Technisch gemonodisperse GFP-gedopeerde silica nanopartikelen voor efficiënte intracellulaire proteïnelevering en bio-imaging

Samenvatting

We rapporteren een gestroomlijnde, een-pot synthese die monodisperse groen fluorescerend proteïne (GFP)-gedopeerde silica nanopartikelen oplevert met diameters van 15 tot 35 nm. De methode gebruikt L-arginine-gekatalyseerde sol-gel chemie in een bifasisch cyclohexaan/water-systeem, wat GFP toelaat selectief in de kern, schil, of beide te incorporeren zonder de proteïnefluorescentie te compromitteren. Gedetailleerde karakterisering – TEM, DLS, zetapotentiaal, fluorescentiespectroscopie, en kwantumopbrengstanalyse – demonstreert dat GFP zijn fotofysische eigenschappen behoudt en een kwantumopbrengst van 0,62 bereikt versus 0,38 voor vrij GFP. Stabiliteitstudies tonen verwaarloosbare proteïnelekage, verbeterde thermische weerstand, en fotostabiliteit, terwijl protease-assays bescherming tegen enzymatische degradatie bevestigen. Cellulaire opname-assays in A549 longcarcinoomcellen onthullen efficiënte endocytische internalisatie en cytosolische levering van GFP, met minimale lysosomale quenching. Deze bevindingen vestigen GFP-gedopeerde silica nanopartikelen als robuuste, multifunctionele platforms voor intracellulaire proteïnelevering en hoge-resolutie bio-imaging.

Achtergrond

Incapsulatie van proteïnen binnen nanopartikelen is een hoeksteen van moderne biomedische technologie, wat biosensing, gecontroleerde afgifte, en weefselengineering mogelijk maakt. Het behoud van proteïneconformatie en -activiteit tijdens incapsulatie is essentieel, met name voor therapeutische antilichamen en enzymen. Silica nanopartikelen, gewaardeerd voor hun biokompatibiliteit en afstemmbare chemie, bieden een aantrekkelijke matrix voor proteïne-insluiting. Eerdere benaderingen – reverse emulsie, sol-gel, en mesoporeuze silica – vereisen vaak harde condities die gevoelige proteïnen kunnen denatureren of brede grootteverdelingen opleveren. Hier presenteren we een zachte, schaalbare protocol dat GFP-fluorescentie behoudt terwijl nauw verdeelde deeltjes geschikt voor intracellulaire levering produceert.

Methoden

Materialen

Alle reagentia werden gekocht van Sigma-Aldrich en gebruikt zonder verdere zuivering. Ultrazuiver water (18,2 MΩ) diende voor alle aqueuze stappen.

GFP Bereiding

GFP met een N-terminale His₆-tag werd geëxprimeerd in E. coli XL1-Blue met een pQE-vector, gezuiverd door Ni-affiniteit chromatografie, en buffer-uitgewisseld in 7,2 mM L-arginine (pH 10,3) of 10 mM NaHCO₃ (pH 9,2). Eindconcentratie was 1 mg mL⁻¹.

Nanopartikelsynthese

Kernpartikelen werden gevormd door hydrolyse van 5,5 mL TEOS in 69 mL water bevattende 91 mg L-arginine en 4,5 mL cyclohexaan bij 40 °C gedurende 20 uur. Opeenvolgende schilgroei omvatte 10 mL kerndispersie, 5 mL cyclohexaan, en 3,52 mL TEOS, opnieuw bij 40 °C gedurende 20 uur. GFP (200 µg) werd 30 min na TEOS-toevoeging toegevoegd om het proteïne in te sluiten tijdens nucleatie.

Zuivering

Nanopartikelen werden gedialyseerd (MWCO 10 kDa) tegen water gedurende 4 uur met tussentijdse uitwisselingen, en vervolgens steriel-gefilleerd (0,22 µm).

