Exosomale miR-133a van botmarge stamcellen verlicht fibrose & EMT in virale myocarditis via MAML1-onderdrukking

Samenvatting

Myocarditis is een ziekte gekenmerkt door gelokaliseerde of diffuse ontsteking van het myocardium zonder efficiënte behandeling. Deze studie onderzocht het regulatiemechanisme van microRNA-133 (miR-133) afgesecreteerd uit botmarge mesenchymale stamcel-afgeleide exosoom (BMSC-Exo) op myocardiale fibrose en epitheliaal-mesenchymale transitie (EMT) in virale myocarditis (VMC) ratten door regulatie van mastermind-achtige 1 (MAML1). BMSC's in ratten werden geïsoleerd en gekweekt om hun immuun-fenotype en osteogene en adipogene capaciteit te identificeren, en BMSC-Exo's werden geëxtraheerd en geïdentificeerd. Exosomen werden verkregen door ultracentrifugatie, geïdentificeerd door transmissie-elektronenmicroscopie en western blot-analyse. De ratten werden geïnjecteerd met Coxsackie B3-virus voor de voorbereiding van VMC-model, en cardiomyocyten werden geïsoleerd, gekweekt en gegroepeerd op dezelfde manier als dierproeven (NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). In vivo en in vitro experimenten werden uitgevoerd om de rollen van exosomale miR-133a en MAML1 in ontsteking, apoptose, EMT, fibrose en cellevensvatbaarheid te achterhalen. De targetrelatie tussen miR-133a en MAML1 werd geverifieerd door dubbele luciferase-reporter-genanalyse. BMSC-Exo verhoogde miR-133a-expressie in VMC-ratten en verbeterde effectief de cardiale functie en myocardiale fibrose van VMC-ratten, verhoogde de levensvatbaarheid van cardiomyocyten en remde het EMT-proces. Verhoogde miR-133a in exosomen versterkte de verbeteringen. Gedempte miR-133a keerde de effecten van BMSC-Exo op VMC-ratten effectief om. miR-133a targette MAML1. Inhibitie van MAML1 verbeterde de cardiale functie en myocardiale fibrose in VMC-ratten en kon het effect van miR-133a-gedempte exosomen op VMC-ratten omkeren. Onze studie suggereert dat verhoogde exosomale miR-133a myocardiale fibrose en EMT in ratten met VMC onderdrukt via down-regulatie van MAML1, waardoor de progressie van myocarditis wordt geremd.

Inleiding

Myocarditis wordt beschouwd als een inflammatoire ziekte van de hartspiercellen. Myocarditis is duidelijk vaker bij mannen in tegenstelling tot vrouwen. Virale myocarditis (VMC) is een hoofdfactor die leidt tot gedilateerde cardiomyopathie (DCM) en plotselinge dood bij jongeren. De klinische presentatie van myocarditis is uiteenlopend, variërend van asymptomatische toestanden met ambiguë tekenen en symptomen tot ernstige myocardiale destructie door virus en immuuncellen die leiden tot cardiogene schok en arythmieën. Myocarditis kan geïnduceerd worden door een verscheidenheid aan infectieuze elementen, bestaande uit virussen, bacteriën, Chlamydia, rickettsia, schimmels en protozoa, samen met niet-infectieuze inductoren. Waarbij virale infectie de meest voorkomende oorzaak is, vooral bij kinderen. Coxsackie B3-virus (CVB3), als het meest cruciale virus dat myocarditis veroorzaakt, kan resulteren in oxidatieve stressrespons en apoptose in de pathogenese van VMC, maar speciale behandeling van VMC is nog niet gerapporteerd. Bovendien is de pathogenese van VMC niet goed gedocumenteerd, en een exacte klinische behandeling ontbreekt ook. Daarom zijn nieuwe doelen dringend nodig om de prognose van de ziekte te verbeteren.

MicroRNA's (miRNA's) zijn endogene non-coderende RNA's die de expressie van proteïne-coderende genen kunnen reguleren. MiR-133a, als een van de cardio-specifieke miRNA's, is geïmpliceerd in de hartenontwikkeling en sommige cardiovasculaire ziekten, waaronder myocardinfarct (MI). Bovendien is miR-133a degene die aberrant tot expressie komt in chronische Chagas-ziekte-cardiomyopathie. Verder is miR-133a-niveau in myocardium verbonden met ontsteking, linkerventrikelfunctie en klinische uitkomst in inflammatoire cardiomyopathie. MiRNA's werden gevonden in exosomen afgeleid van muis en humane mastcellen. Exosomen, nanosized vesikels vrijgegeven door de meeste celtypen, worden gevonden in verschillende biologische vloeistoffen. Exosomen hun lading overbrengen naar ontvangercellen, wat getoond is om de biochemische samenstelling en signaleringspaden van de ontvangercellen te veranderen. Bewijs heeft getoond dat veranderde exosomale miRNA's verbonden zijn met de pathogenese van CVB3-geïnduceerde myocarditis. Er is aangegeven dat exosomale miR-125b-5p van hypoxie-geconditioneerde botmarge mesenchymale stamcellen cardiomyocyta apoptose vermindert en ischemische cardiale herstel verbetert. Bovendien verlicht exosomale miR-25-3p van MSC's MI door cardiomyocyta-apoptose en inflammatoire reactie te verminderen. Van belang, exosomale cardiaal-exprimereerde miR-133a is verbonden met de cardiale troponine-cardiale troponine-I. Mastermind-achtige 1 (MAML1) was een gecross-screend downstream-gen van miR-133a in onze studie wat gerapporteerd is betrokken te zijn bij myocardiale ischemie/herperfusie (I/R) letsel. Ook heeft een recent onderzoek vermeld dat MAML1-knockdown de anti-fibrotische functie in leverfibrose bezit.

