F-actine medieert osteogene differentiatie van mesenchymale stamcellen op TiO₂-nanobuizen via MKL1 en YAP/TAZ

Samenvatting

Titaan en titaanlegeringen worden breed gebruikt in orthopedische implantaten. Het wijzigen van de nanotopografie biedt een nieuwe strategie om de osseointegratie van titaansubstraten te verbeteren. Filamenteuze actine (F-actine) polymerisatie, als een mechanische belastingstructuur, wordt over het algemeen beschouwd als betrokken bij celmigratie, endocytose, celdeling en celvormbehoud. Of F-actine betrokken is en hoe het functioneert in nanobuizen-geïnduceerde osteogene differentiatie van mesenchymale stamcellen (MSC's) blijft te onthullen. In deze studie fabriceren we TiO₂-nanobuizen op het oppervlak van een titaansubstraat door anodische oxidatie en karakteriseren hun kenmerken door scanning elektronenmicroscopie (SEM), Röntgen-energie-dispersieve analyse (EDS) en atoomkraftmicroscopie (AFM). Alkaliische fosfatase (ALP) kleuring, Western blotting, qRT-PCR en immunofluorescentiekleuring werden uitgevoerd om het osteogene potentieel, het niveau van F-actine en de expressie van MKL1 en YAP/TAZ te verkennen. Onze resultaten toonden aan dat de binnendiameter en ruwheid van TiO₂-nanobuizen toegenomen met de toename van de anodische oxidatiespanning van 30 tot 70 V, terwijl hun hoogte consistent 2 μm was. Verder, hoe groter de buisdiameter, des te sterker de capaciteit van TiO₂-nanobuizen om osteogene differentiatie van MSC's te bevorderen. Het inhibiteren van F-actine polymerisatie door Cyto D remde osteogene differentiatie van MSC's evenals de expressie van proteïnen in focale adhesiecomplexen zoals vinculine (VCL) en focale adhesiekinase (FAK). Integenstelling, na Jasp-behandeling, versterkte polymerisatie van F-actine de expressie van RhoA en transcriptiefactoren YAP/TAZ. Op basis van deze data concludeerden we dat TiO₂-nanobuizen de osteogene differentiatie van MSC's bevorderden, en deze capaciteit werd versterkt met de toenemende diameter van de nanobuizen binnen een bepaald bereik (30-70 V). F-actine medieerde dit proces via MKL1 en YAP/TAZ.

Inleiding

Titaan en titaanlegeringen, vanwege hun uitstekende biocompatibiliteit, corrosieweerstand en mechanische eigenschappen, worden breed gebruikt in klinische toepassingen zoals totale gewrichtsvervangingen en tandheelkundige implantaten. Er zijn echter nog veel uitdagingen te overwinnen, waaronder aseptische lossing en infectie. In de laatste jaren zijn een aantal studies gericht op het verbeteren van osseointegratie en antibacteriële eigenschappen uitgevoerd. Bijvoorbeeld, de MoS₂/PDA-RGD coating op titaanimplantaten kan niet alleen de integratie van een titaanimplantaat met het gastbeen bevorderen, maar ook bacteriële groei met hoge efficiëntie remmen. Bovendien heeft de oppervlaktetopografie steeds meer aandacht getrokken, en topografische modificatie verschilt van chemische modificaties door alleen de micro- en nano-schaalstructuur te veranderen. De stimulatie van chemische signalen op cellen is instabiel en cytotoxisch. In vergelijking kunnen veilige en controleerbare fysieke signalen sommige bijwerkingen vermijden die veroorzaakt worden door chemische moleculen. Daarom kan topografische modificatie van het oppervlak van implantaten en de regulatie van osseointegratie door topografische structuur een nieuwe manier bieden om het klinische probleem van slechte osseointegratie na implantatie van prothesen op te lossen.

Op het gebied van botweefseltechniek en botregeneratie wordt cel-morfologie interactie beschouwd als een veelbelovende beheerstrategie voor nauwkeurige controle van zaadcelfunctie en differentiatie. Tegelijkertijd heeft het bot zelf een elegante hiërarchie binnen de nanometer en micron bereik. Daarom kan oppervlaktemorfologie een vergelijkbare niche bieden, die de natuurlijke botstructuur kan nabootsen en osteogene differentiatie van mesenchymale stamcellen op het oppervlak van het gastbeen en implantaat kan bevorderen. Oppervlaktemorfologieën kunnen uit veel verschillende structuren bestaan, waaronder nanobuizen, nanodraden, nanoporen, enz. In het bijzonder hebben nanobuizenarrays in de laatste jaren uitgebreide belangstelling getrokken in veel velden vanwege hun unieke oppervlaktekenmerken, zoals hoge oppervlakte-volume verhouding, biologische plasticiteit en hoge adsorptiecapaciteit. Bijvoorbeeld, een nieuwe studie toont aan dat boornitride-nanobuizen (BNNT) een gasgevoelig materiaal vormen dat kan worden gebruikt als gassensor om de werking van transformators te monitoren door de samenstelling en inhoud van opgeloste gassen in olie te detecteren. In de biomedicine is oppervlaktetopografie ook in staat om cellulair gedrag te sturen, waaronder celmigratie, hechting, proliferatie en differentiatie. De recentste studies onthullen dat nanoschaal topografie mesenchymale stamcellen (MSC's) kan sturen om te differentieren in osteoblasten om vroege osseointegratie te versterken. Er is zelfs gerapporteerd dat gecombineerde micro- en nano-schaal oppervlaktemodificatie MSC's kan laten differentieren in contractiele gladde spiercellen. Echter, de moleculaire mechanismen van hoe oppervlaktetopografie celdestinatie stuurt, moeten nog worden ontrafeld, wat belangrijk is voor materiaalveiligheidsevaluatie en materiaalontwerp.