Karakterisering

Transmissie elektronenmicroscopie (JEM-2100F) kwantificeerde kerndiameters. Dynamische lichtverstrooiing (Malvern Zetasizer) leverde hydrodynamische diameters en zetapotentialen. Fluorescentiespectra (Fluoromax-3) werden opgenomen met 488 nm excitatie; kwantumopbrengsten werden berekend ten opzichte van rhodamine 6G en Atto488 met de Williamson-methode. Stabiliteit werd getoetst door thermische incubatie (20 °C vs 60 °C), fotobleaching onder groene LED-verlichting, en protease-K verteering. Analytische ultracentrifugatie (Beckman-Coulter XL-80 K) beoordeelde GFP-retentie. Cellulaire opname werd geëvalueerd in A549 cellen via confocale microscopie na 24 uur blootstelling aan 37 µg mL⁻¹ SiO₂ nanopartikelen (5 µg mL⁻¹ GFP) of vrij GFP.

Resultaten en Discussie

Deeltjesmorfologie en Grootte

Drie generaties deeltjes werden verkregen: kern (15,5 ± 1,1 nm), kern + schil 1 (23,5 ± 2,0 nm), kern + schil 1 + schil 2 (35,3 ± 2,0 nm). De grootteverdeling bleef <10% polydispersiteit, onafhankelijk van GFP-lading of bufferkeuze. Ongecodeerde controles vertoonden identieke diameters, wat bevestigt dat proteïneincorporatie de groei niet perturbeert.

Zetapotentiaal

Alle formuleringen vertoonden sterk negatieve zetapotentialen (−28 tot −36 mV), wat robuuste electrostatische stabiliteit aangeeft en dat GFP-inclusie het oppervlaktelading niet wijzigt.

Fluorescentie-eigenschappen

Emissiemaxima bleven consistent gecentreerd op 508 nm, overeenkomend met vrij GFP. Genormaliseerde fluorescentie-intensiteit nam proportioneel toe met het aantal GFP-gedopeerde schillen, wat volumetrische schaling weerspiegelt. GFP geïncorporeerd uit L-arginine-buffer leverde een 1,3-voudig hogere intensiteit op dan uit NaHCO₃, waarschijnlijk door hogere pH (10,3 vs 9,2). Kvantumopbrengstmetingen onthulden 0,62 voor GFP-gedopeerde deeltjes versus 0,38 voor vrij GFP, wat aantoont dat de silica-matrix de fotonische efficiëntie verbetert, mogelijk door proteïnebeweging te beperken en afscherming tegen quenchers te bieden.

Stabiliteit

• Proteïnelekage: Ultrafiltratie door 100 kDa membranen toonde geen detecteerbaar GFP in het filtraten.
• Thermische stabiliteit: Na 24 uur bij 60 °C behielden GFP-gedopeerde deeltjes 20% van de initiële fluorescentie, terwijl vrij GFP alle signaal verloor.
• Fotostabiliteit: Na 20 min LED-blootstelling behielden nanopartikelen 89% van fluorescentie, vergeleken met 81% voor vrij GFP.
• Protease-weerstand: Na 90 min met proteinase K behielden GFP-gedopeerde deeltjes 52% van fluorescentie, versus <7% voor vrij proteïne.

Cellulaire Opname

Confocale imaging van A549 cellen onthulde perikernaire fluorescentie na nanopartikelbehandeling, wat endocytische opname en cytosolische levering aangeeft. Geen intracellulair GFP-signaal werd waargenomen voor vrij proteïne, consistent met beperkte cellulaire internalisatie of snelle lysosomale degradatie.

Conclusies

We hebben een veelzijdige, lage-temperatuur synthese ontwikkeld die monodisperse GFP-gedopeerde silica nanopartikelen (15–35 nm) produceert met behouden fluorescentie, hoge kwantumopbrengst, en superieure stabiliteit. De mogelijkheid om proteïneplaatsing binnen kern- of schillagen te controleren, maakt het ontwerp van multifunctionele dragers mogelijk. Belangrijk is dat de silica-matrix de lading beschermt tegen thermische, fotonische, en enzymatische degradatie, en efficiënte intracellulaire levering vergemakkelijkt. Deze deeltjes vertegenwoordigen een veelbelovend platform voor gerichte proteïnetherapie en geavanceerd bio-imaging.