Geïnspireerd door eerdere studies, vraagt men zich af of BMSC-afgeleide exosomale miR-133a myocarditis kan mediëren. Daarom werd deze studie gestart met de hypothese dat miR-133 geshuttled door BMSC-afgeleide exosoom (BMSC-Exo) myocardiale fibrose en epitheliaal-mesenchymale transitie (EMT) in VMC-ratten verbetert door regulatie van MAML1.

Materialen en Methoden

Ethische Goedkeuring

De studie was toegestaan door het Institutioneel Dierverzorgings- en Gebruikscomité van het Vierde Geaffilieerde Ziekenhuis van Zhejiang Universiteit School of Medicine. Dieren werden humaan behandeld.

Isolatie van BMSC's

Experimentele dieren waren volwassen specifieke pathogen-vrije (SPF) graad Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten (Experimenteel Dierencentrum van Zhejiang Universiteit School of Medicine, Zhejiang, China). De ratten werden geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie met pentobarbitaal-natrium en gesteriliseerd met 75% alcohol. De femur en tibia werden op een ultra-schoon tafel genomen, de spier en bindweefsels werden verwijderd, en de mergkamer werd herhaaldelijk gespoeld met laag-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). De vloeistof gecentrifugeerd om de neerslag te verzamelen die opnieuw opgeschud werd en 24 uur geïncubeerd (het medium werd elke 2-3 dagen veranderd). Toen ze de logaritmische fase bereikten, werden BMSC's losgemaakt met 0,25% trypsin (Gibco, Carlsbad, Californië, VS), gecentrifugeerd en heropgelost in MSC-kweektmedium (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, China). De suspensie werd gepasseerd met een verhouding van 1:2. De bovenstaande bewerking werd herhaald, en de 4e passage BMSC's werden gebruikt voor volgende experimenten.

Identificatie van BMSC's

De oppervlakte-antigenen van de 4e passage BMSC's in logaritmische groei werden geïdentificeerd door stroomcytometrie. De BMSC's werden losgemaakt met 0,25% trypsin (1 mL) bevattende ethyleendiamine-tetraacetaatzuur, gecentrifugeerd, heropgelost met geschikte fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en gecentrifugeerd op 151 g. De BMSC's werden vervolgens heropgelost met PBS bevattende 2% verse foetale kalverseerum (FBS) (Gibco) om een enkel-cel-suspensie te maken. FITC-CD34, PE-CD29, en PE-CD44 monoclonale antilichamen (5 μL elk, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) werden geïncubeerd met de celsuspensie (100 μL), gecentrifugeerd op 151 g, heropgelost met 500 μL PBS bevattende 1% paraformaledehyde en 30 minuten vastgelegd. De achtergrondmarkers werden geïdentificeerd via het gebruik van monoclonale antilichamen van de homotype controle.

Stroomcytometrie: de enkel-cel-suspensie werd vastgelegd en gecentrifugeerd op 151 g. Vervolgens werden de BMSC's heropgelost met PBS bevattende 1% paraformaledehyde, getest op de MACS Quart stroomcytometer en geanalyseerd door de corresponderende software.

Inductie van Osteogenese en Adipogenese van BMSC's

BMSC's in de 4e passage wurden gezaaid in 6-gatenplaten met 200 cellen/mL. De osteoblaast-inductieoplossing en adipogene-inductieoplossing (Cyagen Biosciences Inc.) werden toegevoegd aan BMSC's van 60-70% confluentie. BMSC's in andere twee putten werden niet met inductievloeistoffen toegevoegd als controles. De BMSC's werden 14 dagen geïnduceerd en vastgelegd met 4% paraformaledehyde. Vervolgens werden de gedifferentieerde osteoblasten en adipocyten geïmplementeerd met Alizarine-rood-kleuring en olie-rood-O-kleuring (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, China), en waargenomen onder een microscoop.

Exosoom-isolatie en identificatie

BMSC's in de 4e passage werden 48 uur gekweekt om het supernatant te oogsten wat vervolgens gecentrifugeerd werd (800 g en 2000 g), gefiltreerd met 0,22 µm en 100.000 MW-filtermembranen, en gecentrifugeerd (100.000 g) om de neerslag te verzamelen. Vervolgens werden de neerslagen heropgelost met PBS, gecentrifugeerd op 100.000 g opnieuw om exosoom-neerslag te verkrijgen. De BMSC-Exo-suspensie in PBS werd onderworpen aan concentratiedetectie door bicinchoninezuur (BCA) en exosoom-merkerproteïne detectie (CD63, CD81 en CD9) door western blot-analyse (Proteintech, Chicago, IL, VS).

Recombinante Adenovirus-infectie Medieert miR-133a-genmodificatie van BMSC's

BMSC's werden overnight gepasseerd. De normale controle (gelijk hoeveelheid PBS), de miR-133a-negatieve controle (NC), de miR-133a-over-expressie (Ad-miR-133a), en miR-133a-laag-expressie (Adas-miR-133a) (Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) werden getransfecteerd met BMSC's in lijn met 100 multiplicitie van infectie (MOI). De BMSC's werden gekweekt, en de corresponderende exosomen (NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, en Adas-miR-133a^Exo) werden verkregen door ultracentrifugatie.