Filamenteuze (F)-actine, ook wel microfilament genoemd, is een van de drie hoofdcomponenten van het cytoskelet in eukaryotische cellen. Het is samengesteld uit polymeren van globulaire (G)-actine, gemodificeerd door talloze andere proteïnen. F-actine heeft structurele polariteit doordat alle subeenheden van het microfilament naar hetzelfde einde wijzen. Het baardede eind is gericht op een ander aangrenzend monomeer, terwijl het gepunte eind een actinesubeenheid bezit met de ATP-bindingsplaats blootgelegd. Dat wil zeggen, ATP is betrokken bij het transformatieproces tussen G-actine en F-actine. Dit proces is in een dynamisch evenwicht, met polymerisatie en depolymerisatie die gelijktijdig plaatsvinden, ook wel 'treadmilling' genoemd, vaak gezien in lamellipodia en filopodia. Daarom is het duidelijk dat actinedynamiek een belangrijke rol speelt in dergelijke cellulaire functies als celmigratie, celdeling en behoud van celvorm. Echter, F-actine fungert niet alleen als een fysieke structuur die mechanische belasting ondersteunt, maar deelt ook aan andere biologische gedragingen zoals signaaltransductie en genexpressie. Opstapend bewijs toont aan dat F-actine fysieke signalen kan omzetten in chemische signalen door te interacteren met andere proteïnen. Bijvoorbeeld, biomechanische en geometrische reconstructie bevorderen tumoraalst door het voorkomen van de superpositie van actine monomeer polymerisatie naar F-actine. Ultrasuimpulsen versterken osteogenese van humane mesenchymale stamcellen door het remmen van depolymerisatie van F-actine. Onze eerdere studie toonde ook aan dat mechanische spanning de stabiliteit van F-actine verhoogt. Omdat de holle structuur van nanobuizen minder hechtingplaatsen voor cellen biedt, is herrangschikking van het cytoskelet onvermijdelijk om het biomechanisch evenwicht te handhaven. Daarom hebben we zeker reden om te geloven dat F-actine waarschijnlijk medieert in nanotopografie-geïnduceerde celdifferentiatie.

In deze studie fabriceren we TiO₂-nanobuizen, wijzigen hun topografie door anodische oxidatie, en verkennen hun capaciteit om osteogene differentiatie van MSC's te bevorderen. Vervolgens onderzoeken we of F-actine een cruciale rol speelt in mechanotransductie. Cytochalasine D (Cyto D), die competitief bindt aan het baardede eind van F-actine om G-actine te voorkomen om in het filament te incorporeren, werd gebruikt om F-actine polymerisatie te remmen, en jasplakinolide (Jasp) werd gebruikt om de stabilisatie van de actine-assemblage te verbeteren. Verder wilden we ook verduidelijken hoe F-actine functioneert in het veranderen van fysieke cues in biochemische signalen. Gebaseerd op de resultaten van onze eerdere studie, hypotheseerden we dat de MAPK-route betrokken kan zijn in dit proces. Transcriptiefactoren zoals Yes-geassocieerd proteïne (YAP)/transcriptionele co-activator met PDZ-bindingsmotief (TAZ) en MKL1, die beschouwd worden als mechanosensoren en mechanotransductoren, waren ook het onderwerp van onze studie om te screenen hoe F-actine stamceldestinatie beïnvloedt, omdat sommige studies in andere gebieden impliceerden dat ze gerelateerd waren aan F-actine. In het algemeen hopen we de rol van F-actine in het proces van stamceldifferentiatie geïnduceerd door nanobuizen te verduidelijken, om het materiaalontwerp en de biosafety-assessment van door nanobuizen gemodificeerde implantaten te sturen.

Materialen en Methodes

Fabricatie van TiO₂-nanobuizen

Zuivere titaansneden (99,9% zuiverheid, 2 mm dikte; Shengshida, Hebei, China), gebruikt als substraat, werden gepolijst met siliconcarbide schuurpapier van korrel 400 en 1500. Monsters werden vervolgens achtereenvolgens gewassen met aceton, absolute alcohol en gedemineraliseerd water in een ultrasonische reinigingsmachine, en uiteindelijk gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Om de nanotopografie te fabriceren, werden de voorbehandelde monsters vastgezet als de anode, terwijl een platina stuk als de tegenkathode in een waterige elektrolytoplossing van 0,15 M NH₄F en 90% glycol gedurende 1 uur. De anodiseringspanning was een constante spanning van 30, 40, 50, 60 of 70 V. Na anodische oxidatie werd elk monster 30 min met gedemineraliseerd water gespoeld en 15 min met absolute alcohol in een ultrasonische reinigingsmachine gewassen. Ten slotte werden alle monsters gesteriliseerd in een autoklaaf bij 120 °C gedurende 1 uur en daarna vochtig gemaakt met cultuurmedium vóór gebruik.

The reactiemechanisme van nanobuizenfabricatie is niet duidelijk, en de huidige mainstream theorie is de veld-versterkte dissolutietheorie. De vorming van nanobuizenarrays is het resultaat van dynamisch evenwicht onder de werking van veldoxidatie, velddissolutie en chemische dissolutie (Fig. 1b). Het anodiseringsproces kan als volgt worden beschreven: in de eerste stap wordt een oxide barrièrelag gevormd op de elektrolyt-metaal interface: Ti⁴⁺ + 2H₂O → TiO₂ + 4H⁺. Dan verschijnen scheuren en smalle spleten op het oppervlak door veld-versterkte dissolutie van de oxidelaag. Diffusie van F⁻-ionen in deze scheuren en spleten versterkt de dissolutiesnelheid. Scheuren vergroten en worden verbonden met burenscheuren. Ten slotte bereiken de vormingssnelheid en dissolutiesnelheid van de titaniumoxidelag een dynamisch evenwicht, en de nanobuizen groeien niet meer: TiO₂ + 6F⁻ + 4H⁺ → [TiF₆]²⁻ + 2H₂O.

