Beenmerg mesenchymale stamcel-afgeleide exosomaal microRNA-133a remt myocardiale fibrose en epitheliale-mesenchymale overgang bij virale myocarditis ratten door middel van onderdrukking van MAML1

Materialen en methoden

Ethische goedkeuring

De studie werd toegestaan ​​door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Fourth Affiliated Hospital van de Zhejiang University School of Medicine. Dieren werden humaan behandeld.

Isolatie van BMSC's

Proefdieren waren volwassen specifieke pathogeenvrije (SPF) Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten (Experimental Animal Center van Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang, China). De ratten werden geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie met pentobarbital-natrium en gesteriliseerd met 75% alcohol. Het dijbeen en scheenbeen werden op een ultraschone tafel verwijderd, de spier- en bindweefsels werden verwijderd en de mergholte werd herhaaldelijk gespoeld met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met een laag glucosegehalte. De vloeistof werd gecentrifugeerd om de precipitaten te verzamelen die opnieuw werden gesuspendeerd en gedurende 24 uur werden geïncubeerd (het medium werd elke 2-3 dagen vervangen). Bij het groeien naar de logaritmische fase werden BMSC's losgemaakt met 0, 25% trypsine (Gibco, Carlsbad, Californië, VS), gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in MSC-kweekoplossing (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, China). De suspensie werd gepasseerd in een verhouding van 1:2. De bovenstaande bewerking werd herhaald en de BMSC's van de 4e passage werden gebruikt voor volgende experimenten.

Identificatie van BMSC's

De oppervlakte-antigenen van de BMSC's van de 4e passage in logaritmische groei werden geïdentificeerd door flowcytometrie. De BMSC's werden losgemaakt met 0,25% trypsine (1 ml) dat ethyleendiaminetetraazijnzuur bevatte, gecentrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd met geschikte fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gecentrifugeerd bij 151 g. De BMSC's werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd met PBS met 2% vers foetaal runderserum (FBS) (Gibco) om een ​​eencellige suspensie te maken. FITC-CD34, PE-CD29 en PE-CD44 monoklonaal antilichaam (elk 5 L, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) werden geïncubeerd met de celsuspensie (100 L), gecentrifugeerd bij 151 g, opnieuw gesuspendeerd met 500 μL PBS met 1% paraformaldehyde en gefixeerd gedurende 30 minuten. De achtergrondmarkers werden geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen van de homotypecontrole.

Flowcytometrie:de eencellige suspensie werd gefixeerd en gecentrifugeerd bij 151 g. Vervolgens werden de BMSC's opnieuw gesuspendeerd met PBS met 1% paraformaldehyde, getest op de MACS Quart-flowcytometer en geanalyseerd door de bijbehorende software.

Inductie van osteogenese en adipogenese van BMSC's

BMSC's in de 4e passage werden uitgezaaid in platen met 6 putjes met 200 cellen/ml. De osteoblast-inductie-oplossing en adipogene inductie-oplossing (Cyagen Biosciences Inc.) werden toegevoegd aan BMSC's met een confluentie van 60-70%. BMSC's in andere twee putjes werden niet toegevoegd met inductievloeistoffen als controles. De BMSC's werden gedurende 14 dagen geïnduceerd en gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Vervolgens werden de gedifferentieerde osteoblasten en adipocyten geïmplementeerd met Alizarin-roodkleuring en olie-rood O-kleuring (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, China) en onder een microscoop waargenomen.

Exosome isolatie en identificatie

BMSC's in de 4e passage werden 48 uur gekweekt om het supernatant te oogsten dat vervolgens werd gecentrifugeerd (800 g en 2000 g), gefiltreerd met 0, 22 m en 100.000 MW filtermembranen en gecentrifugeerd (100.000 g) om de precipitaten te verzamelen. Vervolgens werden de precipitaten opnieuw gesuspendeerd met PBS, opnieuw gecentrifugeerd bij 100, 000 g om exosoomprecipitatie te verkrijgen. De BMSC-Exo-suspensie in PBS werd onderworpen aan concentratiedetectie door bicinchoninezuur (BCA) en detectie van exosome maker-eiwitten (CD63, CD81 en CD9) door western-blot-analyse (Proteintech, Chicago, IL, VS).

Recombinante adenovirusinfectie bemiddelt miR-133a-genmodificatie van BMSC's

BMSC's werden overnacht gepasseerd. De normale controle (gelijke hoeveelheid PBS), de miR-133a negatieve controle (NC), de miR-133a overexpressie (Ad-miR-133a) en miR-133a lage expressie (Adas-miR-133a) ( Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) werden getransfecteerd met BMSC's in overeenstemming met 100 multipliciteit van infectie (MOI). De BMSC's werden gekweekt en de bijbehorende exosomen (NC ^Exo , NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , en Adas-miR-133a ^Exo ) werden verkregen door middel van ultracentrifugatie [20].

