FePO₄ Nanodeeltjes: Biocompatibele Dragers voor Doxorubicine Levering, RNA Stabilisatie en Verbeterde Antikankeractiviteit

Samenvatting

FePO₄ nanodeeltjes combineren biocompatibiliteit, hoge biobeschikbaarheid, magnetische responsiviteit en superieure sensorische eigenschappen, wat ze ideaal maakt voor voedselverrijking, biomedische beeldvorming en medicijnlevering. In deze studie ontwikkelden we FePO₄ als drager voor het antikankermiddel doxorubicine (DOX), met een optimale medicijnlading van 26,81 ± 1,0 %. De resulterende FePO₄-DOX deeltjes vertoonden uniforme grootteverdeling, concentratie-afhankelijke biocompatibiliteit (>70 % viabiliteit tot 80 µg/mL) en een dramatische 10-voudige toename in cytotoxiciteit vergeleken met vrij DOX, met verbeterde selectiviteit voor kankercellen. Bovendien stabiliseerden FePO₄ nanodeeltjes RNA en behielden mRNA-vertalingsactiviteit, wat hun potentie als multifunctionele leveringsplatforms voor therapeutische nucleïnezuren onderstreept. Deze bevindingen benadrukken de veelzijdigheid van FePO₄ deeltjes voor veilige medicijn- en RNA-levering en hun belofte in voedselverrijkingstoepassingen.

Inleiding

Onder anorganische nanomaterialen vallen ijzer-gebaseerde nanodeeltjes (Fe-NPs) op door hun magnetische eigenschappen, endogene metabolisme en FDA-goedgekeurde toepassingen in contrastbeeldvorming, medicijnlevering en hyperthermie. FePO₄ nanodeeltjes, in het bijzonder, vertonen uitstekende biocompatibiliteit, hoge orale biobeschikbaarheid en minimale organoleptische impact, wat ze aantrekkelijk maakt voor preventie van ijzerdeficiëntie-anemie door voedselverrijking. Hun opname in darmcellen geschiedt primair via divalente metaaltransporter-1 (DMT-1), wat efficiënte absorptie garandeert. Naast beeldvorming biedt FePO₄ een chemisch eenvoudige, schaalbare synthese-route die monodisperse deeltjes met gecontroleerde oppervlaktelading oplevert, wat robuuste medicijnlading en nucleïnezuurstabilisatie mogelijk maakt. Dit werk verkent FePO₄ als medicijnleveringsvoertuig voor DOX en als stabilisator voor RNA, met als doel een enkel platform te demonstreren dat zowel therapeutische als voedingsbehoeftes adresseren.

Resultaten en Discussie

FePO₄ Nanodeeltjes Synthese, Karakterisering en Biocompatibiliteit

FePO₄ werd gesynthetiseerd via een eenvoudige co-precipitatie van ammoniumfosfaat en ijzer(III) nitraat, gevolgd door dispersie in DSPE-PEG-COOH om aggregatie te voorkomen. Dynamische lichtverstrooiing onthulde een hydrodynamische diameter van 175 ± 5 nm met een polydispersiteitsindex van 0,15 ± 0,01, wat uitstekende groottehomogeniteit aangeeft. Zetapotentiaalmetingen toonden een negatieve oppervlaktelading van −19,1 ± 8 mV, wat proteïne-opsonisatie vermindert en circulatiettijd verlengt. FTIR-spectra bevestigden de aanwezigheid van PO₄³⁻ groepen en afwezigheid van precursorresten, wat productzuiverheid verifieerde. MTT-assays op muis-osteosarcroom K7M2 en fibroblasten NIH/3T3 cellen toonden concentratie-afhankelijke viabiliteit, met >70 % celoverleving tot 80 µg/mL, wat de biocompatibiliteit van FePO₄ NPs binnen een therapeutisch relevant venster bevestigt.