Oppervlaktekarakterisering

Monsters gefabriceerd met verschillende spanningen (30, 40, 50, 60 of 70 V) werden gespoeld met ethanol en gedemineraliseerd water gedurende 15 min, daarna gedroogd bij kamertemperatuur. Scanning elektronenmicroscopie (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) werd gebruikt om de oppervlaktestructuur te karakteriseren en de binnendiameter en hoogte van de nanobuizen te meten na coating van monsters met een dunne goudlaag. Tegelijkertijd werd Röntgen-energie-dispersieve analyse (EDS) uitgevoerd om de elementaire samenstelling van nanobuizen te analyseren. Atoomkraftmicroscopie (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, België) werd gebruikt om de oppervlaktemorfologie en oppervlakteruwheid van de monsters te onderzoeken. Drie verschillende gebieden werden geselecteerd van elk monster en de metingen werden driemaal herhaald.

Celkweek

Vier weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten werden aangeschaft van het experimentele dierencentrum van Shanghai Ninth People's Hospital (Shanghai, China). Rat botmerg mesenchymale stamcellen (BMSC's) werden aseptisch geïsoleerd uit femora en tibia's. BMSC's werden gezuiverd en verder uitgebreid in α-minimaal essentieel medium (α-MEM; Hyclone, Logan, UT, VS) bevattend 10% (v/v) foetaal kalfserum (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, VS), 100 mg/mL streptomycine (Gibco) en 100 U/mL penicilline (Gibco), en geïncubeerd bij 37 °C in een vochtige atmosfeer bestaande uit 95% lucht en 5% CO₂. Het cultuurmedium werd elke 2 dagen vernieuwd, en cellen werden getrypsiniseerd en gesubcultiveerd bij 80% confluentie. Alle cellen gebruikt in deze studie waren tussen passage 3 en 5. Osteogene inductiemedium was samengesteld uit groeimedium aangevuld met 100 nM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat en 50 mM ascorbijnzuur (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS).

Celproliferatie-assay

De TiO₂-nanobuizen-gemodificeerde titaansneden werden in cirkelvormige vormen gesneden en in putten van een 24-put celkweekplaat geplaatst. BMSC's tussen passage 3-5 werden gekweekt op TiO₂-nanobuizen met een dichtheid van 3×10⁴ cellen/schijf in ofwel groeimedium of osteogeen medium. Na 2 dagen celkweek, werden cytochalasine D (Cyto D, Sigma-Aldrich) en jasplakinolide (Jasp, Sigma-Aldrich), gebruikt om F-actine polymerisatie te verstoren, elke dag gedurende 3 dagen aan het medium toegevoegd. De finale concentratie en werktijd van Cyto D en Jasp waren respectievelijk 5 μM, 1 u en 2 μM, 3 u. Het cultuurmedium werd vernieuwd na incubatie met de reagentia. Celviabiliteit en proliferatie werden beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay (Dojindo, Kumamoto, Japan) 12 uur na Cyto D of Jasp behandeling. De cellen werden geïncubeerd met 10% (v/v) CCK8 oplossing gedurende 2 uur in een celincubator bij 37 °C onder 5% CO₂. Vervolgens overbrachten we 100 μL van het reactiemengsel in putten van een 96-put plaat en de absorbantie (OD) van het formazan kleurstofproduct in de kweek werd gemeten bij 450 nm met een Multiscan UV-zichtbare spectrophotometer (Safire2; TECAN, Mannedorf, Zwitserland). Bovendien telden we ook benaderende celgetallen met een geautomatiseerde celteller (AMQAX1000, Life Technologies). Voor celtelling werden BMSC's enzymatisch losgemaakt van TiO₂-nanobuizen en gekleurd met Trypaanblauw (Sigma-Aldrich).

Alkalische Fosfatase Kleuring en ALP Activiteitsanalyse

BMSC's werden gezaaid op vijf verschillende TiO₂-nanobuizen-gemodificeerde titaansneden (30, 40, 50, 60 of 70 V) met een dichtheid van 3×10⁴ per put en gekweekt in osteogeen medium. Reagentia werden toegevoegd zoals hierboven beschreven. Na 7 dagen incubatie, werden BMSC's gekweekt op TiO₂-nanobuizen driemaal gewassen met PBS, vastgezet met 4% paraformaldehyde, en geïncubeerd in alkalische fosfatase (ALP) werkoplossing van een ALP kit volgens de instructies van de fabrikant (Hongqiao, Shanghai, China). De resultaten werden waargenomen onder een stereomicroscoop na wassen met PBS.

Voor ALP activiteitsanalyse, werden cellen eerst gelyseerd met RIPA buffer zonder protease en fosfataase remmers, en daarna werden de gecentrerifugeerde lysaten geanalyseerd met een ALP Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China) volgens het protocol. De activiteit werd ten slotte genormaliseerd tot de eiwitconcentratie van het corresponderende lysaat.

Immunocytochemie

Na 3 dagen Cyto D en Jasp behandeling, werden BMSC's vastgezet met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min bij kamertemperatuur en daarna driemaal gewassen met PBS. De cellen werden gepermeabiliseerd met 0,3% Triton-X 100 gedurende 30 min, driemaal gewassen met PBS, en gekleurd met Rhodamine-geconjugeerde phalloïdine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Daarna werden cellen gespoeld met PBS, en tegengekleurd met DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na drie additionele wassen met PBS, werden monsters op een glasplaatje vastgezet en waargenomen door confocale microscopie.