Vestiging van VMC-model in Ratten en Groepering van Experimentele Dieren

Volwassen mannelijke SPF-graad SD-ratten werden verdeeld in 10 groepen, met acht ratten elk. Coxsackievirus B3 (CVB3) werd geleverd door het Instituut voor Medische Biotechnologie, Chinese Academie van Medische Wetenschappen (Peking, China).

CVB3 (10 mg/kg) werd intraperitoneaal in ratten geïnjecteerd terwijl PBS of BMSC-Exo (100 µg) door de staartvleugel geïnjecteerd werd. Normale ratten voor controles werden geïnjecteerd met CVB3-kweektoplossing en PBS. Ratten geïnjecteerd met 10 mg/kg CVB3 werden verder geïnjecteerd met PBS, MSC^exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC, of si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, China).

De ratten werden continu 7 dagen geïnjecteerd en het oogbloed werd verkregen. Het bloed werd gecentrifugeerd en het serum verzameld, onderverdeeld, en opgeslagen bij -20 °C. Na de ratten geëuthanaseerd waren, werden de hartspecimens genomen, vastgelegd met 10% formaldehyde, gedeshydrateerd met gradient-alcohol, opgehelderd met xyleen en in paraffine ingebed, gesneden voor histologische observatie. Een deel van de coupes werd op -80 °C geplaatst als het moleculair-biologische experimentmateriaal.

Echocardiografie

Op de 7e dag na virusinjectie, werden de ratten intraperitoneaal geïnjecteerd met pentobarbitaal-natrium 25 mg/kg. Na volledige anesthesie, werd de ledemaat van het electrocardiogram-apparaat verbonden met de elektrodenaal subcutaneously ingeslagen aan de uiteinden van de ledematen van de ratten, en het ledemaat-electrocardiogram werd vastgelegd. Vervolgens werden de ratten vastgezet op de rugpositie licht naar links, de borst werd onthaard, en de II-leiding electrocardiogram werd verbonden om het Dopplerspectrum van de bloedstroompuls van de aorta in de parasternale vier-kamer-hartdoorsnede te verkrijgen. Indicatoren omvatten linkerventrikel-posteriorwanddikte (LVPW), linkerventrikel-eind-systolische diameter (LVIDs), linkerventrikel-verkortingsfractie (FS), en linkerventrikel-uitworpfractie (LVEF).

Hematoxyline-Eosine (HE) Kleuring

De weefsels werden vastgelegd met 4% paraformaledehyde, gedeshydrateerd, opgehelderd, en in paraffine ingebed. Vervolgens werden de 4-µm coupes gedewaxt, gekleurd met hematoxyline (Servicebio, Wuhan, China), gedifferentieerd met 1% chlorwaterstofzuur-alcohol, terug naar blauw, en gekleurd met eosine, gedeshydrateerd, opgehelderd met xyleen, geseald met neutrale gom, en waargenomen onder een optische microscoop (Olympus, Tokio, Japan).

Masson-kollegeen-kleuring

Paraffine-coupes werden gedewaxt, gekleurd met hematoxyline minder dan 2 min, gekleurd met Lichun-magentaooplossing, en snel gespoeld met 0,5% azijnzuuroplossing. Vervolgens werden de coupes gekleurd met 1% aluminiumfosfaat-wateroplossing, gekleurd van donkerrood naar helderrood naar roze, en waargenomen onder een microscoop. Vervolgens werden de coupes gekleurd met Aniline-blauw (Pulande), conventioneel gedeshydrateerd met xyleen en geseald. Medische beeldanalyse-software Image-Proplus 6.0 werd gebruikt om het positieve kleuringsoppervlak van kollagevezel te meten, en kolgeen-volume-fractie (CVF) = kollageoppervlak/totaal-veldoppervlak. De kleuringslocatie en kleur van kollagevezel werden onderscheiden (de cardiomyocyten waren rood, en de kollagevezel waren blauwe banden of homogene structuren in de intercellulaire ruimte).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Gemedieerde Deoxyuridine Trifosfaat-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) Kleuring

Paraffine-coupes werden gedewaxt, in het citraatbuffer geplaatst en gebakken bij 350 W gedurende 10 min. De coupes werden toegevoegd met 50 μL TUNEL-oplossing, verbonden met 50 μL conversie-agent-peroxidase, ontwikkeld met DAB, en waargenomen onder de microscoop. De coupes werden in hematoxyline geplaatst, gedopt met 95% ethanol I-II, verbonden met anhydrous ethanol I-II, xyleen I-II, en geseald. De resultaten werden geanalyseerd onder een optische microscoop.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tumornecrosefactor α (TNF-α), interleukine (IL)-1β en IL-6 werden gedetecteerd door ELISA-kits (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, China). Het oogbloed werd gecentrifugeerd op 604 g om het bovengelegen serum te verzamelen. Het supernatant verkregen door centrifugatie van celkweektmedium werd gedetecteerd in celeperiment. Er waren zeven concentratiegradienten in de verdunningsstandaard van monsters. De lege put werd verbonden met monsterverdunner, en een andere put werd toegevoegd met tetramethylbenzidine (TMB), twee duplicaatputten werden ingesteld voor elke concentratie. De monsterputten werden verbonden met 50 μL van monsterverdunner en de monsters op beurt. Elke put werd gereageerd met 100 μL van primaire antilichaam (behalve TMB-put) gedurende 1 uur, evenals met 300 μL van 0,01 M tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en 100 μL Avidine-Biotine-Peroxidase-Complex werkoplossing (behalve TMB-put). Vervolgens werd elke put toegevoegd met 300 μL van 0,01 M TBS en geïncubeerd met 100 μL TMB. De optische dichtheid (OD)-waarde en de concentratie van elke put werden onmiddellijk gemeten en de standaardcurve getekend.