Karakterisering van FePO₄ nanodeeltjes: a Grootteverdeling; b Zetapotentiaal; c FTIR-spectra; d Biocompatibiliteit over cellijnen (gemiddelde ± s.d.; n = 3–6).

Doxorubicine Lading en Verbeterde Cytotoxiciteit van FePO₄-DOX

DOX werd geïncorporeerd via co-incubatie met Fe(NO₃)₃ gevolgd door neerslag met (NH₄)₃PO₄, wat een ladingsefficiëntie van 26,81 ± 1,0 % opleverde. Het Fe³⁺–DOX-complex vormt zich tijdens deze stap, bevestigd door een kleurverschuiving van geel naar bruin en ongewijzigde fluorescentie-emissie (590 nm). De hydrodynamische grootte bleef 187 ± 7 nm, terwijl de oppervlaktelading verschuifde naar −8,89 ± 5 mV, wat de kationische aard van het gebonden DOX weerspiegelt. Cytotoxiciteitsassays onthulden een 10-voudige reductie in IC₅₀ waarden vergeleken met vrij DOX (NIH/3T3: 0,248 µM vs. 2,61 µM; K7M2: 0,107 µM vs. 1,01 µM). Belangrijk is dat de FePO₄-DOX nanodeeltjes >70 % viabiliteit behielden bij equivalent FePO₄ concentraties, wat aangeeft dat de verbeterde cytotoxiciteit voortkomt uit Fe³⁺-DOX complexatie in plaats van nanodeeltjestoxiciteit. De selectieve dood van kankercellen boven fibroblasten werd ook versterkt, met een 19 % verschil in viabiliteit bij 0,1 µM DOX equivalent.

Doxorubicine ladingsefficiëntie en fysicochemische veranderingen in FePO₄-DOX: a Ladingsefficiëntie over formuleringen; b Kleurovergang; c Emissiespectra; d Grootteverdeling; e Zetapotentiaal (gemiddelde ± s.d.; n = 3).

Cytotoxiciteit van FePO₄-DOX versus vrij DOX in NIH/3T3 en K7M2 cellen: a,b Celviabiliteit na 48 u; c,d IC₅₀ vergelijking (gemiddelde ± s.d.; n = 6).

Cellulaire Internalisatie van FePO₄-DOX Nanodeeltjes

Confocale microscopie van K7M2-cellen onthulde verwaarloosbare opname bij 0,5–1 u, gevolgd duidelijke intracellulaire fluorescentie bij 3 u, vergelijkbaar met vrij DOX. Het tijdsafhankelijke internalisatieprofiel demonstreert dat FePO₄-DOX nanodeeltjes DOX effectief in kankercellen kunnen leveren binnen een klinisch relevant tijdsbestek, terwijl de magnetische eigenschappen van FePO₄ potentiële theranostische toepassingen mogelijk maken.

Tijdscursus internalisatie van FePO₄-DOX versus vrij DOX in K7M2-cellen (0,5, 1, 3 u). Rode fluorescentie geeft succesvolle nanodeeltjesopname aan.

RNA Stabilisatie en Functionele Expressie

FePO₄ nanodeeltjes beschermen model-RNA tegen hydrolyse en nucleasen, zoals bewijs door intacte banden op RNA-agarosegel-electroforese (RAGE) na incubatie in water en serum. Integenstelling versnelden koper en koolstofnanobuizen-nanodeeltjes afbraak. Functionele assays met luciferine-coderende mRNA toonden aan dat FePO₄ vertaalefficiëntie behield, met een twee-voudige toename in luminescentie ten opzichte van controle, terwijl koper-nanodeeltjes expressie verminderden. Deze resultaten benadrukken FePO₄ als robuuste RNA-stabilisator die biologische activiteit behoudt, wat het positioneert als kandidaat voor mRNA-gebaseerde therapeutica en vaccins.

RNA stabilisatie en vertaling: a Afbraakassay in water; b Stabiliteit in serum; c Luciferase-expressie met FePO₄ versus koper-nanodeeltjes.