Opstelling van VMC-model bij ratten en groepering van proefdieren

Volwassen mannelijke SD-ratten van SPF-kwaliteit werden verdeeld in 10 groepen, met elk acht ratten. Coxsackievirus B3 (CVB3) werd geleverd door het Institute of Medical Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, China).

CVB3 (10 mg/kg) werd intraperitoneaal in ratten geïnjecteerd, terwijl PBS of BMSC-Exo (100 g) via de staartader werd geïnjecteerd. Normale ratten voor controles werden geïnjecteerd met CVB3-kweekoplossing en PBS. Ratten geïnjecteerd met 10 mg/kg CVB3 werden verder geïnjecteerd met PBS, MSC ^exo , NC ^Exo , Adas-miR-133a ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , si-NC of si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, China).

De ratten werden gedurende 7 dagen continu geïnjecteerd en het oogbolbloed werd verkregen. Het bloed werd gecentrifugeerd en het serum werd verzameld, onderverpakt en bewaard bij -20 ° C. Nadat de ratten waren geëuthanaseerd, werden de hartmonsters genomen, gefixeerd met 10% formaldehyde, gedehydrateerd met gradiëntalcohol, geklaard met xyleen en ingebed met paraffine, in coupes gesneden voor histologische observatie. Een deel van de secties werd bij -80 °C geplaatst als materiaal voor de moleculaire biologie.

Echocardiografie

Op de 7e dag na de virusinjectie werden de ratten intraperitoneaal geïnjecteerd met pentobarbital-natrium 25 mg/kg. Na volledige anesthesie werd de ledemaatleiding van de elektrocardiogrammachine verbonden met de elektrodenaald subcutaan ingebracht aan de uiteinden van de ledematen van de ratten, en het ledemaatleidingelektrocardiogram werd opgenomen. Vervolgens werden de ratten iets naar links in rugligging gefixeerd, werd de borstkas onthaard en werd het II-lead-elektrocardiogram aangesloten om het Doppler-spectrum van de bloedstroompuls van de aorta in de parasternale vierkamerhartsectie te verkrijgen. Indicatoren omvatten linker ventriculaire posterieure wanddikte (LVPW), linker ventriculaire eind-systolische diameter (LVID's), linker ventriculaire verkortingsfractie (FS) en linker ventriculaire ejectiefractie (LVEF).

Hematoxyline–eosine (HE)-kleuring

De weefsels werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd, geklaard en ingebed met paraffine. Vervolgens werden de secties van 4 μm van was ontdaan, gekleurd met hematoxyline (Servicebio, Wuhan, China), gedifferentieerd met 1% zoutzuuralcohol, teruggebracht naar blauw en gekleurd met eosine, gedehydrateerd, geklaard met xyleen, verzegeld met neutrale gom, en waargenomen onder een optische microscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Masson-collageenkleuring

Paraffinecoupes werden van was ontdaan, gekleurd met hematoxyline in minder dan 2 minuten, gekleurd met Lichun-magenta-oplossing en snel gespoeld met 0,5% ijsazijn. Vervolgens werden de coupes gekleurd met een waterige oplossing van 1% aluminiumfosfaat, gekleurd van donkerrood tot helderrood tot roze, en bekeken onder een microscoop. Vervolgens werden de coupes gekleurd met anilineblauw (Pulande), conventioneel gedehydrateerd met xyleen en afgesloten. Medische beeldanalysesoftware Image-Proplus 6.0 werd gebruikt om het positieve kleuringsgebied van collageenvezels en de collageenvolumefractie (CVF) = collageenoppervlak/totaal veldoppervlak te meten. De kleuringslocatie en kleur van collageenvezels werden onderscheiden (de cardiomyocyten waren rood en de collageenvezels waren blauw gestreepte of homogene structuren in de intercellulaire ruimte).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-gemedieerde Deoxyuridine Trifosfaat-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) kleuring

Paraffinecoupes werden van was ontdaan, in de citraatbuffer geplaatst en gedurende 10 minuten bij 350 W gebakken. De secties werden toegevoegd met 50 L TUNEL-oplossing, samengevoegd met 50 μL conversiemiddel-peroxidase, ontwikkeld met DAB en onder de microscoop bekeken. De secties werden in hematoxyline gedaan, ondergedompeld in 95% ethanol I-II, samengevoegd met watervrije ethanol I-II, xyleen I-II en verzegeld. De resultaten werden geanalyseerd onder een optische microscoop.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tumornecrosefactor α (TNF-α), interleukine (IL)-1β en IL-6 werden gedetecteerd door ELISA-kits (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, China). Het oogbolbloed werd bij 604 g gecentrifugeerd om het bovenste serum te verzamelen. Het supernatant verkregen door centrifugeren uit celkweekmedium werd gedetecteerd in celexperimenten. Er waren zeven concentratiegradiënten in de verdunningsstandaard van monsters. Het blanco putje werd samengevoegd met monsterverdunningsmiddel en een ander putje werd toegevoegd met tetramethylbenzidine (TMB), twee duplicaatputjes werden geplaatst voor elke concentratie. De monsterputjes werden samengevoegd met 50 L monsterverdunningsmiddel en de monsters op hun beurt. Elk putje werd gedurende 1 uur in reactie gebracht met 100 L primair antilichaam (behalve TMB-putje), evenals met 300 μL 0,01 M tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en 100 μL Avidine-Biotin-Peroxidase Complex-werkoplossing (behalve TMB-putje). ). Vervolgens werd aan elk putje 300 L 0,01 M TBS toegevoegd en met 100 μL TMB geïncubeerd. De waarde van de optische dichtheid (OD) en de concentratie van elk putje werden onmiddellijk gemeten en de standaardcurve werd getekend.