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Kettingreactie (RT-qPCR)

MiR-133a, kollageen I, kollageen III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadherin, en FSP-1-expressie in myocardiale weefsels en cardiomyocyten werden gedetecteerd via RT-qPCR. De totale RNA werd geëxtraheerd uit cardiomyocyten of myocardiale weefsels en omgekeerd getranscribeerd naar cDNA via RNA-extractiekit (Takara, Dalian, China), en RT-PCR-primers werden gesynthetiseerd via Invitrogen (Guangzhou, China), de sequenties zijn getoond in Tabel 1. Relatieve kwantitatieve genexpressie werd geanalyseerd door gebruik te maken van glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase (GAPDH) of U6 als de laadcontrole-genen volgens 2^−ΔΔCt methode.

Western Blot Analyse

De ratten werden geëuthanaseerd met anesthesie. De myocardiale weefsels werden bevroren en gemalen in vloeibare stikstof. Vervolgens werd protease-inhibitor fenylmethaansulfonylfluoride voorraadoplossing gemengd met cellysisbbuffer met een verhouding van 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). De monsters werden gelyst met gemengde oplossing en proteïnen van de cellen werden geëxtraheerd. De totale proteïneconcentratie werd gedetecteerd met de BCA-kit. De monsters werden gemengd met 5 × laadbuffer bij 4:1, geïmplementeerd met kookwaterbad voor 10 min, ijskoud, en gecentrifugeerd. Electroforese-scheiding werd uitgevoerd, en de proteïnen werden overgebracht naar polyvinylidene-fluoride (Servicebio) membraan met een electrische overbrengoplossing. Vervolgens werd het membraan geblokkeerd met 5% ontvette melkpoeder, en verbonden met primaire antilichamen CD63, CD81, en CD9 (konijn anti-rat polyclonale antilichamen van Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, VS, 1:1000), en GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, VS, 1:1000). Vervolgens werd het membraan gedropt met het secundaire antilichaam, peroxidase-gelabeld IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS, 1:1000), en gedompeld in versterkte chemiluminescentie-reactieoplossing (Pierce, Rockford, IL, VS). Met GAPDH als de laadcontrole, werden proteïne-afdruk-afbeeldingen geanalyseerd met ImageJ2x-software.

Cardiomyocietkweek en Passage

SD-ratten van 3-5 dagen oud (Experimenteel Dierencentrum van Zhejiang Universiteit School of Medicine, Zhejiang, China) werden genomen. Het ventrikelgedeelte werd gespoeld met voorverkoeld Hank's Balanced Salt Solution, in kleine stukjes gesneden, en losgemaakt met 0,25% trypsin. De stukjes werden toegevoegd met geschikte hoeveelheid 10% compleet medium voor beëindiging van losmaking en gecentrifugeerd op 151 g. DMEM bevattende 20% FBS werd toegepast voor cel-heroplossing. Cardiomyocyten werden gezuiverd door differentieel hechtingsmethode, en de overlevingssnelheid werd waargenomen via trypan-blauw-kleuring, de overlevende cardiomyocyten werden gekweekt. Na 24 uur hechten de cardiomyocyten aan de wand en begonnen te pulseren. Na 72 uur breidden de pseudopodia zich uit.

Constructie van VMC-model van Cardiomyoceel

Cardiomyocyten in de 4e passage in de logaritmische groeifase werden geselecteerd en geïnfecteerd met MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, en Ad-miR-133a^Exo. De 100 Tcid50 CVB3-virusoplossing (100 μL) werd aan de cellen toegevoegd om een cel-VMC-model te induceren. Op hetzelfde moment werd gelijkwaardig hoeveelheid onderhoudsoplossing aan de cellen toegevoegd voor een controle, en corresponderende exosomen werden aan cardiomyocyten toegevoegd na 1-uurs infectie voor 48-uurs kweek.

Cel-telingskit (CCK)-8 Assay

CCK-8-celdetectiekit (Beyotime) werd toegepast om de overlevingssnelheid van cardiomyocyten te detecteren. Toen ze de logaritmische fase bereikten, werden de cellen losgemaakt met 0,25% trypsin, en gezaaid in 96-putcellenkweektplaat bij 2,5 × 10⁴ cellen/per put. Toegevoegd met CCK-8-oplossing (10 μL/put), werden de cellen voortdurend 1-4 uur gekweekt, en de OD_{450 nm}-waarde werd gemeten via een microplaatlezer.

Stroomcytometrie

AnnexinV-APC/propidium-iodide (PI) dubbele kleuringmethode werd toegepast om celdood te detecteren. De cellen werden gecentrifugeerd, heropgelost met 250 μL Binding Buffer (4 mL Binding Buffer + 12 mL gedemineraliseerd water), en aangepast aan 1 × 10⁶ cellen/mL. De 100 μL celsuspensie werd toegevoegd met 5 μL Annexin V-APC (BD Biosciences) en 5 μL PI-oplossing (BD Biosciences), geladen op de stroomcytometer, en automatisch geanalyseerd door een computer.