Western Blotting

Om eiwitexpressie te evalueren, werden BMSC's gekweekt op TiO₂-nanobuizen geërnte met trypsine (Gibco). De cellen werden driemaal gewassen met PBS en gelyseerd met RIPA buffer aangevuld met een protease en fosfataase inhibitor cocktail gedurende 30 min op ijs. Het lysaat werd verzameld door centrifugatie bij 12.000×g gedurende 15 min bij 4 °C. De concentratie van totale eiwitten in het supernatans werd gemeten met een bicinchoninezuur (BCA) eiwitassay kit (Beyotime) volgens de instructies van de fabrikant. Laadbuffer werd toegevoegd aan eiwitmonsters zoals bovenstaand, welke vervolgens gekookt werden bij 95 °C gedurende 15 min. Voor Western blotting analyse, werd 10 μL van de eiwitbereiding geladen op een 12,5% SDS-PAGE gel (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, VS) en onderworpen aan electroforese bij 120 V gedurende 1 uur, daarna geëlectro-getransfereerd op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij 250 mA gedurende 2 uur. De membranen werden vervolgens geblokkeerd met 5-10% vetvrije gedroogde melk in TBST gedurende 1 uur op een schudder bij kamertemperatuur en geïncubeerd met primaire antilichamen verdund in verduinningsbuffer (Beyotime) bij 4 °C overnacht. Vervolgens werden fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in verduinningsbuffer toegevoegd aan de membranen na driemaal wassen met TBST gedurende 5 min, en de membranen werden vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. De eiwitbanden werden gedetecteerd door een tweekleurig infrarood fluorescentie imaging systeem (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, VS). In het bijzonder, als de banden van interne referentie-eiwit geunificeerd waren, werd het membraan gestript en opnieuw getest met een ander primaire antilichaam, gevolgd door hetzelfde proces. We gebruikten GAPDH antilichaam als ons interne referentie-eiwit om eiwitexpressie te normaliseren, en de andere primaire antilichamen gebruikt in deze studie waren anti-vinculine (1:1000 verduning, Abcam, Cambridge, MA, VS), anti-FAK (1:1000 verduning, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, VS), anti-Runx2 (1:1000 verduning, Cell Signaling Technology), anti-RhoA (1:1000 verduning, Cell Signaling Technology), anti-F-actine (1:500 verduning, Abcam), anti-Osx (1:500 verduning, Abcam) en anti-pYAP (1:1000 verduning, Cell Signaling Technology). Secundaire antilichamen waren geit anti-muis IgG H&L (IRDye® 680RD, 1:5000 verduning, Abcam) en geit anti-konijn IgG H&L (IRDye® 680RD, 1:5000 verduning, Abcam).

Kwantitatieve Real-Time PCR

Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd op dag 7 om de genexpressie van runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteocalcine (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculine (VCL), focale adhesiekinase (FAK) en megakaryoblastische leukemie 1 (MKL1) in cellen gekweekt in osteogeen medium op TiO₂-nanobuizen te evalueren. Totale RNA werd geëxtraheerd uit de cellen met een Total RNA Kit (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, VS). De concentratie en zuiverheid van RNA-monsters werden bepaald door optische dichtheid bij een golflengte van 260 en alleen monsters die zowel A260/280 verhoudingen als A260/230 verhoudingen hoger dan 1,8 presenteerden, werden geanalyseerd. RNA-monsters werden omgezet in cDNA met behulp van een qScript cDNA Synthesis kit (Takara, Shiga, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) met behulp van een QuantStudio 6 Flex real-time PCR systeem (Life Technologies). GAPDH, een housekeeping-gen, werd gebruikt als interne referentie. Data werden geanalyseerd met behulp van de vergelijkende Ct (2^-ΔΔCt) methode en uitgedrukt als vouwveranderingen vergeleken met de controle. De sequenties van de primers die gebruikt zijn, zijn vermeld in Tabel 1.

Statistische Analyse

Alle data zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten met triplicate monsters, tenzij anders aangegeven. Data worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Verschillen tussen groepen werden geëvalueerd door eensidige variantieanalyse gevolgd door de Student-Newman-Keuls post-hoc toets of Student's t-toets. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Oppervlaktekarakterisering

Om de nanotopografie te fabriceren, werden TiO₂-nanobuizen gevormd op een zuiver titaansubstraat door gebruik te maken van anodische oxidatieapparatuur bij verschillende constante spanningen (30, 40, 50, 60 en 70 V) gedurende 1 uur (Fig. 1). Een uniform verdeelde array van zelf-geassembleerde nanobuizen werd waargenomen door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Zij- en bovenaanzichten van de nanobuizen worden getoond in Fig. 2a, b. De hoogte van de nanobuizen in alle monsters in deze studie was ongeveer 2 μm, terwijl de binnendiameters van de nanobuizen ongeveer 74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V) en 148 nm (70 V) waren (Fig. 2c). Dit gaf aan dat de hoogte van de nanobuizen gerelateerd was aan de tijd van anodische oxidatie en de binnendiameter gerelateerd was aan de spanning van anodische oxidatie. Röntgen-energie-dispersieve analyse (EDS) werd vervolgens uitgevoerd om de elementaire samenstelling van de nanobuizen te analyseren. Dit toonde aan dat de nanubuizen slechts uit twee elementen bestaan, O en Ti (Fig. 2d, e). Atoomkraftmicroscopie (AFM) werd gebruikt om de nanobuisstructuren te detecteren en het rekenkundig gemiddelde van de afwijking van het profiel van nanobuizen te meten als de oppervlakteruwheid (Ra) (Fig. 2f). De data toonden aan dat de oppervlakteruwheid van nanobuizen toegenomen als de diameter (d.w.z. de spanning van anodische oxidatie) toegenomen (Fig. 2g).

