Endotheelcellen targeten met multifunctionele GaN/Fe-nanodeeltjes

Resultaten en discussie

Multifunctionele magnetische nanodeeltjes zijn vervaardigd door een GaN-laag te laten groeien op offernanodeeltjes van ZnO gelegeerd met Fe₂ O₃ . Na groei van de GaN-laag met behulp van hydride dampfase-epitaxie (HVPE), wordt de ZnO-kern ontleed. De resulterende chemisch stabiele nanodeeltjes bestaan ​​voornamelijk uit een GaN-schaal met magnetische eigenschappen die kunnen worden toegeschreven aan de diffusie van ijzeratomen in het afgezette GaN en aan de aanwezigheid van Fe-atomen in de dunne film van ZnO gelegeerd met Fe₂ O₃ op het binnenoppervlak van de GaN-schaal. Deze nanodeeltjes zijn onderzocht met behulp van elektronenmicroscopie. Na het HVPE-groeiproces van GaN blijven de enkelkristallijne nanodeeltjes met transversale afmetingen variërend van 20 tot 100 nm ruimtelijk gescheiden (figuur 1). De resultaten van röntgendiffractie en Raman-spectroscopiekarakterisering (Fig. 1c, d) van de nanodeeltjes voor en na GaN-groei tonen de ontbinding van de ZnO-kern en de vorming van GaN-nanodeeltjes aan. Chemische analyses van de nanodeeltjes uitgevoerd met behulp van energiedispersieve röntgenanalyse (EDX) bevestigen de groei van de GaN-laag en de ontbinding van de ZnO-kern (Fig. 1e, f). Merk op dat het resulterende materiaal een relatief hoge (ongeveer 50%) concentratie van Fe vertoont in vergelijking met de initiële nanodeeltjes.

Analyse van nanodeeltjes. een SEM-foto van GaN-nanodeeltjes gekweekt op offernanodeeltjes van ZnO gelegeerd met Fe₂ O₃ . b TEM-beeld van de resulterende GaN/Fe-nanodeeltjes. c XRD-patroon van initiële ZnFe₂ O₄ nanodeeltjes en resulterend GaN/ZnFe₂ O₄ nanodeeltjes. d Raman-spectra van de initiële en resulterende nanodeeltjes na GaN-groei. e EDX-analyse van ZnO gelegeerd met Fe₂ O₃ nanodeeltjes. v EDX-analyse van resulterende nanodeeltjes na de groei van de GaN-laag

Op GaN/Fe gebaseerde nanodeeltjes werden geïncubeerd met primaire endotheelcellen van de varkensaorta. Zoals eerder werd aangetoond, worden GaN-nanodeeltjes door de endotheelcellen getolereerd in concentraties van minder dan 100 μg/ml [5]. Tijdens het incubatieproces nemen endotheelcellen de meerderheid van de nanodeeltjes in het omringende kweekmedium op, terwijl de celmigratie en proliferatie behouden blijven. Desalniettemin merkten we enige afname van het aantal levensvatbare cellen op met een toename van de concentratie van nanodeeltjes in de kweekmedia. Deze tendens wordt bevestigd door de resultaten van de XTT-test weergegeven in Fig. 2.

Impact van nanodeeltjes op de levensvatbaarheid van cellen. Concentratieafhankelijke XTT-reductie gemeten na 1 dag cellen geïncubeerd met verschillende concentraties nanodeeltjes. Het aantal cellen dat aan het einde van de XTT-assay wordt geteld, wordt uitgedrukt in verhouding tot onbehandelde cellen. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie van twee onafhankelijke experimenten met zes herhalingen

Om te begrijpen hoe GaN/Fe-nanodeeltjes interageren met cellen en om hun lokalisatie binnen cellen te identificeren, hebben we een grondige morfologische analyse uitgevoerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Na incubatie van aorta-endotheelcellen van varkens met 50 g / ml nanodeeltjes gedurende 1 dag, bleken de nanodeeltjes gelokaliseerd te zijn in blaasjes in de cellen (figuur 3a). Er werden geen nanodeeltjes gevonden in het cytoplasma of in de celkern. Het opnameproces van nanodeeltjes wordt weergegeven in Fig. 3b-d. De meeste nanodeeltjes worden door cellen opgenomen via een van de klassieke opnameroutes, namelijk door micropinocytose, clathrine-gemedieerde endocytose of caveolin-gemedieerde endocytose [9]. Het internalisatieproces hangt af van het celtype en de lokale cellulaire omgeving, evenals van de fysiochemische eigenschappen van het deeltje zelf (bijv. grootte, vorm, oppervlaktelading). In het geval van endotheelcellen werd gemeld dat caveolin-gemedieerde endocytose een grotere invloed heeft op de opname van nanodeeltjes dan andere mechanismen vanwege de overvloed aan caveolin in dit celtype [10, 11].

TEM-foto's genomen van een enkele endotheelcel geïncubeerd met GaN / Fe-nanodeeltjes. een Verspreiding van nanodeeltjes in cellulaire blaasjes. b –d Het opnameproces van nanodeeltjes in blaasjes. Rode pijlen duiden nanodeeltjes aan die donkerder lijken in TEM vanwege de hoge atomaire dichtheid in vergelijking met biologische media

Vanwege de bovengenoemde opname van een grote hoeveelheid Fe, vertonen de resulterende nanodeeltjes ferromagnetisme, samen met piëzo-elektriciteit die inherent is aan GaN-halfgeleidermateriaal [12, 13]. Deze twee fundamentele eigenschappen kunnen worden gebruikt voor het op afstand activeren van sommige processen in de nanodeeltjes en/of hun gecontroleerde geleiding en ruimtelijke distributie in relevante media. Piëzo-elektrische eigenschappen kunnen worden gebruikt om elektrische polarisatie in GaN-nanodeeltjes te induceren, bijvoorbeeld door een toegepast ultrageluidveld. Op deze manier kan men elektrische signalen naar de cellen sturen om specifieke cellulaire processen te activeren of te remmen. Wat betreft de magnetische eigenschappen die worden verleend door het Fe-gehalte, ze stellen iemand in staat om dynamische visualisatie en controle van de ruimtelijke positie van cellen te bereiken. Om de laatste mogelijkheid experimenteel aan te tonen, werden endotheelcellen gedurende 3 dagen geïncubeerd in EGM ™-2-medium aangevuld met 50 μg / ml GaN / Fe-nanodeeltjes (tot 70-80% celconfluentie). Vervolgens werden de cellen losgemaakt van het oppervlak en opnieuw gesuspendeerd in EGMTM-2. Merk op dat het losmaken van cellen met TrypLE™ Select en centrifugatie de levensvatbaarheid van de cellen niet hebben beïnvloed en ook niet hebben geleid tot het vrijkomen van nanodeeltjes uit de cellen (gegevens niet getoond). Onmiddellijk na het zaaien werden de cellen geïncubeerd in een standaard incubator bij 37 ° C onder 5% CO₂ , waar de kweekplaat op permanente magneten werd geplaatst. Figuur 4 toont de verdeling van met nanodeeltjes beladen endotheelcellen in aanwezigheid en afwezigheid van een magnetisch veld. Figuur 4a toont met nanodeeltjes beladen cellen die zijn geïncubeerd in de afwezigheid van een magnetisch veld, terwijl in figuur 4b endotheelcellen zonder nanodeeltjes worden geïncubeerd in een magnetisch veld. Deze afbeeldingen laten in beide gevallen een willekeurige verdeling van cellen zien. Incubatie van met nanodeeltjes beladen cellen in een magnetische veldgradiënt leidt tot een vooraf ontworpen verdeling van cellen in bepaalde gebieden, in overeenstemming met de magnetische veldkaart. Figuur 4c toont cellen in de kweekplaat na 1 dag incubatie in het magnetische veld gegenereerd door zeven zeldzame aarde neodymium ronde magneten met een diameter van 5 mm en een dikte van 1 mm. Figuur 4d illustreert de celverdeling na incubatie in het magnetische veld dat wordt gegenereerd door een enkele ringvormige magneet met een diameter van 7 mm en een dikte van 1 mm. In beide gevallen werden de magneten onder de kweekplaat geplaatst.

Begeleiding van met nanodeeltjes beladen endotheelcellen met behulp van een magnetisch veld. De controlegroep toont de ruimtelijke verdeling van a endotheelcellen gericht met nanodeeltjes en geïncubeerd in de afwezigheid van magnetisch veld en b nanodeeltjesvrije endotheelcellen geïncubeerd in een magnetisch veld. c , d De verdeling van endotheelcellen die het doelwit zijn van nanodeeltjes na 1 dag incubatie in een magnetisch veld