Dubbele Luciferase Reporter Genanalyse

De wild-type (wt) of mutante-type (mut) sequentie van MAML1 3-onvertaalde regio (UTR) werd gekloneerd in pGL3-M vector (Promega, WI, VS), toen MAML1-3-UTR-wt of MAML1-3-UTR-mut gegenereerd werden. De vectoren, tezamen met miR-133a-mimic of NC, werden co-getransfecteerd in cardiomyocyten via Lipofectamine 2000. De luciferase-activiteit werd 48 uur later getest door het dubbele luciferase-reporter-gensysteem (Promega).

RNA-immunoprecipitatie (RIP) Assay

RIP-kit (Millipore, VS) werd gebruikt om de binding van MAML1 en miR-133a te detecteren. Cellen werden gelyst door radio-immunoprecipitatie-assay-buffer (P0013B, Beyotime, Shanghai, China), gecentrifugeerd op 1400 g en geïncubeerd met antilichamen om te co-precipiteren. Magnetische kralen (50 μL) werden heropgelost in 100 μL RIP-wasbuffer en geïncubeerd met 5 g anti-MAML1-antilichaam (1 g/mL, ab155786) of IgG (1:100, ab172730). Het magnetische-kraal-antilichaam-complex werd heropgelost in 900 μL RIP-wasbuffer, geïntegreerd met 100 μL celextract, verteerd met protease K, en gedetecteerd door RT-qPCR.

Statistische Analyse

SPSS 21.0 statistische software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) werd toegepast voor analyse van de data. De meetdata werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. De t-toets werd toegepast op vergelijkingen tussen twee groepen. Eensijdige variantie-analyse (ANOVA) werd gebruikt voor vergelijking tussen groepen, en Tukey's post-hoc-toets voor pairwise vergelijkingen. Voorspellers werden bewaard als ze significant waren bij een P-waarde van 0,05 of kleiner.

Resultaten

Identificatie van BMSC's en BMSC-Exo

Microscopisch waren BMSC's spindlevormig en afgerond, en hechtten aan de wand in een vortex- of radiaal patroon (Fig. 1A). Na olie-rood-O-kleuring van adipogene-inductie, waren de lipidedruppels van de 4e BMSC's rood, en er waren ronde lipidedruppels van verschillende groottes (Fig. 1B). Na inductie van osteogenese, toonden de cellen die gekalcificeerde knopen uitdrukten rood na alizarine-rode-kleuring, en ongelijke verdeling van gekalcificeerde knopen en overlappende cellen (Fig. 1C). Stroomcytometrie manifesteerde dat de MSC-markers CD29 en CD44 (> 95%) tot expressie kwamen, maar het hematopoietische stamcel-oppervlakte-antigeen CD34 (< 95%) niet tot expressie kwam (Fig. 1D). Deze resultaten manifesteerden dat de BMSC's van hoge zuiverheid waren en voldeden aan MSC-standaarden van de Internationale Vereniging voor Celtherapie.

Transmissie-elektronenmicroscopie observeerde dat BMSC-Exo's ovale vesikels waren met duidelijke perifeer membraanstructuur, verschillende groottes, en een diameter van 40-100 nm (Fig. 1E). Western blot-analyse demonstreerde dat de geëxtraheerde producten exosoom-georigineerde karakteristieke proteïnen van CD9, CD63, en CD81 uitdrukten (Fig. 1F).

Verhoogde Exosomale miR-133a Verbeterde de Symptomen van Myocarditis

De transfecie van BMSC's met miR-133a-recombinante adenovirus werd waargenomen (Fig. 2A). Een groot aantal groene fluorescentie-expressie van NC, Ad-miR-133a, en Adas-miR-133a werden waargenomen onder de geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, wat aangeeft dat recombinante adenovirus-vector effectief BMSC's kon transfecteren. Om de transfictie-efficiëntie van miR-133a te testen, werd miR-133a-expressie in BMSC's en hun exosomen gemeten door RT-qPCR. Het werd ontdekt dat miR-133a-up-regulatie miR-133a-expressie verhoogde terwijl miR-133a-down-regulatie miR-133a-expressie verlaagde (Fig. 2B). Vervolgens injecteerden we exosomen bevattende miR-133a in ratten. Onder de geïnverteerde fluorescentiemicroscoop werd groene fluorescentie-expressie waargenomen in VMC-ratten na behandeling van NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, of Adas-miR-133a^Exo, wat aangeeft dat de recombinante adenovirus-vector myocardiale weefsels van ratten infecteerde (Fig. 2C). RT-qPCR-experiment vond ook dat miR-133a-expressie in VMC-ratten blijkbaar afnam; miR-133a-expressie was duidelijk verhoogd in VMC-ratten geïnjecteerd met Ad-miR-133a^Exo maar afgenomen in VMC-ratten geïnjecteerd met Adas-miR-133a^Exo (Fig. 2D). Wat de algemene toestand van ratten betreft, werd waargenomen dat de algemene toestand van normale controle-ratten normaal was, en de kenmerken van VMC blijkbaar uitgedrukt waren in VMC-ratten en VMC-ratten geïnjecteerd met Adas-miR-133a^Exo, zoals ruwe en onordelijke haren, dyspnee, en weinig dieet. In VMC-ratten behandeld met MSC^Exo, NC^Exo, en Ad-miR-133a^Exo, werden deze tekens in verschillende maten verbeterd. Het gewicht van de VMC-ratten nam continu af vanaf 1 dag na infectie, en injectie van MSC^Exo, NC^Exo, of Ad-miR-133a^Exo verhoogde het gewicht van ratten. Het gewicht van de VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a^Exo was duidelijk verhoogd en het gewicht van de VMC-ratten geïnjecteerd met Adas-miR-133a^Exo was duidelijk afgenomen (Fig. 2E).