TiO₂-nanobuizen geïnduceerde osteogene differentiatie van MSC's

Na 7 dagen osteo-inductie, werd ALP-kleuring allereerst uitgevoerd om osteogene differentiatie van MSC's te evalueren. De kleuringsresultaten toonden aan dat MSC's gekweekt op TiO₂-nanobuizen hogere ALP-activiteit hadden dan cellen gekweekt op een glad titaansubstraat (controle groep) (Fig. 3a). Statistische analyse van het kleuringsgebied toonde aan dat de capaciteit van nanobuizen om osteogene differentiatie te induceren significant verbeterd was vergeleken met de controle groep. Tegelijkertijd observeerden we een trend dat binnen het diameterbereik van dit experiment, hoe groter de diameter van de TiO₂-nanobuizen, des te sterker de capaciteit om osteogene differentiatie te induceren (Fig. 3b). Dus de 70 V groep werd gebruikt in volgende experimenten om de resultaten beter te tonen. Vervolgens analyseerden we osteogene genexpressie op dagen 3 en 7. MSC's gekweekt op TiO₂-nanobuizen gedurende 3 dagen en 7 dagen toonden beide significante promotie van de expressie van osteogene genen (RUNX2, ALP, OCN en OSX) vergeleken met de controle groep (Fig. 3d-g). Western blot resultaten bevestigden dat de eiwitexpressie van RUNX2 en OSX ook toegenomen na 7 dagen osteo-inductie (Fig. 3c). Interessant vonden we dat F-actine opgereguleerd was in de TiO₂-nanobuizen groep. Daarom was het duidelijk dat TiO₂-nanobuizen MSC's stuurden naar osteoblaastdifferentiatie, wat gerelateerd was aan de diameter van de nanobuizen. Onze resultaten suggereerden ook de betrokkenheid van F-actine in dit proces.

F-actine medieert osteoblaastdifferentiatie van MSC's op TiO₂-nanobuizen

Om verder te verkennen of F-actine betrokken was bij nanotopografie-geïnduceerde celdifferentiatie, gebruikten we twee reagentia, jasplakinolide (Jasp) en cytochalasine D (Cyto D), om F-actine polymerisatie op een positieve en negatieve manier respectievelijk te reguleren. De confocale photomicrografen van Rhodamine-Phalloidine kleuring toonden aan dat F-actine in de Cyto D behandelingsgroep bijna gedepolymeriseerd was en vezelstructuren zelden gezien werden, terwijl Jasp F-actine gestabiliseerd en gepolymeriseerd, geverifieerd door duidelijkere en helderdere bundel-achtige structuren dan waargenomen in de controle groep (Fig. 5a). Bovendien bevestigde Western blot analyse ook dat de eiwitexpressie van F-actine beïnvloed was, wat bewijst dat Cyto D en Jasp beiden werkten zoals verwacht (Fig. 5b). Celproliferatie-assay toonde aan dat Cyto D celproliferatie significant remde, terwijl Jasp celdgroei bevorderde (Fig. 4a). De celtelresultaten waren consistent met deze bevinding (Fig. 4b).

Vervolgens evalueerden we de capaciteit van MSC's om te differentieren in osteoblasten om te onderzoeken of F-actine dit proces medieerde. We detecteerden eerst ALP als een vroege marker van osteogenese. Vergeleken met de controle groep, verlaagde Cyto D behandeling de expressie van ALP en zijn activiteit, terwijl die in de Jasp behandelingsgroep opgereguleerd was (Fig. 4c, d). Consistent met dit resultaat, resulteerde Jasp behandeling in een toename van de eiwitniveaus van RUNX2 en OSX terwijl Cyto D het tegenovergestelde effect had (Fig. 4c). In overeenstemming hiermee, toonden de mRNA expressieniveaus van osteospecifieke genen, waaronder RUNX2, ALP, OCN en OSX, dezelfde trend na medicijnbehandeling (Fig. 4e-h). Alhoewel, deze data gaven aan dat F-actine een belangrijke rol speelde in het proces van osteogene differentiatie van MSC's geïnduceerd door TiO₂-nanobuizen. Het bevorderen van F-actine depolymerisatie remde de nanotopografie-geïnduceerde osteoblaastdifferentiatie terwijl de stabilisatie en polymerisatie van F-actine de osteoblaastdifferentiatie versterkte.

F-actine reguleert osteoblaastdifferentiatie van MSC's op TiO₂-nanobuizen via MKL1 en YAP/TAZ

Om het onderliggende mechanisme met betrekking tot F-actine in de regulatie van het lot van MSC's te ontrafelen, onderzochten we proteïnen/moleculen die direct interacteren met F-actine of F-actine polymerisatie beïnvloeden. Eerst probeerden we te identificeren hoe de nanotopografie het evenwicht tussen F-actine en G-actine beïnvloedde. TiO₂-nanobuizen als een fysiek signaal verschillen van membraandoorlaatbare chemische signalen en moeten dus sommige componenten van het celmembraan gebruiken om stimuli in de cellen over te brengen. Opstapend bewijs wijst erop dat het focale adhesiecomplex, waaronder integrine, taline, focale adhesiekinase (FAK), vinculine (VCL), tensine en andere proteïnen, fungeert als een signaaldrager, wat cellen informeert over de toestand van de extracellulaire matrix (ECM) en hun biologische gedrag beïnvloedt. Belangrijker nog, F-actine bindt aan integrines door dergelijke focale adhesiecomplexen, en vormt daarbij mechanische koppelingen tussen intracellulaire actinebundels en de ECM. Gevolgd analyseerden we de expressie van componenten van het focale adhesiecomplex. Resultaten toonden aan dat de eiwit- en mRNA-expressie van VCL en FAK consistent waren met de verandering van F-actine, wat aangeeft dat het focale adhesiecomplex betrokken was in het proces van osteogene differentiatie van MSC's geïnduceerd door TiO₂-nanobuizen (Fig. 5b en 6a, b). Bovendien vonden we ook dat RhoA, een klein GTPase-eiwit in de Rho-familie van GTPasen, opgereguleerd was in de Jasp-behandelingsgroep en geremd door Cyto D (Fig. 5b en 6a, b). RhoA is een belangrijk upstream signaaltransductie-molecuul in de MAPK-route, en kan worden gereguleerd door FAK. De primaire functie van RhoA is om de polymerisatie en stabiliteit van stressvezel (F-actine) en assemblage van het focale adhesiecomplex te bevorderen. Samen genomen, suggereerden deze data dat TiO₂-nanobuizen de F-actine polymerisatie kunnen beïnvloeden via het focale adhesiecomplex en RhoA.

