Hersen-gerichte polysorbate-80 geëmulsigde donepezil nanopartikelen: een nieuwe neuroprotectieve strategie

Samenvatting

Behandelingen van Alzheimer (AD) bereiken vaak geen therapeutische concentraties in de hersenen door de bloed-hersenbarrière (BBB). We hebben een cholesterolf gemodificeerde pullulan (CHP) nanopartikel geladen met de acetylcholinesterase remmer donepezil (DZP) en het oppervlak gecoat met polysorbate 80 (PS) om actieve BBB-transcytose te bereiken. Met dynamische lichtverstrooiing en isotherme titratie calorimetrie identificeerden we een 1:5 (w/w) DZP:CHP verhouding als optimaal, met hoge geneesmiddel-inclusie (86,5%) en lading (13,4%). In vitro vrijgiftestudies toonden sustained DZP-vrijgifte over 72 uur. In vivo fluorescentie imaging in muizen bevestigde dat PS-gecoate nanopartikelen preferentieel in hersenweefsel accumuleren, met verwaarloosbare off-target orgaan depositie. Functionele assays in PC12 en SH-SY5Y cellen, pre-behandeld met Aβ25–35, toonden aan dat DZP-CHP nanopartikelen cellevensvatbaarheid herstelden, lactaatdehydrogenase (LDH) lekkage reduceren, mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) behielden en apoptose meer effectief remden dan vrij DZP. Micro-thermoforese toonde sterke ApoE binding (K_D = 3,6 µM), wat receptor-gemedieerde BBB-transport aangeeft. Deze resultaten ondersteunen het klinische potentieel van PS-gecoate DZP-CHP nanopartikelen voor getargete neuroprotectie in AD.

Inleiding

AD wordt gekenmerkt door progressieve cognitieve afname en amyloïde-β (Aβ) depositie. Conventioneel oraal donepezil lijdt aan slechte wateroplosbaarheid, lage orale biobeschikbaarheid en beperkte BBB-penetratie, wat dagelijkse dosering noodzakelijk maakt en patiëntadherentie ondermijnt. Nanopartikel geneesmiddelafgiftesystemen (nano-DDS) bieden een veelbelovend platform om deze hindernissen te overwinnen door passieve diffusie en receptor-gemedieerd transport over de BBB te faciliteren. Polysorbate 80, een non-ionisch surfactant, is aangetoond om serum apolipoproteïnen (ApoE, ApoB) te adsorberen, waarbij laag-dichtheid lipoproteïne deeltjes nagebootst worden die LDL-receptoren op endotheelcellen kunnen "hijacken" en de BBB passeren. Cholesterolf gemodificeerde pullulan (CHP) self-assembleert in amphifiele nanopartikelen met een hydrofoob kern geschikt voor encapsulatie van lipofiele geneesmiddelen en een hydrofiel schil dat opsonisatie vermindert.

In deze studie combineerden we CHP en PS om een dubbel-functionele nanopartikel te creëren die DZP encapsuleert, BBB-overstek bevordert en sustained therapeutische niveaus in de hersenen levert terwijl Aβ-toxiciteit in vitro gemitigeerd wordt.

Materialen en methoden

Materialen

CHP (eigen preparaat), donepezil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.), polysorbate 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute), indocyanine groen (ICG) kleurstof (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.), zwarte C57BL/6 muizen, Aβ25–35 (US Sigma), MTT reagent (US Sigma), lactaatdehydrogenase (LDH) kit (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), AO/EB kleurstofkit (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.), PC12 (rat adrenal feochromocytoma) en SH-S5Y (humane neuroblastoom) cellijnen (ATCC).

Nanopartikel bereiding

Drie DZP:CHP verhoudingen (10:20, 4:20, 2:20 w/w) werden opgelost in aqueous media en gedialyseerd (MWCO 1 kDa) om nanopartikelen te vormen. PS (0,7 mM) werd toegevoegd aan 10 mL van elke nanopartikelsuspensie, 1 uur geroerd en gesonicatieerd (100 W, 2 s pulsen) tot homogeniteit. De PS-gecoate DZP-CHP (PS-DZP-CHP) nanopartikelen werden gefiltreerd om onzuiverheden te verwijderen.

Karakterisering

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en scanning elektronenmicroscopie (SEM) bevestigden spherische morfologie. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) meet grootte en zeta-potentiaal. Isotherme titratie calorimetrie (ITC) beoordeelde PS bindingsaffiniteit en dekking. In vitro vrijgifte werd geëvalueerd via dialyse tegen PBS pH 7,4 bij 37 °C, bemonstering tot 72 uur en kwantificering van DZP via UV-vis (312 nm) tegen een standaardcurve.

In vivo hersen targeting

ICG-gelabelde DZP-CHP nanopartikelen werden bereid door dialyse van 400 mg CHP-DZP met 20 mg ICG, gevolgd door sonicatie. PS-ICG-DZP-CHP nanopartikelen werden daarna als boven geformuleerd. Tien zwarte muizen kregen staartvensinjecties van 200 µL (200 µg/mL) van PS-ICG-DZP-CHP of ICG-DZP-CHP. Fluorescentie imaging (excitatie 765–815 nm, emissie 815–845 nm) vangde gehele lichaam en orgaan distributie 30 min post-injectie.

Weefseldistributie

Vijfenveertig C57BL/6 muizen werden toegewezen aan vrije DZP, DZP-CHP en PS-DZP-CHP groepen (0,25 mg/kg, IV). Bloed en organen (hersen, hart, lever, nieren) werden verzameld na 1, 3, 6 uur. Homogenaten werden geëxtraheerd met methanol, gecentrifugeerd en geanalyseerd via LC–MS/MS (mobile fase: 0,1% azijnzuur water / methanol 70:30, stroom 0,3 mL/min). Kwantificatie gebruikte multiple reaction monitoring (MRM) met positieve electrospray ionisatie.

Celmodellen en neuroprotectie assays

PC12 en SH-S5Y cellen werden gekweekt in DMEM + 10% FBS, gezaaid op 1×10⁴ cellen/mL (96-put platen) of 2–3×10⁵ cellen/mL (andere assays). Aβ25–35 (20 µM) induceerde neurotoxiciteit. Cellevensvatbaarheid gemeten met MTT (490 nm). LDH vrijgifte (450 nm) beoordeelde membraanintegriteit. MMP geëvalueerd met Rhodamine 123 fluorescentie. Apoptose morfologie gevisualiseerd via AO/EB kleuring.

Resultaten

Nanopartikel karakterisering

CHP alleen vormde ~257 nm spheren (zeta –2,8 mV). DZP lading verhoogde grootte licht tot 260–274 nm en verschuifde zeta naar –5 tot –9 mV, afhankelijk van geneesmiddelverhouding. De 1:5 DZP:CHP formulering (DCN2) bereikte de hoogste geneesmiddelinclusie (86,5%) en lading (13,4%). PS coating verhoogde grootte tot 335 nm en zeta tot –2,2 mV, wat succesvolle oppervlaktemodificatie bevestigt.

PS bindingsaffiniteit

ITC onthulde PS bindingsaffiniteiten van 1,47×10⁵, 2,98×10⁵ en 3,67×10⁵ M⁻¹ voor DCN1, DCN2, DCN3, respectievelijk, met dekkingsverhoudingen van 2,65, 2,70 en 1,49 mol PS per mol nanopartikel. Endotherme, entropie-gedreven interacties suggereren hydrofobe associatie.

In vitro vrijgifte

Vrije DZP oploste snel. PS-DZP-CHP vrijgaf 35% in 6 uur, 70% op 24 uur en 90% op 72 uur, wat sustained release aangeeft. Niet-gecoate DZP-CHP vrijgaf sneller, waarschijnlijk door zwakkere PS-scherming.

Hersen targeting

Fluorescentie imaging toonde verwaarloosbaar signaal in vrije ICG controles. PS-ICG-DZP-CHP produceerde heldere hersenfluorescentie 30 min post-injectie, met minimaal signaal in perifere organen. Weefselkwantificering bevestigde een 3–4-voudig hogere hersen DZP concentratie voor PS-DZP-CHP versus vrije DZP, en een vertraagde piek (6 uur vs 1 uur) indicatief voor sustained release.

ApoE binding

MST leverde een K_D van 3,63 µM voor PS-ICG-CHP–ApoE interactie, wat receptor-gemedieerde BBB-transcytose ondersteunt.

Neuroprotectie in celmodellen

Aβ25–35 bij 20 µM reduceerde PC12 levensvatbaarheid tot 49,5% en SH-S5Y tot 49,7%. Pre-behandeling met DZP-CHP (5 µM, 10 µM) herstelde levensvatbaarheid tot 68–75% (vs 48% met vrije DZP). LDH vrijgifte daalde met 30% met DZP-CHP, en MMP bleef >80% van controle, terwijl vrije DZP slechts ~70% bereikte. AO/EB kleuring onthulde verminderde apoptotische morfologie in DZP-CHP groepen.

Discussie

Onze PS-gecoate DZP-CHP nanopartikelen bereikten getargete hersenafgifte, sustained geneesmiddelvrijgifte en superieure neuroprotectieve effectiviteit in vitro. De hoge PS-affiniteit en ApoE-adsorptie faciliteren LDLR-gemedieerde BBB-transcytose, terwijl de CHP-kern een lipofiel reservoir biedt dat Aβ-aggregatie reduceert. Vergeleken met conventioneel vrije DZP, verlengt het nanopartikel-platform doseringsintervallen, wat patiëntadherentie kan verbeteren en bijwerkingen verminderen. Toekomstige in vivo studies zullen zich richten op farmacokinetiek, toxiciteit en therapeutische effectiviteit in AD diermodellen.

Conclusie

Cholesterolf gemodificeerde pullulan nanopartikelen geladen met donepezil en oppervlakte-gecoat met polysorbate 80 demonstreren optimale geneesmiddellading (1:5 DZP:CHP), sustained release, efficiënte BBB-overstek en verbeterde neuroprotectie tegen Aβ-geïnduceerde toxiciteit. Deze bevindingen onderschrijven PS-DZP-CHP als een veelbelovende nanomedicijn voor Alzheimer ziekte behandeling.