De myocardiale functie-observatie suggereerde dat (Fig. 2F), de VMC-ratten verhoogde LVPW en LVIDs hadden, en verminderde FS en LVEF. Na exosoom-injectie, gedaalde LVPW en LVIDs, en duidelijk verhoogde FS en LVEF toonden zich in VMC-ratten. Adas-miR-133a^Exo behandeling verergerde terwijl Ad-miR-133a^Exo myocardiale functie in VMC-ratten verbeterde.

Verhoogde Exosomale miR-133a Remt Ontsteking in Myocardiale Weefsels van VMC-ratten

HE-kleuring manifesteerde dat de myocardiale vezels in normale controle-ratten nauw gerangschikt waren en er geen inflammatoire cel-infiltratie in het mesenchym was. De cardiomyocyten in de VMC-ratten waren ongerangschikt en het mesenchym was geïnfiltreerd door een groot aantal inflammatoire cellen. De cardiomyocyten in VMC-ratten geïnjecteerd met MSC^Exo of NC^Exo waren ordelijk gerangschikt, met een kleine hoeveelheid inflammatoire cellen die infiltreerden in het mesenchym. De cardiomyocyten in VMC-ratten na Adas-miR-133a^Exo behandeling waren ongerangschikt, en de inflammatoire cellen in het mesenchym werden geïnfiltreerd. De cardiomyocyten in VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a^Exo waren ordelijk gerangschikt zonder duidelijke inflammatoire cel-infiltratie (Fig. 3A).

ELISA gaf aan dat (Fig. 3B, C) inflammatoire factoren (TNF-α, IL-1β, en IL-6) duidelijk verhoogd waren in VMC-ratten. De VMC-ratten geïnjecteerd met Ad-miR-133a^Exo hadden verlaagde niveaus van inflammatoire factoren. Adas-miR-133a^Exo behandeling veroorzaakte verhoogde inflammatoire factoren in VMC-ratten.

Verhoogde Exosomale miR-133a Vermindert CVF in Myocardiale Weefsels van Ratten met VMC

Masson-kleuring onthulde dat de myocardiale vezels in normale ratten nauw gerangschikt waren, met bijna geen blauwe kollagevezel. Na CVB3-injectie, waren de cardiomyocyten hypertrof, met bindweefselhyperplasie en een groot aantal blauwe kollagevezel, en CVF was duidelijk verhoogd. Behandeld met exosomen, waren de cardiomyocyten ordelijk gerangschikt, intercellulaire bindweefselhyperplasie was verminderd, blauwe kollagevezels en CVF waren duidelijk verminderd. De myocardiale intercellulaire ruimte van VMC-ratten geïnjecteerd met Adas-miR-133a^Exo was verbreed, de cellen waren duidelijk vergroot, de blauwe kollagevezels en CVF waren duidelijk verhoogd; de intercellulaire ruimte was verminderd, de verdeling van blauwe kollagevezels en de CVF waren verminderd van VMC-ratten met Ad-miR-133a^Exo behandeling (Fig. 4A, B).

Verhoogde Exosomale miR-133a Vermindert de Expressie van Kollageen I, Kollageen III, TGF-β1, en CTGF in Myocardiale Weefsels van Ratten met VMC

Kollageen I en kollageen III zijn de hoofdbestanddelen van kollageen, die voornamelijk verdeeld zijn in celjuncties en celmembranen, intercellulaire stof, en cytoplasma. TGF-β1 en CTGF zijn de kenmerkende proteïnen van fibrose. Bevindingen van RT-qPCR demonstreerden dat kollageen I, kollageen III, TGF-β1, en CTGF mRNA-expressieniveaus verhoogd waren in VMC-ratten, maar afnamen na exosoombehandeling. De VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a^Exo hadden verminderde mRNA-expressieniveaus van kollageen I, kollageen III, TGF-β1, en CTGF terwijl de VMC-ratten na Adas-miR-133a^Exo behandeling het tegenovergestelde vertoonden (Fig. 5A–C).

Verhoogde Exosomale miR-133a Vermindert de Cardiomyocyta-apoptose in Myocardiale Weefsels van Ratten met VMC

TUNEL-kleuring toonde dat de apoptotische cardiomyocyten bruinzwart of bruingeel waren met kerncondensatie. Het aantal apoptotische cellen was verhoogd in VMC-ratten wat geattenueerd zou worden door exosoombehandeling. De VMC-ratten geïnjecteerd met Ad-miR-133a^Exo hadden verminderd aantal apoptotische cellen en die geïnjecteerd met Adas-miR-133a^Exo hadden verhoogd aantal apoptotische cellen (Fig. 6A, B).