Maar hoe reguleert F-actine celdestin? Meeste studies hebben aangetoond dat F-actine betrokken is bij celmigratie, celdeling, endocytose en met name tumorcellenvasie. Weinig studies hebben gesuggereerd dat F-actine ook celdifferentiatie kan reguleren, laat staan zijn specifieke moleculaire mechanisme. Gevolgd zochten we naar artikelen die de F-actine veranderingen noemden en vonden dat YAP/TAZ, twee nauw gerelateerde transcriptionele co-activatoren in de Hippo-signaalroute, die shuttelen tussen het cytoplasma en de kern, kunnen dienen als mechanotransductoren in de regulatie van MSC-differentiatie. Bovendien vonden we ook dat MKL1, een cruciale regulator van gladde spierceldifferentiatie, die interageert met de transcriptiefactor serumresponsfactor, kan binden aan G-actine en ook circuleren tussen het cytoplasma en de kern. Onze resultaten identificeerden uiteindelijk de betrokkenheid van YAP/TAZ en MKL1 in nanobuizen-geïnduceerde osteoblaastdifferentiatie gemedieerd door F-actine (Fig. 5b en 6d-f). Interessant, de eiwitexpressie van gefosforyleerde YAP toonde de tegenovergestelde trend, wat aangeeft dat niet alleen de expressie van YAP veranderde, maar de fosforylering van YAP ook veranderde door Cyto D en Jasp (Fig. 5b). Dit resultaat was consistent met het rapport dat de fosforylering van YAP/TAZ in het cytoplasma kan worden gesequestreerd.

Samenvattend, hebben onze resultaten voorlopig aangetoond dat F-actine osteoblaastdifferentiatie van MSC's op TiO₂-nanobuizen reguleert via MKL1 en YAP/TAZ (Fig. 7).

Discussie

Titaan en titaanlegeringen zijn de meest gebruikte metaalmaterialen in orthopedische klinische implantaten vanwege de goede eigenschappen van titaan. Echter, aseptische lossing is nog steeds een dringend probleem dat opgelost en verbeterd moet worden, en de sleutel ligt waarschijnlijk in het verbeteren van de integratie van het implantaat en het gastbeen. Eerdere studies hebben aangetoond dat oppervlaktecoating en modificatie of immobilisatie van biofunctionele moleculen gunstig zullen zijn voor osseointegratie. Recentelijk heeft de oppervlaktetopografie van implantaten de aandacht van veel onderzoekers getrokken dankzij studies naar de celrespons op fysieke cues. In deze studie hebben we de capaciteit van nanobuizen aangetoond om osteogene differentiatie van MSC's te bevorderen, en deze capaciteit werd versterkt met de toenemende binnendiameter van de nanobuizen (30-70 V). Dit zal helpen de diameter van de nanobuizen op het oppervlak van de implantaten te sturen.

Als een topografische structuur, veranderen nanobuizen eerst de fysieke eigenschappen van het materiaal, zoals adsorptiecapaciteit en elektrische en thermische geleiding. Deze fysieke eigenschappen bepalen hun toepassing in het industriële veld. Bijvoorbeeld, de meeste hoogspanningstransformatoren moeten worden gevuld met isolatiemateriaal, wat meestal transformatorolie of isolatiegas is. Wanneer de isolatie van een transformator faalt door oververhitting en gedeeltelijke ontlading, zal een ernstige ontladingsonvoorval plaatsvinden. Daarom is het vinden van een effectieve methode die de concentratie en typen opgeloste gassen of isolatiegasontbindingscomponenten in een transformator nauwkeurig detecteert, nodig om de werkingstoestand van de transformator te monitoren. De traditionele benadering is om te zoeken naar materialen met goede gasadsorptie in overgangselementen, die rijk zijn aan d-elektronen, zoals Pd(1 1 1). Tegenwoordig worden nanobuizen breed bestudeerd voor hun goede gasadsorptie-eigenschappen. He et al. vonden dat CuO-BNNT geschikt was voor de adsorptie van C₂H₂, vanwege de sterkere adsorptie op C₂H₂. Tegelijkertijd kan TiO₂ zelf een gas-sensormateriaal zijn. Gui et al. vonden dat Co-gedopeerd TiO₂ de gasadsorptiecapaciteit verder versterkte en een superieure adsorptiecapaciteit en geleidingsverandering vertoonde ten aanzien van C₂H₄ moleculen. Consistent met deze studie, vertoonde Mn-gedopeerd grafene ook verbeterde geleiding en superieure capaciteit van C₂H₂ en CO detectie dan pristijn grafene. Het bovenstaande onderzoek geeft aan dat de TiO₂-nanobuizen bereid in ons experiment een potentiële toepassing hebben in het veld van het monitoren van de werkingstoestand van een transformator. Echter, de adsorptiecapaciteit en elektrische geleiding van de nanobuizen naar gassen moeten verder bestudeerd worden, met name of deze eigenschappen verbeterd zijn na doping met overgangselementen (bijv. Mn).

Naast het veranderen van de fysieke eigenschappen van een oppervlak, beïnvloedt nanoschaal morfologie ook het biologische gedrag van de cellen die eraan gehecht zijn. Cellen hechten zich eerst aan het oppervlak van het materiaal en migreren, prolifereren en differentieren daarna. Vergeleken met een glad oppervlak, biedt de holle structuur van de nanobuizen minder hechtingplaatsen voor cellen. Daarom, om voor de cellen om stabiel aan het nanobuizenoppervlak te hechten en het biomechanische evenwicht binnen de cel te handhaven, begint het focale adhesiecomplex te assembleren en te rijpen, en wordt F-actine sterk en stabiel.

F-actine, een lineair polymer microfilament bestaande uit G-actine monomeren, is een van de drie hoofdcomponenten van het cytoskelet. Als een mechanische-belastingstructuur, wordt F-actine over het algemeen beschouwd als betrokken bij celdeling, celmigratie, endocytose en tumorcellenvasie, maar sommige recente studies toonden aan dat het ook celdifferentiatie kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld, actine cytoskeletale depolymerisatie door simvastatine induceert chondrocytendifferentiatie, en actine depolymerisatie versterkt adipogene differentiatie in humane stromale stamcellen. Onze resultaten onthulden ook dat, vergeleken met de controle groep, MSC's gekweekt op nanobuizen hogere F-actine niveaus hadden en een duidelijker vezelstructuur. Tegelijkertijd versterkte bevordering van F-actine polymerisatie door Jasp osteogene differentiatie, terwijl de depolymerisatie van F-actine osteogene differentiatie remde, wat suggereert dat F-actine TiO₂-nanobuizen-geïnduceerde osteoblastische differentiatie van MSC's medieert.

