blue Exclusion Test) van 4-thiazolidinonderivaten die in vrije vorm en in complex met de polymere nanodrager worden gebruikt

De resultaten van de Trypan Blue-exclusietest toonden aan dat de op water gebaseerde vormen van Les-3288- en Les-3833-complexen met de PNC een verhoogde toxiciteit hadden voor glioma C6-cellen (24 uur en 48 uur behandeling) vergeleken met de cytotoxiciteit die werd waargenomen bij het gebruik van de vrije vorm van deze verbindingen (Fig. 5 en 6). Het hoogste cytotoxiciteitseffect werd waargenomen bij doses van 0,1 en 0,5 M van Les-3288- en Les-3833-verbindingen in hun complexen met de PNC, terwijl bij de hoogste dosis (1,0 M) van deze verbindingen een verhoging van de complexering met de PNC werd gedetecteerd alleen in het geval van Les-3288 gedurende 24 uur (Fig. 5 en 6).

Aantal levende rattenglioom C6-cellen gemeten met Trypan blue-exclusietest na behandeling gedurende 24 uur en 48 uur met verschillende concentraties (0,1, 0,5 en 1,0 M) van Les-3288 alleen vergeleken met de werking van zijn complex met de polymere nanodrager ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 ( verschil met de controle, 100%)

Aantal levende rattenglioom C6-cellen gemeten met Trypan-blauw-exclusietest na behandeling gedurende 24 uur en 48 uur met verschillende concentraties (0,1, 0,5 en 1,0 M) van Les-3833 alleen vergeleken met de werking van zijn complex met de polymere nanodrager ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 (verschil t.o.v. de controle, 100%)

Complexatie van Les-3833- en Les-3288-verbindingen met polymere nanodrager verbetert hun pro-apoptotische activiteit in vitro naar rattenglioom C6-cellen

Er werden twee alternatieve benaderingen gebruikt om het modulerende effect van de PNC op het cytotoxische potentieel van de geselecteerde 4-thiazolidinonderivaten te beoordelen. Eerst werd celcyclusanalyse uitgevoerd om de impact van de geneesmiddel-PNC-complexen op celcycli te onderzoeken. Bovendien werd dubbele kleuring met annexine V/PI gebruikt om het exacte type celdood te onderscheiden dat door deze nanocomposieten wordt veroorzaakt.

Les-3288- en Les-3833-verbindingen in lage doses (0,1 g/ml en 0,5 g/ml) produceerden geen zichtbaar effect op de voortgang van de celcyclus of op de inductie van apoptose, zoals weergegeven in Fig. 7 en Tabel 1. Complexatie van beide verbindingen met de PNC verhoogden significant het aantal cellen in pre-G₁ fase (4-voudig voor Les-3288 en 6-voudig voor Les-3833), wat wijst op een grote boost van hun pro-apoptotische potentieel. Er moet worden benadrukt dat PNC in vrije vorm geen invloed had op celcycli of apoptose-inductie; dus de waargenomen verschijning van een grote populatie pre-G1-cellen onder behandeling met de thiazolidinon-nanodragercomplexen kan niet worden verklaard door een eenvoudig synergetisch effect van de PNC en de experimentele geneesmiddelen.

Impact op de voortgang van de celcyclus van 4-thiazolidinonderivaten Les-3288 en Les-3833 in vrije vorm en in complex met de polymere nanodrager (PNC) in C6-rattenglioomcellen. Propidiumjodide (PI) kleuring, flowcytometrie. R2, pre-G1; R3, G1; R4, S; R5, G2-fase. FL2-H, piekemissiewaarden van het tweede kanaal (585/40 filter) van flowcytometer

Om te bevestigen dat de waargenomen sub-G1-piek uit de apoptotische cellen bestaat, werden de resultaten van de Annexin V/PI-kleuringstest geanalyseerd. We hebben geen significante externalisatie van fosfatidylserine (hoofdmarker van vroege apoptose, gedetecteerd door FITC-geconjugeerd annexine V) waargenomen tijdens C6-glioombehandeling met lage (0,1 en 0,5 g/ml) en hoge doses Les-3288 (1,0 g/ml) , wat suggereert dat deze verbinding een zwakke inductor van apoptose is. In plaats daarvan vonden we een toename van de necrotische celpopulatie (van 1,2% in controle tot 11,25% voor Les-3288, 1,0 g/mL), wat erop kan wijzen dat Les-3288 op zijn minst gedeeltelijk necrotische celdood veroorzaakt. Complexering van Les-3288 met de PNC veranderde echter het werkingsmechanisme van dit medicijn volledig. Er was een enorme toename van het aantal vroeg-apoptotische (Annexin V(+)/PI(−)) en laat-apoptotische cellen (Annexin V (+)/PI(+)), terwijl de totale hoeveelheid puur necrotische cellen op peil bleef. het niveau van controle (onbehandelde) cellen (Fig. 8a). Het binden van Les-3288 met de PNC verhoogt dus niet alleen de pro-apoptotische activiteit ten opzichte van glioomcellen sterk, maar vermindert ook het potentiële pro-necrotische celdoodmechanisme. Deze bevindingen kunnen van cruciaal belang zijn voor de klinische praktijk, omdat de pro-necrotische geneesmiddelen niet worden aanbevolen voor gebruik vanwege een massale inductie van ontsteking die onhandig is voor patiënten.

Vergelijking van de pro-apoptotische activiteit van Les-3288 (a ) en Les-3833 (b ) verbindingen en hun complexen met de polymere nanodrager (PNC) naar rattenglioom C6-cellen. Annexine V/PI dubbele kleuring, flowcytometrie. PI, propidiumjodide

Verrassend genoeg zagen we niet hetzelfde effect voor het Les-3833+PNC-complex. In feite was de pro-apoptotische activiteit van het Les-3833+PNC-complex lager in vergelijking met Les-3288 in vrije vorm bij alle geteste concentraties (Fig. 8b). Zo'n drastisch verschil tussen beide verbindingen kan worden verklaard door de specificiteit van hun chemische structuur, en we speculeren dat in het geval van Les-3833 de structuur van het polymeer moet worden geoptimaliseerd om betere resultaten te bereiken.

Komeetanalyse van DNA-schade in rattenglioom C6-cellen veroorzaakt door 4-thiazolidinonderivaten in vrije vorm en gecomplexeerd met de PNC

Alkalische komeettest maakt de detectie van enkelstrengs DNA-breuken in alkalisch labiele DNA-plaatsen mogelijk. De verkregen resultaten werden geschat met behulp van de gemiddelde waarde van het Olive Tail Moment (OTM). Onze gegevens toonden aan dat behandeling van С6 rattenglioomcellen met Les-3288, Les-3833 en PNC (concentratie 0,5 g/ml) gedurende 3 uur (Fig. 9 en 10) geen significante DNA-schade veroorzaakte (OTM =0,7299 ± 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =respectievelijk 0,5846 ± 0,1078) vergeleken met de onbehandelde cellen in de controle (OTM =0,4541 ± 0,07273). Celbehandeling met het Les-3833 + PNC-complex (OTM =2,3880 ± 0,2212) veroorzaakte echter meer significante DNA-schade dan celbehandeling met de vrije vorm van Les-3833. Een dergelijke toename van de schade werd niet waargenomen voor de werking van het Les-3288+PNC-complex (Fig. 9 en 10).

DNA-schade werd geëvalueerd met behulp van het Olive-staartmoment in rattenglioom C6-cellen die gedurende 3 uur werden behandeld met experimentele antineoplastische verbindingen die werden gebruikt in een concentratie van 0, 5 g / ml. *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P € 0,001. PNC, polymere nanodrager; Dox, doxorubicine (positieve controle)

Aanwezigheid van DNA in komeetstaart van rattenglioom С6-cellen na 3 uur behandeling met (a ) controle (onbehandelde cellen), Les-3288 (b ), Les-3288+PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ) en doxorubicine (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Discussion

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Conclusions

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Afkortingen

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Doxorubicine

EtBr:

Ethidium bromide

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

PEG:

Polyethyleenglycol

PI:

Propidiumjodide

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in