Verhoogde Exosomale miR-133a Onderdrukt EMT in Myocardiale Weefsels van Ratten met VMC

E-cadherin, α-SMA, en FSP-1 zijn sleutelindicatoren van EMT. Resultaten van RT-qPCR demonstreerden dat α-SMA en FSP-1 mRNA-expressieniveaus verhoogd waren en E-cadherin mRNA-expressieniveau verlaagd was in VMC-ratten. Daarnaast waren α-SMA en FSP-1 mRNA-expressieniveaus verminderd en E-cadherin mRNA-expressieniveau verhoogd in VMC-ratten na exosoombehandeling. α-SMA en FSP-1 mRNA-expressieniveaus waren verhoogd en E-cadherin mRNA-expressieniveau was verlaagd in VMC-ratten behandeld met Adas-miR-133a^Exo, terwijl de expressie van deze indicatoren tegenovergesteld was in VMC-ratten geïnjecteerd met Ad-miR-133a^Exo (Fig. 7A, B).

Verhoogde Exosomale miR-133a Remt Ontsteking van Cardiomyocyten in VMC

Als resultaat, ving fluorescentiemicroscopie groene fluorescente expressie op in VMC-ratten behandeld met NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, of Adas-miR-133a^Exo, wat aangeeft dat de recombinante adenovirus-vector cardiomyocyten van ratten infecteerde (Fig. 8A). RT-qPCR en ELISA ontdekten dat (Fig. 8B, D) miR-133a-expressie verminderd was en inflammatoire factoren (TNF-α, IL-1β, en IL-6) verhoogd waren in VMC-ratten, wat omgekeerd zou worden door exosoombehandeling. De VMC-ratten behandeld met Ad-miR-133a^Exo hadden opgereguleerde miR-133a en verminderde inflammatoire factoren in VMC-ratten, terwijl die behandeld met Adas-miR-133a^Exo verminderde miR-133a en verhoogde niveaus van inflammatoire factoren in VMC-ratten vertoonden.

Verhoogde Exosomale miR-133a Bevordert Cellevensvatbaarheid, en Onderdrukt Apoptose van Cardiomyocyten in VMC

De apoptose en de cellevensvatbaarheid werden gedetecteerd via AnnexinV-APC/PI dubbele kleuring en CCK-8-assay. De resultaten onthulden dat er een duidelijke toename was in apoptosesnelheid, een afname in cellevensvatbaarheid van cardiomyocyten in VMC-ratten. Exosoombehandeling verminderde apoptosesnelheid en verbeterde de levensvatbaarheid van cardiomyocyten. Adas-miR-133a^Exo verhoogde de apoptosesnelheid en verstoorde de levensvatbaarheid van cardiomyocyten in VMC-ratten. Ad-miR-133a^Exo behandeling functioneerde de tegenovergestelde effecten op cardiomyocyten van VMC-ratten (Fig. 9A–C).

miR-133a Targetteert MAML1

Het is gerapporteerd dat up-gereguleerde miRNA-193b myocardiale I/R-schade vermindert door MAML1 te targetteren. Gebaseerd op dat, hebben we downstream-genen van miR-133a gecross-screened via bioinformatics-websites PITA, miRanda, PicTar, microT en miRmap, en MAML1 geselecteerd als target van miR-133a (Fig. 10A). We construeren MAML1-wt of MAML1-mut, en co-transfecteerden cardiomyocyten met miR-133a-mimic of NC. De resultaten toonden aan dat miR-133a-mimic de luciferase-activiteit van MAML1-wt verminderde (Fig. 10B). Het RIP-experiment verifieerde de targetrelatie tussen miR-133a en MAML1 verder (Fig. 10C). RT-qPCR en Western blot-detectie van MAML1-expressie toonden aan dat MAML1-expressie verminderd was in cardiomyocyten getransfecteerd met miR-133a-mimic (Fig. 10D, E).

Inhibitie van MAML1 Heeft een Beschermend Effect op Ratten met Myocarditis en Keert het Effect van miR-133a-Geremde Exosomen op Ratten met VMC Om

Om het effect van miR-133a-gereguleerde MAML1 op ratten met VMC verder te bestuderen, injecteerden we si-MAML1 of si-NC-adenovirus in VMC-ratten of VMC-ratten die behandeld waren met miR-133a-gedempte exosomen. De injectiesucces werd gevalideerd door RT-qPCR en Western blot (Fig. 11A, B). De resultaten manifesteerden dat injectie van si-MAML1, het gewicht van VMC-ratten verhoogd was (Fig. 11C), cardiale functie verbeterd was (Fig. 11D–G), myocardiale weefselpathologie en fibrose geattenueerd waren (Fig. 12A–C), serum-ontsteking (Fig. 12D, E) en cardiomyocyta-apoptose (Fig. 13A–G) geremd waren. Ook werden de nadelige effecten van miR-133a-gedempte exosomen in VMC-ratten omgekeerd na injectie van si-MAML1.

Discussie

Myocarditis is een inflammatoire hartziekte die resulteert in DCM en hartfalen en het meest frequent geïnduceerd wordt door virale infecties zoals CVB3. Een studie heeft onthuld dat miR-133 cardiomyocyta-apoptose en elektrische remodellering in muizen met VMC verlicht. Bovendien worden veranderde exosomale miRNA's ook gevonden die gekoppeld zijn aan de pathogenese van CVB3-geïnduceerde myocarditis. Exosomen afgeleid van cardiale progenitatorcellen verlichten CVB3-geïnduceerde apoptose door de proliferatie van CVB3 in VMC te remmen. Deze studie onderzocht het regulatiemechanisme van BMSC-afgeleide exosomale miR-133 op myocardiale fibrose en EMT in VMC-ratten (Aanvullend bestand 1: Fig. 1).

De studie vond dat de expressie van miR-133a afnam in VMC. Zoals eerder gedemonstreerd, is miR-133a-expressie afgenomen in MI. Een studie heeft ook voorgesteld dat de relatieve expressie van miR-133 in muizenharten van de VMC duidelijk afnam in contrast met de controles. Er zijn enkele connecties van miRNA's met exosomen. De differentiele expressie van exosomen en van exosomale miRNA's in ziekte is beschouwd als biomarkers van ziekte met prestaties van non-invasieve klinische diagnostiek samen met hun therapeutische potentiëlen. Lin et al. hebben gevonden dat miR-133 speciaal gesorteerd is in hypoxie/heroxygenatie (H/R)-gecauseerde humane endotheliale progenitorcellen-afgeleide exosomen om fibroblasten-angiogenese en EMT te verhogen. Een andere studie heeft onthuld dat MSC's een communicatie vertonen met hersen-parenchymcellen en de neuriet-uitgroei kunnen moduleren door overdracht van miR-133b naar neurale cellen via exosomen.

De belangrijkste bevinding van dit werk manifesteerde dat verhoogde exosomale miR-133a cellevensvatbaarheid bevorderde, ontsteking, apoptose, EMT, en fibrose remde in ratten met VMC. Zij passen goed bij een eerdere studie dat miR-133a-stilting de Astragalus-polysacchariden behandeling-geïnduceerde osteosarcoma MG63-celproliferatie-inhibitie omkeert, samen met celdood-bevordering. Een andere studie heeft onthuld dat overgeëxprimeerde miR-133a angiogenese, apoptose, fibrose, en ontsteking onderdrukt, terwijl therapeutische cardiale remodellering in ischemische myocardiale ziekten versneld. Vergelijkbaar met onze studie, hebben Li et al. aangegeven dat miR-133 cardiomyocyta-apoptose remt door de expressie van apoptose-gerelateerde genen in de harten van VMC-muizen te reguleren. De overgeëxprimeerde miR-133a is gerapporteerd om hypoxie-geïnduceerde apoptose te onderdrukken en cardiomyocyta-overleving te versterken. Ondertussen kunnen de opgereguleerde serum-exosomale miR-30a en miR-181d potentiëlen hebben om toegepast te worden als biomarkers voor VMC-diagnose.

Een andere bevinding in onze studie was dat verhoogde exosomale miR-133a CVF verlaagde, de expressie van kollageen I en kollageen III verminderde in ratten met VMC. Een artikel heeft uitgelegd dat vrijgezette fibroblastengroeifactor-18 van een kollageen-membraan osteoblastische activiteit veroorzaakt die deelneemt aan down-gereguleerde miR-133a. In vitro overmatige expressie van miR-133a onderdrukt cardiomyocyta-hypertrofie en vermindert kollageen-expressie, zoals bewijzen in een andere studie. CVF is gelijk aan de verhouding van kollageen-oppervlak tot de som van myocardiale oppervlak en kollageen-oppervlak, en de gemiddelde waarde toont de CVF van de coupe. Deze bevinding wordt ook gerapporteerd door Wang et al. dat VMC-muizenmodel succesvol geconstrueerd is door CVB3-infectie, wat duidelijke hogere CVF-expressie manifesteert in contrast met de controlegroep. Bovendien is de bevinding consistent met die van Ferreira et al. die demonstreert dat miR-133a een grote rol kan spelen in de modulatie van genexpressie in chronische Chagas-ziekte-cardiomyopathie-pathogenese, met potentiële link als diagnostische en prognostische hulpmiddelen. Verder heeft bewijs getoond dat het knockdown van MAML1 de hypertrofie van vooraf-behandelde cardiomyocyten kan verminderen. In onze studie vonden we dat MAML1 het target-gen was van miR-133a en inhibitie van MAML1 de effecten van miR-133a-gedempte exosomen op ratten met VMC omkeerde. In myocardiale ischemie-herperfusie letsel, kon miR-193b-gemedieerde down-regulatie van MAMLI deels infarct en myocardiale enzymes verminderen, evenals apoptose van cardiomyocyten attenueren. Er is ook een rapport dat suggereert dat deficiëntie van MAML1 hepatische fibrogenese kan verlichten.

Conclusie

Concluderend biedt deze huidige studie bewijs dat miR-133a down-gereguleerd is in ratten met VMC, en verhoogde exosomale miR-133a verbetert cardiale functie en remt myocardiale fibrose en EMT in ratten met VMC, evenals verhoogt levensvatbaarheid en onderdrukt apoptose van cardiomyocyten in VMC door MAML1 te targetteren. Onze studie suggereert ook dat inhibitie van MAML1 een beschermend effect heeft op ratten met myocarditis en het effect van miR-133a-geremde exosomen op ratten met VMC omkeert. De identificatie van de exosomale miR-133a in myocardiale fibrose en EMT van myocarditis kan potentieel ons begrip van mechanismen die myocarditis ten grondslag liggen verbreden en ook klinische waarde dragen als een nieuw moleculair target. Meer onderzoek moet ondernomen worden om inroads te maken in de behandeling van deze ziekte.