F-actine kan worden gereguleerd door Rho GTPasen, leden van de Ras-superfamilie, en Rho kan actine herorganiseren door ten minste twee effectoren, ROCK en Dia. ROCK geactiveerd door binding aan Rho-GTP en dan speelt myosine lichte ketting (MLC), het substraat van ROCK, een belangrijke rol in F-actine assemblage. ROCK remt de activiteit van MLC fosfatase, wat leidt tot een toename in MLC fosforylering, wat de ATPase activiteit van myosine II stimuleert en de assemblage van F-actine bevordert. Bovendien richt ROCK zich ook op LIM kinase (LIMK). Gefosforyleerde LIMK inactiveert cofiline door fosforylering, wat F-actine in de actieve toestand kan demonteren. Een andere effector is Dia, een lid van de formine-homologie (FH) familie van proteïnen die twee FH-domeinen bevat. Deze domeinen bevatten meerdere prolienrijke motieven die binden aan het G-actine-bindende proteïne, profiline. Deze interactie bijdraagt aan actine polymerisatie en F-actine organisatie. We detecteerden een van de Rho GTPasen, RhoA, en vonden dat de expressie van RhoA consistent was met het niveau van F-actine. Echter, we waren niet in staat om duidelijk te beschrijven hoe de nanobuizen de expressie van RhoA reguleren, omdat er veel andere regulatoren zijn, waaronder integrine signalering, andere hechtingreceptoren, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's), oplosbare factoren zoals LPA, receptor tyrosinekinase signalering, enz.

Wetende dat F-actine kan worden gereguleerd door RhoA, vroegen we ons vervolgens welke rol focale adhesie in dit proces speelde, omdat focale adhesiecomplexen, bevattende integrines, taline, vinculine, paxilline en focale adhesiekinase (FAK), gevormd en gerijpt worden wanneer cellen zich hechten aan het oppervlak van nanobuizen. Integrines zijn transmembraan heterodimeren die de ECM koppelen aan de andere focale adhesieproteïnen om celhechting te faciliteren. Ze fungeren niet alleen simpel als haken, maar brengen ook cruciale signalen over de aard van de omgeving naar de cel over, wat samen met andere signalen zoals EGFR, de cel aanmoedigt om beslissingen te nemen over zijn biologische gedragingen. Deze signalen worden verder overgedragen aan F-actine, wat direct verbonden is met de focale adhesiecomplexen. Aan de ene kant zorgt de nanoschaal morfologie voor assemblage en rijping van focale adhesiecomplexen. Aan de andere kant zullen kinasen zoals FAK en Src-kinase familieleden moleculen zoals CRK werven om de assemblage en rijping van focale adhesiecomplexen zelf te reguleren. Onze resultaten toonden aan dat de vorming en rijping van focale adhesiecomplexen beïnvloed werden door F-actine depolymerisatie, wat suggereert dat er een feedback was van focale adhesiecomplexen naar actine-assemblage in lijn met gepubliceerde rapporten.

Echter, het mag niet genegeerd worden dat deze proteïnen in focale adhesiecomplexen de functie van signaaltransductie hebben. Dat wil zeggen, nanobuizen kunnen direct genexpressie reguleren door signaalcascades, en F-actine kan alleen deelnemen aan of beïnvloed worden door dit proces. Bijvoorbeeld, het dubbele kinasecomplex van FAK en Src kan Rho GTPasen zoals RhoA reguleren. Dit toont aan dat nanobuizen RhoA kunnen reguleren via integrines en het FAK/Src-complex. Bovendien kan Src, een niet-receptor tyrosinekinase-eiwit, Ras (klein GTPase) activeren door FAK te fosforyleren aan tyrosine-residue 925. Vervolgens activeert Ras talloze biochemische routes, waaronder de goed bestudeerde MAPK-route en de PI3K/AKT/mTOR-route. In de MAPK-route activeert Ras c-Raf, gevolgd door mitogeen-geactiveerde proteïnekinase kinase (MAP2K) en dan MAPK1/2, ook bekend als extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK). ERK activeeert op zijn beurt transcriptiefactoren zoals serumresponsfactor (SRF) en c-Myc die betrokken zijn bij het reguleren van groei en differentiatie. Wat meer is, Runx2, een cruciale transcriptiefactor in osteogene differentiatie, kan ook worden gereguleerd door ERK, en onze eerdere studie bevestigde dat mechanische spanning osteogene differentiatie van BMSC's bevorderde via de FAK-Erk1/2-Runx2-route. Daarom kunnen we niet uitsluiten dat ERK een rol speelt in nanobuizen-geïnduceerde osteogene differentiatie en verder onderzoek is nog steeds nodig.

Wat is nu precies de rol van F-actine in het induceren van differentiatie van nanobuizen, omdat de verandering ervan celdifferentiatie kan beïnvloeden? Een mogelijkheid is dat de verandering van F-actine assemblage invers het niveau van FAK kan reguleren om osteogene differentiatie te induceren via de FAK-Erk1/2-Runx2-route zoals hierboven beschreven, omdat in onze resultaten, focale adhesiecomplexen en actine polymerisatie dezelfde veranderingstrends vertoonden, wat aangeeft dat ze als een geheel fungeren in reactie op de extracellulaire omgeving. Echter, enkele andere mogelijkheden bestaan ook, en een aantal artikelen hebben aangetoond dat MKL1 en YAP/TAZ downstream van de actine dynamische balans werken. Beiden shuttelen tussen het cytoplasma en de kern, en kunnen helpen signalen van het cytoskelet naar de kern over te dragen.