Kwantitatieve polymerasekettingreactie met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR)

MiR-133a, collageen Ι, collageen III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadherine en FSP-1-expressie in myocardiale weefsels en cardiomyocyten werden gedetecteerd via RT-qPCR. Het totale RNA werd geëxtraheerd uit cardiomyocyten of myocardiale weefsels en omgekeerd getranscribeerd naar cDNA via RNA-extractiekit (Takara, Dalian, China), en RT-PCR-primers werden gesynthetiseerd via Invitrogen (Guangzhou, China), de sequenties worden getoond in Tabel 1. Relatieve kwantitatieve genexpressie werd geanalyseerd met behulp van glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) of U6 als de laadcontrolegenen volgens 2 ^−△△Ct methode.

Western Blot-analyse

De ratten werden onder narcose geëuthanaseerd. De myocardiale weefsels werden ingevroren en vermalen in vloeibare stikstof. Vervolgens werd de voorraadoplossing van proteaseremmers fenylmethaansulfonylfluoride gemengd met cellysisbuffer in een verhouding van 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). De monsters werden gelyseerd met een gemengde oplossing en eiwitten van de cellen werden geëxtraheerd. De totale eiwitconcentratie werd gedetecteerd met de BCA-kit. De monsters werden gemengd met 5 x laadbuffer bij 4:1, geïmplementeerd met kokend waterbad gedurende 10 minuten, met ijs gebaad en gecentrifugeerd. Elektroforesescheiding werd uitgevoerd en de eiwitten werden overgebracht naar een polyvinylideenfluoride (Servicebio) membraan met een elektrische overdrachtsoplossing. Vervolgens werd het membraan geblokkeerd met 5% magere melkpoeder en samengevoegd met primaire antilichamen CD63, CD81 en CD9 (konijn anti-rat polyklonale antilichamen van Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, VS, 1:1000) en GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, VS, 1:1000). Vervolgens werd het membraan gedruppeld met het secundaire antilichaam, met mierikswortelperoxidase gemerkt IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS, 1:1000), en ondergedompeld in verbeterde chemiluminescentiereactie-oplossing (Pierce, Rockford, IL, VS). Met GAPDH als laadcontrole werden afbeeldingen van eiwitimprinting geanalyseerd met ImageJ2x-software.

Cardiomyocytcultuur en passage

SD-ratten van 3-5 dagen (Experimental Animal Center van Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang, China) werden genomen. Het ventriculaire deel werd gespoeld met voorgekoelde Hank's Balanced Salt Solution, in kleine stukjes gesneden en losgemaakt met 0,25% trypsine. De stukjes werden toegevoegd met een geschikte hoeveelheid van 10% compleet medium om het loslaten te beëindigen en gecentrifugeerd bij 151 g. DMEM met 20% FBS werd toegepast voor celhersuspensie. Cardiomyocyten werden gezuiverd door middel van differentiële hechtende methode, en het overlevingspercentage werd waargenomen via trypaanblauw-kleuring, de overleefde cardiomyocyten werden gekweekt. Na 24 uur hechtten de cardiomyocyten zich aan de wand en begonnen te pulseren. Na 72 uur breidde de pseudopodia zich uit.

Constructie van VMC-model van cardiomyocyten

Cardiomyocyten in de 4e passage in de logaritmische groeifase werden geselecteerd en geïnfecteerd met MSC ^Exo , NC ^Exo , Adas-miR-133a ^Exo , en Ad-miR-133a ^Exo . De 100 Tcid50 CVB3-virusoplossing (100 L) werd aan de cellen toegevoegd om een ​​cel-VMC-model te induceren. Tegelijkertijd werd een gelijke hoeveelheid onderhoudsoplossing aan de cellen toegevoegd voor een controle en werden overeenkomstige exosomen na een infectie van 1 uur gedurende een kweek van 47 uur in cardiomyocyten samengevoegd.

Cell Counting Kit (CCK)-8 Assay

CCK-8-celdetectiekit (Beyotime) werd toegepast om het overlevingspercentage van cardiomyocyten te detecteren. Bij het groeien tot de logaritmische fase werden de cellen losgemaakt met 0,25% trypsine en uitgezaaid in een celkweekplaat met 96 putjes bij 2,5 × 10 ⁴ cellen/per putje. Samengevoegd met CCK-8-oplossing (10 L / putje), werden cellen continu gedurende 1-4 uur gekweekt en de OD_{450 nm} waarde werd gemeten via een microplaatlezer.