Conclusie

FePO₄ nanodeeltjes, gesynthetiseerd via een eenvoudige co-precipitatie en PEGylatiestrategie, vormen monodisperse deeltjes (~175 nm) met een stabiele negatieve oppervlaktelading. Ze vertonen hoge biocompatibiliteit (>70 % viabiliteit tot 80 µg/mL) en efficiënte DOX-lading (26,8 %). FePO₄-DOX nanodeeltjes leveren verbeterde cytotoxiciteit (10-voudige IC₅₀ reductie) en verhoogde selectiviteit voor kankercellen. De deeltjes stabiliseren ook RNA tegen hydrolyse en behouden mRNA-vertalingsactiviteit, wat hun dubbele rol als medicijn- en nucleïnezuurdragers valideert. Deze attributen maken FePO₄ nanodeeltjes een overtuigend platform voor therapeutische levering en voor het verrijken van voedsel met ijzer en bioactieve stoffen.

Methoden

Synthese en Karakterisering van FePO₄ Nanodeeltjes

FePO₄ nanodeeltjes werden geproduceerd door equimolaire oplossingen van ammoniumfosfaat (16 mg/mL) en ijzer(III) nitraat (8 mg/mL) te mengen onder constant roeren, gevolgd door centrifugatie en wassen om residuele precursoren te verwijderen. Het resulterende neerslag werd gedispergeerd in DSPE-PEG-COOH (10 % w/w) om stabiele nanodeeltjes te genereren. Grootte en zetapotentiaal werden gemeten met DLS; chemische identiteit bevestigd door FTIR.

Doxorubicine Lading

DOX (100 µg) werd toegevoegd aan Fe(NO₃)₃ of (NH₄)₃PO₄ oplossingen voor neerslag om complexatie met Fe³⁺ te bereiken. De resulterende FePO₄-DOX deeltjes werden driemaal gewassen en gekwantificeerd door fluorescentiespectroscopie (excitati 490 nm, emissie 595 nm). Ladingsefficiëntie berekend als ((DOX in NPs – DOX in supernatans)/initiële DOX) × 100.

Biocompatibiliteit en Cytotoxiciteitsassays

Muis-osteosarcroom K7M2 en fibroblasten NIH/3T3 cellen werden gezaaid bij 10.000 cellen/put in 96-putplaten, behandeld met FePO₄ of FePO₄-DOX (20–600 µg/mL) gedurende 48 u, en viabiliteit beoordeeld door MTT (550 nm). Cellijnen werden ook blootgesteld aan vrij DOX (0,05–5 µM) voor vergelijkende cytotoxiciteit.

Cellulaire Internalisatie

Voor confocale beeldvorming werden K7M2-cellen (12.000 cellen/put) behandeld met 5 µg/mL DOX of FePO₄-DOX gedurende 0,5, 1 en 3 u, gefixeerd, gekleurd met DAPI, en geïmageerd op een Zeiss LSM-700. DOX-fluorescentie (560 nm) werd gebruikt om intracellulaire opname te volgen.

RNA Stabiliteit en Expressie

Torula-gist RNA (1 mg/mL) werd geïncubeerd met 20 µg/mL Cu, FePO₄, Ag, CNT of ZnO nanodeeltjes bij 37 °C en in de loop van de tijd gemonitord door RAGE. Voor serumstabiliteit werd RNA geïncubeerd in 10 % FBS/DMEM. Luciferine-coderende mRNA werd vertaald in konijnen-reticulocytelysaat met of zonder 20 µg/mL FePO₄ of Cu-nanodeeltjes, en luminescentie gemeten met een Biotek Synergy H1 lezer.

Statistische Analyse

Data vertegenwoordigen ten minste drie onafhankelijke experimenten, uitgedrukt als gemiddelde ± s.d. Viabiliteitsdata afgeleid van zes technische replicaten.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets die deze studie ondersteunen, zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek.