Synthese en in vitro prestaties van met polypyrrool gecoate ijzer-platina nanodeeltjes voor fotothermische therapie en foto-akoestische beeldvorming

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van FePt@PPy NP's

Het syntheseproces van FePt NP's wordt geïllustreerd in Schema 1. De EDS-analyse van deze nanodeeltjes onthulde dat de uiteindelijke atomaire samenstelling van Fe en Pt respectievelijk 20 en 80% is (aanvullend bestand 1:figuur S1). Hydrofobe FePt NP's werden gemodificeerd met 3-MPA; dus worden ze hydrofiele FePt NP's met een gemiddelde grootte van 8,3 nm. De hydrofobe FePt NP's verspreiden zich in hexaan door de aanwezigheid van oliezuur en oleylamine op het oppervlak. De deeltjes worden echter oplosbaar in water na liganduitwisseling. FTIR-spectra van hydrofobe FePt-NP's en hydrofiele FePt-NP's onthulden de karakteristieke banden van absorptieliganden van oliezuur, oleylamine en 3-MPA op het oppervlak (Fig. 3; Schema 2) [14, 18]. De FTIR-gegevens (Fig. 2) samen met de goede oplosbaarheid van hydrofiele FePt NP's in water (Schema 1, stap 2) bevestigden het succesvolle liganduitwisselingsproces.

Schematische weergave van de synthese en toepassing van FePt@PPy NP's op fotothermische therapie en fotoakoestische beeldvorming

De FePt NP's werden gecoat met PPy door middel van chemische oxidatiepolymerisatie met behulp van (NH₄ )S₂ O₈ als oxidatiemiddel en PVA als stabilisator. De PPy-laag werd duidelijk waargenomen door TEM-beeldvorming (figuur 1c) met een dikte van ongeveer 10 nm, en de gemiddelde grootte van FePt@PPy NP's is 42 nm (figuur 1d). De FTIR van FePt@PPy NP's werd ook geïmplementeerd om de coating van PPy NP's te bevestigen door de FTIR-frequentieveranderingen te onderzoeken (figuur 3c). De karakteristieke pieken van PPy werden goed geanalyseerd in het vorige rapport [19]. De FTIR-trillingsbanden op 1620 en 1446 cm ⁻¹ werden toegewezen aan C–C en C=C rektrillingen van een PPy-ring. De band op 1236 cm ⁻¹ werd toegeschreven aan C–N-rektrillingen en de band op 1076 cm ⁻¹ duidde op de aanwezigheid van een C-N in-plane vervormingsmodus. Verder zijn de banden op 798 en 600 cm ⁻¹ werden toegeschreven aan respectievelijk C-H en N-H vervormingstrillingen in het vlak en C-H buitenste buigtrillingen. De FTIR zorgt samen met de TEM voor de succesvolle coating van PPy buitenste FePt NP's.

een TEM en b overeenkomstige grootteverdelingen van zuivere FePt NP's. c TEM en d overeenkomstige grootteverdelingen van FePt@PPy NP's

FTIR-spectra van (a) hydrofobe FePt NP's, (b) hydrofiele FePt NP's en (c) FePt@PPy NP's

De UV-Vis-NIR-spectra van zuivere FePt-, PPy- en FePt@PPy-NP's

Fotothermische verwarmingscurve van zuivere FePt NP's en FePt@PPy NP's met dezelfde hoeveelheid FePt. Alle oplossingen werden bestraald met een 1-W/cm ² 808-nm laser voor 6 min

een UV-Vis-NIR-spectra van verschillende concentraties FePt@PPy NP's. b Het fotothermische verval van FePt@PPy NP's met verschillende concentraties. c De bijbehorende NIR thermografische beelden van bestraalde monsters. Alle oplossingen werden bestraald met een 1-W/cm ² 808 nm laser gedurende 5 min

een Fotothermisch gedrag van 50 μg/ml FePt@PPy NP's gedurende 6 minuten onder een 808-nm laser bij verschillende vermogensdichtheden gehouden. b Het realtime temperatuurrecord van zes verwarmings-/afkoelcycli van 50 μg/ml FePt@PPy NP's onder een aan/uit-laserexperiment (1 W/cm ² ). c UV-Vis-NIR-spectra van FePt@PPy NP's voor en na bestraling

Levensvatbaarheid van de cellen (met MTT-assay) van MDA-MB-231-cellen die 48 uur zijn geïncubeerd met FePt en FePt@PPy NP's met verschillende concentraties

Percentage cellen dat leeft van de cellen die zijn behandeld met FePt@PPy NP's onder verschillende laservermogensdichtheden en verschillende bestralingstijd. een Bestraling werd gedurende 4 minuten uitgevoerd. b Er werd gedurende 6 min. bestraald

Helderveld- en fluorescentiebeelden van MDA-MB-231-cellen onder verschillende omstandigheden. een Controle. b Alleen laseren. c 50 μg/ml FePt@PPy NP's + laser. d 70 μg/ml FePt@PPy NP's + laser. e 100 μg/ml FePt@PPy NP's + laser. Alle oplossingen zijn bestraald met een 1 W/cm ² 808-nm laser voor 6 min

een Het optische beeld en de bijbehorende NIR thermografische beelden van de naakte muis vóór injectie van FePt@PPy NP's. b De linkerkant:het optische beeld van de naakte muis met subcutane injectie. De gestippelde rode cirkel geeft de plaats van de injectie aan. De rechterkant:het NIR-thermografische beeld van de naakte muis na 6 min bestraling met een 808 nm laser (1 W/cm ² ). Merk op dat de maximale verwarming overeenkomt met de injectieplaats. c Temperatuurverandering van het huidoppervlak op de injectieplaats en bij de muizen met bestraling met de 808 nm laser (1 W/cm ² ) gedurende 6 min

Experimentele opstelling van PAI-systeem

Evaluaties van PA-reacties van FePt@PPy NP's bij verschillende concentraties:a fantoom en b bijbehorende PA-beelden

De UV-Vis-NIR-absorptiespectra van zuivere FePt-, PPy- en FePt@PPy-NP's worden gegeven in Fig. 3. De sterke absorptie in het NIR-gebied werd waargenomen voor de samengestelde nanodeeltjes. De absorptiespectra van FePt en PPy kunnen samen bijdragen aan die van FePt@PPy NP's. De optische eigenschappen van FePt@PPy NP-waterige dispersies met verschillende concentraties (van 20 tot 120 μg/ml) werden ook vastgelegd met de UV-Vis-NIR-spectroscopie. Zoals weergegeven in figuur 4a, nam met een toename van de FePt@PPy NP-concentratie de fotoabsorptie-intensiteit van het gehele UV-Vis-NIR-gebied toe.

Fotothermische prestaties van FePt@PPy NP's

Het fotothermische gedrag van pure FePt en FePt@PPy NP's werd vergeleken in Fig. 4. Pure FePt en FePt@PPy NP's met de vaste FePt-hoeveelheid werden bestraald door een 808-nm laser met een vermogensdichtheid van 1 W/cm ² . FePt@PPy NP's vertoonden uitstekend fotothermisch gedrag in vergelijking met pure FePt NP's. Deze gegevens gaven aan dat de PPy-laag de fotothermische efficiëntie van het hele systeem verbeterde.

Zoals getoond in Fig. 5a, onder dezelfde NIR-laserconditie (5 min, 1 W/cm ² ), steeg de temperatuur van de oplossing met 20 g/ml FePt@PPy NP's van 25 tot 39,3 °C, terwijl die met 120 μg/ml FePt@PPy NP's snel 71 °C bereikte. Bovendien gaven thermografische afbeeldingen (figuur 5c) de fotothermische effectieve conversie aan van het monster dat bestraalde FePt@PPy NP's bevat met een 808-nm laser. FePt@PPy NP's (50 μg/ml) werden blootgesteld aan NIR-laserstraling bij verschillende laservermogensdichtheden van 0,5, 1,0 en 1,5 W/cm ² gedurende 6 minuten en de resulterende temperaturen waren respectievelijk 41,1, 51,3 en 59,4 ° C. Deze experimentele resultaten lieten zien dat de belichtingstijd, de concentratie van nanodeeltjes en de laservermogensintensiteit belangrijke parameters zijn die de fotothermische prestatie van FePt@PPy NP's significant beïnvloeden.

Fotothermische stabiliteitstesten van FePt@PPy NP's

Naast de sterke fotothermische transductie is de fotostabiliteit van nanodeeltjes belangrijk in PTT. FePt@PPy NP-oplossing van 50 μg/ml werd bestraald met de 808-nm NIR-laser bij 1,0 W/cm ² totdat de oplossing de hoogste temperatuur heeft bereikt en vervolgens op natuurlijke wijze afkoelt tot kamertemperatuur door de laser uit te schakelen. Na zes cycli van verwarming en koeling bleef de thermische curve van FePt@PPy NP's bijna hetzelfde voor elke cyclus (figuur 4d). De UV-Vis-NIR-spectra voor en na laserblootstelling worden getoond in Fig. 6c. Er werd geen significante verandering waargenomen voor de gehele spectra. De bovenstaande resultaten wezen op een goede fotothermische stabiliteit van FePt@PPy NP's voor een lange periode van NIR-laserbestraling.

Test voor langetermijnopslag

De deeltjesgrootte en de UV-Vis-NIR-absorptiespectra van de bereide nanodeeltjes werden gedurende de 30 dagen opslag gevolgd. Ten eerste werd er geen aggregatie waargenomen in alle oplossingen die FePt@PPy NP's bevatten (aanvullend bestand 1:figuur S3a). Ten tweede vertoonden FePt@PPy NP's in celkweekmedia bij een concentratie van 120 μg / ml geen significante verandering in de UV-Vis-NIR-spectra (aanvullend bestand 1:figuur S3b) na 30 dagen opslag. Bovendien bleef de gemiddelde deeltjesgrootte van FePt@PPy NP's bijna onveranderd tijdens de langdurige opslag (aanvullend bestand 1:figuur S3c). Alle bovenstaande resultaten bewezen duidelijk de stabiliteit van de bereide nanodeeltjes.

In vitro celcytotoxiciteitstest

Voor de behandeling van kanker moeten nanodeeltjes de uitstekende biocompatibiliteit hebben. Zoals getoond in Fig. 7, werden de MDA-MB-231 borstkankercellen behandeld met pure FePt en FePt@PPy NP's met verschillende concentraties en 48 uur geïncubeerd. Er werd geen significante cytotoxiciteit van de FePt@PPy NP's waargenomen, zelfs niet bij de hoogste geteste concentratie (120 μg/ml), en de cellevensvatbaarheid van MDA-MB-231-borstkankercellen was nog steeds hoger dan 95%. Voor de pure FePt NP's doodden 120 μg / ml bestraalde nanodeeltjes 20% kankercellen. Dit resultaat gaf aan dat de coating van de PPy-laag de biocompatibiliteit van FePt NP's verbeterde, en FePt@PPy NP's kunnen worden beschouwd als een niet-toxisch materiaal.

Cellulaire opname

Pruisische blauwe kleuring, die gebaseerd is op de reactie van ijzer en kaliumferrocyanide in zure oplossing, werd uitgevoerd om de cellulaire opname van FePt@PPy NP's te detecteren. Zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2 waren de meeste cellen gekleurd met blauwe vlekken in de cellen, wat wijst op cellulaire opname van FePt@PPy NP's.

In vitro fotothermische therapie

De standaard MTT-assay werd uitgevoerd om de werkzaamheid van bestraalde FePt@PPy NP's op het dodende vermogen van MDA-MB-231-borstkankercellen te evalueren. Eerst werden de kankercellen 24 uur geïncubeerd met verschillende concentraties FePt@PPy NP's en vervolgens blootgesteld aan de 808-nm laser bij 1 W/cm ² gedurende 4 minuten. Zoals weergegeven in figuur 8, nam het percentage levensvatbaarheid van de cellen geleidelijk af wanneer de concentratie van de behandelde nanodeeltjes werd verhoogd. Ongeveer 50% van de cellen stierf bij een concentratie van 100 μg/ml bestraalde FePt@PPy NP's. Om meer kankercellen te doden, werd de bestralingstijd verlengd tot 6 min. Met een concentratie van 100 μg / ml werd ongeveer 70% van de dode cellen waargenomen. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.