Flowcytometrie

AnnexinV-APC/propidiumjodide (PI) dubbele kleurmethode werd toegepast om celapoptose te detecteren. De cellen werden gecentrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd met 250 L Binding Buffer (4 ml Binding Buffer + 12 ml gedeïoniseerd water) en aangepast tot 1 × 10 ⁶ cellen/ml. De celsuspensie van 100 L werd toegevoegd met 5 L Annexin V-APC (BD Biosciences) en 5 μL PI-oplossing (BD Biosciences), geladen op de flowcytometer en automatisch geanalyseerd door een computer.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

De wildtype (wt) of mutant-type (mut) sequentie van MAML1 3-untranslated region (UTR) werd gekloond in pGL3-M-vector (Promega, WI, VS), vervolgens MAML1-3-UTR-wt of MAML1- 3-UTR-mut werden gegenereerd. De vectoren, samen met miR-133a mimic of NC, werden gecotransfecteerd in cardiomyocyten via Lipofectamine 2000. De luciferase-activiteit werd 48 uur later getest door het duale luciferase-reportergensysteem (Promega) [21]

RNA-immunoprecipitatie (RIP)-assay

RIP-kit (Millipore, VS) werd gebruikt om de binding van MAML1 en miR-133a te detecteren. Cellen werden gelyseerd door radio-immunoprecipitatie-assaybuffer (P0013B, Beyotime, Shanghai, China), gecentrifugeerd bij 1400 g en geïncubeerd met antilichamen om samen te precipiteren. Magnetische korrels (50 L) werden opnieuw gesuspendeerd in 100 L RIP Wash Buffer en geïncubeerd met 5 g anti-MAML1-antilichaam (1 g/ml, ab155786) of IgG (1:100, ab172730). Het magnetische kraal-antilichaamcomplex werd geresuspendeerd in 900 L RIP Wash Buffer, interactie aangegaan met 100 μL celextract, verteerd met proteïnase K en gedetecteerd door RT-qPCR [22].

Statistische analyse

SPSS 21.0 statistische software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) werd toegepast voor analyse van de gegevens. De meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde   ±   standaarddeviatie. De t-test werd toegepast op vergelijkingen tussen twee groepen. Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd gebruikt voor vergelijking tussen groepen en Tukey's post hoc-test voor paarsgewijze vergelijkingen. Voorspellers werden behouden als ze significant waren bij een P waarde van 0,05 of kleiner.

Resultaten

Identificatie van BMSC's en BMSC-Exo

Microscopisch waren BMSC's spoelvormig en afgerond en kleefden ze aan de muur in een vortex of radiaal patroon (figuur 1A). Na olierood O-kleuring van adipogenese-inductie, waren de lipidedruppeltjes van de 4e BMSC's rood en waren er ronde lipidedruppeltjes van verschillende groottes (figuur 1B). Na inductie van osteogenese vertoonden de cellen die verkalkte knobbeltjes tot expressie brachten rood na kleuring met alizarinerood en ongelijke verdeling van verkalkte knobbeltjes en overlappende cellen (Fig. 1C). Flowcytometrie toonde aan dat de MSC-markers CD29 en CD44 (> -95%) tot expressie werden gebracht, maar het hematopoëtische stamceloppervlak-antigeen CD34 (<-95%) werd niet tot expressie gebracht (Fig. 1D). Deze resultaten toonden aan dat de BMSC's van hoge zuiverheid waren en voldeden aan de MSC-normen van de International Society of Cell Therapy.

BMSC fenotype observatie en BMSC-Exo identificatie. A Morfologische observatie van BMSC's in de 4e passage; B De resultaten van olierood O-kleuring van adipocyten; C De resultaten van alizarineroodkleuring van osteoblasten; D Het fenotype van BMSC gedetecteerd via flowcytometrie. E Elektronenmicroscoopobservatie van BMSC-Exo; V Eiwitbanden van CD9, CD63 en CD81

Transmissie-elektronenmicroscoop merkte op dat BMSC-Exos ovale blaasjes waren met een duidelijke perifere vliezige structuur, verschillende groottes en een diameter van 40-100 nm (figuur 1E). Western-blot-analyse toonde aan dat de geëxtraheerde producten die exosoom tot expressie brachten, kenmerkende eiwitten van CD9, CD63 en CD81 voortbrachten (Fig. 1F).

Verhoogde exosomale miR-133a verbetert de symptomen van myocarditis

De transfectie van BMSC's met miR-133a recombinant adenovirus werd waargenomen (Fig. 2A). Een groot aantal groene fluorescentie-expressies van NC, Ad-miR-133a en Adas-miR-133a werden waargenomen onder de omgekeerde fluorescentiemicroscoop, wat aangeeft dat recombinante adenovirusvector BMSC's effectief zou kunnen transfecteren. Om de transfectie-efficiëntie van miR-133a te testen, werd miR-133a-expressie in BMSC's en hun exosomen gemeten met RT-qPCR. Er werd ontdekt dat miR-133a opwaartse regulatie de miR-133a-expressie verhoogde, terwijl miR-133a neerwaartse regulatie de miR-133a-expressie verminderde (Fig. 2B). Vervolgens injecteerden we exosomen die miR-133a bevatten bij ratten. Onder de omgekeerde fluorescentiemicroscoop werd groene fluorescentie-expressie waargenomen bij VMC-ratten na behandeling van NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , of Adas-miR-133a ^Exo , wat aangeeft dat de recombinante adenovirusvector myocardiale weefsels van ratten infecteerde (Fig. 2C). RT-qPCR-experiment vond ook dat miR-133a-expressie in VMC-ratten blijkbaar was afgenomen; miR-133a-expressie was duidelijk verhoogd in VMC-ratten die waren geïnjecteerd met Ad-miR-133a ^Exo maar nam af bij VMC-ratten die waren geïnjecteerd met Adas-miR-133a ^Exo (Fig. 2D). Wat de algemene toestand van ratten betreft, werd waargenomen dat de algemene toestand van normale controleratten normaal waren, en de kenmerken van VMC werden blijkbaar uitgedrukt in VMC-ratten en VMC-ratten die waren geïnjecteerd met Adas-miR-133a ^Exo , zoals ruw en wanordelijk haar, dyspnoe, en weinig dieet. Bij VMC-ratten behandeld met MSC ^Exo , NC ^Exo , en Ad-miR-133a ^Exo , werden deze tekens in verschillende mate verbeterd. Het gewicht van de VMC-ratten nam vanaf 1 dag na infectie continu af en injectie van MSC ^Exo , NC ^Exo , of Ad-miR-133a ^Exo verhoogde het gewicht van ratten. Het gewicht van de VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a ^Exo was duidelijk verhoogd en het gewicht van de VMC-ratten die waren geïnjecteerd met Adas-miR-133a ^Exo was duidelijk verminderd (Fig. 2E).

Opwaarts gereguleerde exosomale miR-133a verlicht myocarditis. A BMSC's-transfectie van miR-133a recombinant adenovirus; B RT-qPCR-detectie van miR-133a-expressie in BMSC's en hun exosomen na regulering van miR-133a; C miR-133a transfectie-efficiëntie getest via omgekeerde fluorescentiemicroscoop; D De relatieve expressie van miR-133a in myocardiale weefsels getest via RT-qPCR; E Gewichtsverandering van ratten in elke groep; V Bepaling van LVPW, LVID's, FS en LVEF bij ratten van elke groep. *P < 0,05; **P < 0,001

De waarneming van de myocardiale functie suggereerde dat (Fig. 2F) de VMC-ratten LVPW en LVID's hadden verhoogd en FS en LVEF hadden verlaagd. Na exosoominjectie daalden LVPW en LVID's, en duidelijk verhoogde FS en LVEF vertoonden bij VMC-ratten. Adas-miR-133a ^Exo behandeling verminderd terwijl Ad-miR-133a ^Exo verbeterde myocardiale functie bij VMC-ratten.

Opwaarts gereguleerde exosomale miR-133a remt ontsteking in myocardweefsel van VMC-ratten

HE-kleuring toonde aan dat de myocardiale vezels in normale controleratten dicht bij elkaar waren geplaatst en dat er geen infiltratie van ontstekingscellen in het mesenchym was. De hartspiercellen in de VMC-ratten waren gedesorganiseerd en het mesenchym was geïnfiltreerd door een groot aantal ontstekingscellen. De cardiomyocyten in VMC-ratten die zijn geïnjecteerd met MSC ^Exo of NC ^Exo waren ordelijk gerangschikt, met een kleine hoeveelheid ontstekingscellen die in het mesenchym infiltreerden. De cardiomyocyten in VMC-ratten na Adas-miR-133a ^Exo behandeling waren wanordelijk gerangschikt en de ontstekingscellen in het mesenchym waren geïnfiltreerd. De cardiomyocyten in VMC-ratten die werden behandeld met Ad-miR-133a ^Exo waren ordelijk gerangschikt zonder duidelijke infiltratie van ontstekingscellen (Fig. 3A).

Verhoogde exosomale miR-133a remt ontsteking in myocardiale weefsels met VMC. A HE-kleuring van myocardweefsel van ratten in elke groep; B De expressie van IL-6 in serum getest via ELISA; C De expressie van TNF-α en IL-1β in serum getest via ELISA. *P < 0,05; **P < 0,001

ELISA gaf aan dat (Fig. 3B, C) ontstekingsfactoren (TNF-a, IL-1β en IL-6) duidelijk waren toegenomen in VMC-ratten. De VMC-ratten die werden geïnjecteerd met Ad-miR-133a ^Exo had verminderde niveaus van ontstekingsfactoren. Adas-miR-133a ^Exo behandeling veroorzaakte verhoogde ontstekingsfactoren bij VMC-ratten.

Verhoogde exosomale miR-133a verlaagt CVF in myocardweefsel van ratten met VMC

Masson-kleuring onthulde dat de myocardiale vezels bij normale ratten dicht bij elkaar waren geplaatst, met bijna geen blauwe collagene vezels. Na CVB3-injectie waren de cardiomyocyten hypertrofisch, met bindweefselhyperplasie en een groot aantal blauwe collagene vezels, en CVF was duidelijk verhoogd. Behandeld met exosomen waren de cardiomyocyten ordelijk gerangschikt, intercellulaire bindweefselhyperplasie was verminderd, blauwe collageenvezels en CVF waren duidelijk verminderd. De myocardiale intercellulaire ruimte van VMC-ratten die zijn geïnjecteerd met Adas-miR-133a ^Exo was verwijd, de cellen waren duidelijk vergroot, de blauwe collageenvezels en CVF waren duidelijk verhoogd; de intercellulaire ruimte was verminderd, de verdeling van blauwe collageenvezels en de CVF waren verminderd van VMC-ratten met Ad-miR-133a ^Exo behandeling (Fig. 4A, B).

Opwaarts gereguleerde exosomale miR-133a verlaagt CVF in myocardiale weefsels van ratten met VMC. A Masson-kleuring van myocardiale weefsels bij ratten; B Collageenvolumefractie van ratten in elke groep. **P < 0,001

Verhoogde exosomale miR-133a vermindert de expressie van collageen I, collageen III, TGF-β1 en CTGF in myocardweefsel van ratten met VMC

Collageen I en collageen III zijn de belangrijkste componenten van collageen, die voornamelijk worden gedistribueerd in celverbindingen en celmembranen, intercellulaire substantie en cytoplasma. TGF-β1 en CTGF zijn de kenmerkende eiwitten van fibrose. Bevindingen van RT-qPCR toonden aan dat de mRNA-expressieniveaus van collageen I, collageen III, TGF-β1 en CTGF waren verhoogd in VMC-ratten, maar afnamen na exosoombehandeling. De VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a ^Exo hadden verlaagde mRNA-expressieniveaus van collageen I, collageen III, TGF-β1 en CTGF, terwijl de VMC-ratten na Adas-miR-133a ^Exo behandeling toonde de tegenovergestelde situatie (Fig. 5A-C).

Elevated exosomal miR-133a reduces the mRNA expression of collagen I, collagen III, TGF-β1 and CTGF in myocardial tissues of rats with VMC. A Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR. *P < 0.05; **P < 0,001

Up-regulated Exosomal miR-133a Inhibits the Cardiomyocyte Apoptosis in Myocardial Tissues of Rats with VMC

TUNEL staining showed that the apoptotic cardiomyocytes were brownish black or brownish yellow with nuclear condensation. The number of apoptotic cells was increased in VMC rats which would be attenuated by exosome treatment. The VMC rats injected with Ad-miR-133a ^Exo had reduced number of apoptotic cells and those injected with Adas-miR-133a ^Exo had increased number of apoptotic cells (Fig. 6A, B).

Increased exosomal miR-133a inhibits the cardiomyocyte apoptosis in myocardial tissues of rats with VMC. A TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; B The number of TUNEL positive cells in each group. **P < 0,001

Elevated Exosomal miR-133a Depresses EMT in Myocardial Tissues of Rats with VMC

E-cadherin, α-SMA, and FSP-1 are key indicators of EMT. Results of RT-qPCR demonstrated that α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats. In addition, α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were reduced and E-cadherin mRNA expression level was increased in VMC rats after exosome treatment. α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats treated with Adas-miR-133a ^Exo , while the expression of these indicators was opposite in VMC rats injected with Ad-miR-133a ^Exo (Fig. 7A, B).

Up-regulated exosomal miR-133a represses EMT in myocardial tissues of rats with VMC. A The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; B The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0.05; **P < 0,001

Up-regulated Exosomal miR-133a Depresses Inflammation of Cardiomyocytes in VMC

As a result, fluorescence microscopy captured green fluorescent expression in VMC rats treated with NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , or Adas-miR-133a ^Exo , indicating that the recombinant adenovirus vector infected cardiomyocytes of rats (Fig. 8A). RT-qPCR and ELISA discovered that (Fig. 8B, D) miR-133a expression was reduced and inflammatory factors (TNF-α, IL-1β, and IL-6) were increased in VMC rats, which would be reversed by exosome treatment. The VMC rats treated with Ad-miR-133a ^Exo had up-regulated miR-133a and decreased inflammatory factors in VMC rats, while those treated with Adas-miR-133a ^Exo presented decreased miR-133a and increased levels of inflammatory factors in VMC rats.

Elevated exosomal miR-133a restrains inflammation of cardiomyocytes in VMC. A miR-133a transfection efficiency tested via inverted fluorescence microscope; B The relative expression of miR-133a in cardiomyocytes of rats in each group; C IL-6 expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group; D TNF-α and IL-1β expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group. *P < 0.05; **P < 0,001

Elevated Exosomal miR-133a Promotes Cell Viability, and Represses Apoptosis of Cardiomyocytes in VMC

The apoptosis and the cell viability were detected via AnnexinV-APC/PI double staining and CCK-8 assay. The results revealed that there was an obvious increase in apoptosis rate, a decrease in cell viability of cardiomyocytes in VMC rats. Exosome treatment reduced apoptosis rate and enhanced the viability of cardiomyocytes. Adas-miR-133a ^Exo enhanced the apoptosis rate and disrupted the viability of cardiomyocytes in VMC rats. Ad-miR-133a ^Exo treatment functioned the opposite effects on cardiomyocytes of VMC rats (Fig. 9A–C).

Increased exosomal miR-133a promotes viability and represses apoptosis in cardiomyocytes in VMC. A The cardiomyocytes apoptosis detected via flow cytometry; B Quantification results of A; C The cell viability detected via CCK-8 assay. *P < 0.05; **P < 0,001

miR-133a Targets MAML1

It has been reported that up-regulated miRNA-193b reduces myocardial I/R damage by targeting MAML1 [18]. Based on that, we cross-screened downstream genes of miR-133a through bioinformatics websites PITA, miRanda, PicTar, microT and miRmap, and selected MAML1 as a target of miR-133a (Fig. 10A). We constructed MAML1-wt or MAML1-mut, and co-transfected cardiomyocytes with miR-133a mimic or NC. The results showed that miR-133a mimic reduced the luciferase activity of MAML1-wt (Fig. 10B). The RIP experiment further verified the targeting relationship between miR-133a and MAML1 (Fig. 10C). RT-qPCR and Western blot detection of MAML1 expression showed that MAML1 expression was decreased in cardiomyocytes transfected with miR-133a mimic (Fig. 10D, E).

miR-133a targets MAML1. A miR-133a’s targets predicted on bioinformatics websites; B The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by dual luciferase reporter gene experiment; C The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by RIP experiment; D /E MAML1 expression changes after up-regulation of miR-133a detected by RT-qPCR and Western blot. *P < 0.05; **P  < 0.01; ***P < 0,001

Inhibition of MAML1 has a Protective Effect on Rats with Myocarditis and Reverses the Effect of miR-133a-Inhibited Exosomes on Rats with VMC

To further study the effect of miR-133a-regulated MAML1 on rats with VMC, we injected si-MAML1 or si-NC adenovirus into VMC rats or VMC rats that had been treated with miR-133a-silenced exosomes. The injection success was validated by RT-qPCR and Western blot (Fig. 11A, B). The results manifested that injection of si-MAML1, the weight of VMC rats was increased (Fig. 11C), cardiac function was improved (Fig. 11D–G), myocardial tissue pathology and fibrosis were attenuated (Fig. 12A–C), serum inflammation (Fig. 12D, E) and cardiomyocyte apoptosis (Fig. 13A–G) were inhibited. Also, the deleterious effects of miR-133a-silenced exosomes in VMC rats were reversed after injection of si-MAML1.

Inhibition of MAML1 has a protective effect on myocarditis rats and can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. A /B MAML1 expression in myocardial tissue of rats detected by RT-qPCR and Western blot; C. Weight change of rats; D –G Determination of LVPW, LVIDs, FS and LVEF in rats; **P  < 0.01; ***P < 0,001; ****P  < 0.0001

Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. A HE staining of rat myocardial tissue; B Masson staining of myocardial tissues in rats; C CVF of rats; D The expression of IL-6 in serum tested via ELISA; E The expression of TNF-α and IL-1β in serum tested via ELISA.****P  < 0.0001

Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-inhibiting exosomes on rats with VMC. A Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; D TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; E The number of TUNEL positive cells in each group. F The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; G The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0.05; **P  < 0.01; ****P  < 0.0001

Discussion

Myocarditis is an inflammatory heart illness resulting in DCM and heart failure and is most frequently induced by viral infections such as CVB3 [2]. A study has revealed that miR-133 relieves cardiomyocyte apoptosis and electrical remodeling in mice with VMC [23]. Additionally, changed exosomal miRNAs are also found to be linked with the pathogenesis of CVB3-induced myocarditis [14]. Exosomes derived from cardiac progenitor cells ease CVB3-induced apoptosis via restraining the proliferation of CVB3 in VMC [24]. This study explored the regulatory mechanism of BMSC-derived exosomal miR-133 on myocardial fibrosis and EMT in VMC rats (Additional file 1:Fig. 1).

The study found that the expression of miR-133a was decreased in VMC. As demonstrated before, miR-133a expression is decreased in MI [7]. A study has also suggested that the relative expression of miR-133 in mouse hearts of the VMC is obviously decreased with contrast to the controls [23]. There are some connections of miRNAs with exosomes. The differential expression of exosomes and of exosomal miRNAs in illness has been regarded as biomarkers of disease with performance of noninvasive clinical diagnosis together with their therapeutic potentials [25]. Lin et al. have found that miR-133 is specially sorted into hypoxia/reoxygenation (H/R)-caused human endothelial progenitor cells-derived exosomes to increase fibroblast angiogenesis and EMT [26]. Another study has revealed that MSCs exhibits a communication with brain parenchymal cells and may modulate neurite outgrowth by transfer of miR-133b to neural cells via exosomes [27].

The major finding of this work manifested that up-regulated exosomal miR-133a promoted cell viability, inhibited inflammation, apoptosis, EMT, and fibrosis in rats with VMC. They suits well with a former research that miR-133a silence reverses the Astragalus polysaccharides treatment-induced osteosarcoma MG63 cell proliferation inhibition, together with cell apoptosis promotion [28]. Another study has revealed that overexpressed miR-133a suppresses angiogenesis, apoptosis, fibrosis, and inflammation, while accelerating therapeutic cardiac remodeling in ischemic myocardial illnesses [29]. Similar to our study, Li et al. have stated that miR-133 inhibits cardiomyocyte apoptosis by regulating the expression of apoptosis-related genes in the hearts of VMC mice [23]. The over-expressed miR-133a has been reported to depress hypoxia-induced apoptosis and strengthen cardiomyocyte survival [30]. Meanwhile, the up-regulated serum exosomal miR-30a and miR-181d may have the potentials to be applied as biomarkers for VMC diagnosis [14].

Another finding in our study was that up-regulated exosomal miR-133a decreased CVF, reduced the expression of collagen I and collagen III in rats with VMC. A article has elucidated that released fibroblast growth factor-18 from a collagen membrane causes osteoblastic activity participating in down-regulated miR-133a [31]. In vitro excessive expression of miR-133a depresses cardiomyocyte hypertrophy and reduces collagen expression [32], as evidenced in another study. CVF equals the ratio of collagen area to the sum of myocardial area and collagen area, and the mean value shows the CVF of the section [33]. This finding is also reported by Wang et al. that VMC mice model is successfully constructed by CVB3 infection, manifesting apparent higher CVF expression in contrast with the control group [34]. Moreover, the finding is consistent with that of Ferreira et al. who demonstrates that miR-133a may take on a major role in the modulation of gene expression in chronic Chagas disease cardiomyopathy pathogenesis, with potential link as diagnostic and prognostic tools [8]. Furthermore, evidence has shown that knocking down MAML1 can reduce the hypertrophy of pre-treated cardiomyocytes [35]. In our study, we found that MAML1 was the target gene of miR-133a and inhibition of MAML1 reversed the effects of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. In myocardial ischemia–reperfusion injury, miR-193b-mediated down-regulation of MAML1 could in part reduce infarction and myocardial enzymes, as well as attenuate apoptosis of cardiomyocytes [18]. Also, there is a report suggesting that deficiency of MAML1 could relieve hepatic fibrogenesis [19].

Conclusion

In conclusion, this present study offers evidence that miR-133a is down-regulated in rats with VMC, and elevated exosomal miR-133a improves cardiac function and restrains myocardial fibrosis and EMT in rats with VMC, as well as enhances viability and represses apoptosis of cardiomyocytes in VMC through targeting MAML1. Our study also suggests that inhibition of MAML1 has a protective effect on rats with myocarditis and reverses the effect of miR-133a-inhibited exosomes on rats with VMC. The identification of the exosomal miR-133a in myocardial fibrosis and EMT of myocarditis may potentially widen our understanding of mechanisms underpinning myocarditis and also bear clinical value as a novel molecular target. More researches should be undertaken for making inroads into the treatment of this disease.

Afkortingen

miR-133:

MicroRNA-133

BMSC-Exo:

Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome

EMT:

Epithelial–mesenchymal transition

VMC:

Viral myocarditis

CVF:

Collagen volume fraction

DCM:

Dilated cardiomyopathy

CVB3:

Coxsackie B3 virus

miRNAs:

MicroRNAs

MI:

Myocardial infarction

SPF:

Specific pathogen-free

SD:

Sprague–Dawley

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

PBS:

Phosphate-buffered saline

FBS:

Foetaal runderserum

NC:

Negative control

MOI:

Multiplicity of infection

LVPW:

Left ventricular posterior wall thickness

LVIDs:

Left ventricular end-systolic diameter

LVEF:

Left ventricular ejection fraction

HE:

Hematoxyline-eosine

TUNEL:

Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end-labelin

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

TMB:

Tetramethylbenzidine

TBS:

Tris-buffered saline

ABC:

Avidin–Biotin-Peroxidase Complex

OD:

Optische dichtheid

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

CTGF:

Connective tissue growth factor

CCK:

Cell counting kit

PI:

Propidiumjodide

ANOVA:

Analysis of variance