MKL1, ook wel myocardine-gerelateerde transcriptiefactor A genoemd, is gevoelig voor veranderingen in G-actine niveaus. Wanneer cytoplasmatische G-actine niveaus toenemen, bindt monomere G-actine aan MKL1 en voorkomt het binden aan SRF en het activeren van transcriptie. SRF-doelgenen omvatten actines zoals gladde spieractine (SMA) evenals andere actine-bindende proteïnen, waaronder immediat-vroeg-genen zoals c-fos en egr1. Recente studies hebben aangetoond dat het veranderen van SRF-activiteit adipogenese kan reguleren door de adipogenese-transcriptiefactor peroxisome proliferator-geactiveerde receptor γ (PPARγ) te activeren, en ook botvorming kan reguleren via IGF-1 en Runx2 signalering.

YAP en TAZ zijn twee transcriptionele co-activatoren in de Hippo-signaalroute, geïdentificeerd als een belangrijke regulatorische route die celproliferatie beperkt, waardoor orgaangrootte en morfogenese gecontroleerd worden. Grote tumorsuppressorgenen 1 en 2 (LATS1/2) fosforyleren ze, waardoor een bindingsplaats voor 14-3-3 proteïnen wordt gecreëerd, de binding waarvan hun kernimport voorkomt. Als gevolg worden gefosforyleerde vormen van YAP/TAZ in het cytoplasma gesequestreerd, wat de expressie van genen zoals Ctgf en Areg voorkomt. Bovendien hebben sommige studies aangetoond dat YAP/TAZ kan interageren met T-box 5 (TBX5), RUNX2 en p73 om genexpressie te reguleren. Verder is getoond dat celhechting aan celmatrixproteïnen YAP kernlokalisatie triggeren via een integrine/FAK/Src-as. In onze studie gaven de resultaten aan dat deze route mogelijk betrokken was bij nanobuizen-geïnduceerde differentiatie. Verder onderzoek naar de downstream mediatoren van de integrine/FAK/Src-as moet worden uitgevoerd om het specifieke mechanisme te verduidelijken.

Aan de andere kant illustreren steeds meer studies dat F-actine interageert met Hippo-signaling, en op een of andere manier de fosforylering van YAP remt, wat consistent is met onze experimentele resultaten dat bevordering van F-actine polymerisatie de expressie van gefosforyleerde YAP verlaagt. We hypotheseren dat ATP betrokken bij het transformatieproces tussen G-actine en F-actine ook een belangrijke rol kan spelen in de fosforylering van YAP, wat nog te bestuderen is.

Na het begrijpen van de bovenstaande mogelijke moleculaire mechanismen, kunnen we proberen sommige van de experimentele fenomenen gevonden in deze studie te verklaren. Onze resultaten onthulden dat hoe groter de diameter van de nanobuizen, des te sterker de capaciteit van de nanobuizen om osteogene differentiatie te bevorderen. Dit is consistent met eerdere onderzoeken. De reden voor dit fenomeen is dat hoe groter de diameter van de nanobuizen, des te minder hechtingplaatsen ze aan de cellen kunnen bieden, en des te groter de assemblage en rijping van focale adhesiecomplexen. Samen met deze, zullen stressvezels gemaakt van F-actine grotere kracht en stabiliteit hebben. Deze structuren versterken de signalering die osteogene differentiatie bevordert. Voorspelbaar is dit effect echter significant verminderd wanneer de nanobuizen te groot in diameter worden, wat het moeilijk maakt voor cellen om aan het oppervlak te hechten. Op dezelfde manier, wanneer de hoogte van de nanobuizen inconsistent is, kunnen de verschillen in hoogte resulteren in een verandering van hechtingplaats en herrangschikking van het cytoskelet, wat verder celdifferentiatie zal beïnvloeden. Intrigerend, zelfs gladde oppervlaktematerialen zonder nanobuismodificatie kunnen veranderingen in celdifferentiatie induceren. Een aantal studies hebben aangetoond dat focale adhesievorming en stressvezelorganisatie worden gereguleerd door substraatstijfheid, en YAP/TAZ speelt ook een belangrijke rol in dit proces. Daarom is het duidelijk dat de integrines-FAs (focale adhesies)-F-actine as een rol speelt in de transductie van fysieke signalen in intracellulaire chemische signalen.

Samenvattend, hebben onze resultaten aangetoond dat F-actine osteoblastische differentiatie van mesenchymale stamcellen op TiO₂-nanobuizen reguleert via MKL1 en YAP/TAZ, wiens doelgenen de proliferatie en differentiatie van MSC's deels verklaren. We weten dat er geen enkele verandering in het signaalnetwerk is en elke verandering wordt gereguleerd door talloze moleculen en proteïnen. Eén type biologisch gedrag moet het resultaat zijn van de regulatie van een reeks signaleringsroutes. Nanobuizen induceren celdifferentiatie door een complex netwerk van signalen te activeren, waaronder integrines, proteïnen in focale adhesiecomplexen, FAK, Src, Rho GTPase, de MAPK-route, de Hippo-route en andere gerapporteerde signaleringsroutes. Ten minste zo belangrijk, er zijn veel signaalcycli in het signaalnetwerk en een downstream signaal kan het upstream signaal via feedback reguleren. In deze studie vonden we dat vinculine en FAK achterwaarts kunnen worden gereguleerd door F-actine assemblage, wat de onzekerheid van moleculaire functie verhoogt. Daarom wachten meer details van het moleculaire mechanisme verder studie.

Conclusies

Onze resultaten toonden aan dat TiO₂-nanobuizen de osteogene differentiatie van MSC's bevorderden, en deze capaciteit werd versterkt met de toenemende diameter van nanobuizen binnen een bepaald bereik (30-70 V). F-actine medieerde nanobuis-geïnduceerde celdifferentiatie via MKL1 en YAP/TAZ, wat een nieuw inzicht biedt in de studie van celdifferentiatie.