Geoptimaliseerde bereiding en fysicochemische karakterisering van dual-drug nanoliposomes encapsulerend erlotinib en doxorubiccine

Samenvatting

Synergistische combinatoire chemotherapie hangt af van het leveren van geneesmiddelen met distincte mechanismen in een gecoördineerde manier. We presenteren een reproduceerbaar, niet-PEGyleerd nanoliposom platform dat erlotinib (ERL) in de lipide dubbellaag en doxorubiccine (DOX) in de aqueuze kern co-encapsuleert. Lipiden (DSPC, cholesterol, POPG) werden geassembleerd door dunne-film hydratatie, gevolgd door zoond-sonicatie om sub-200 nm vesikels te bereiken. DOX werd geladen met ammonium-sulfaat (AS) of pH gradienten; de AS-gradient leverde >90% DOX encapsulatie-efficiëntie (EE) versus ~17% voor de pH methode. ERL EE bereikte 30%. Transmissie elektronenmicroscopie onthulde kristallijne DOX-sulfaat kernen en minder-geordende ERL kristallen in de dubbellaag. De vesikels bleven grootte-stabiel over 4–37 °C en lieten ERL snel vrij (<8 h) terwijl DOX langzaam vrijkwam, wat een tijds-differentieel, synergistisch profiel mogelijk maakt. Deze bevindingen vestigen een robuust dual-drug nanoliposom platform geschikt voor translationele studies.

Achtergrond

Triple-negatieve borstkankers en andere refractaire tumoren weerstand standaard monotherapies door verstrengelde DNA-schade en overlevingsroutes. Combinatieregimes die tumoren eerst PRIMEN met een groeifactorenremmer en ze daarna blootstellen aan een genotoxisch agens hebben preklinische synergie getoond. Om dergelijke in vitro effecten klinisch te vertalen, is een leveringsvoertuig dat beide agenten co-levert en hun vrijgave synchroniseert essentieel, vooral wanneer farmacokinetiek aanzienlijk verschillen.

Nanoliposomes—fosfolipide dubbellaag vesikels—encapsuleren van nature hydrofiele geneesmiddelen in hun kern en hydrofobe geneesmiddelen in hun membraan, wat co-lokalisatie en verhoogde tumoraccumuler bereikt via het enhanced permeability and retention (EPR) effect. Echter, betrouwbare, reproduceerbare fabricageprotocollen en uitgebreide fysicochemische data blijven schaars, wat klinische vertaling beperkt.

Methoden

Materialen

DSPC, POPG, cholesterol (Avanti Polar Lipids), DOX·HCl en ERL vrije base (Boryung Co. / Shanghai Send), ammoniumsulfaat, citroenzuur (Daejung), en reagentia (Sigma-Aldrich).

Bereiding van Dual-Drug Nanoliposomes

ERL werd geïntegreerd in een 27:20:3 (g/g/g) DSPC:cholesterol:POPG mengsel (3:50 g/g geneesmiddel) en gedroogd tot een dunne film. Hydratatie met 250–400 mM AS (of 300 mM citroenzuur, pH 3,9) bij 65 °C produceerde multilamellaire vesikels. Zond-sonicatie (5 s aan/2 s uit, 20% amplitude, 36 J/puls) in een ijs-waterbad verminderde de grootte tot ~140 nm. Overtollig AS werd verwijderd door overnachtdialyse tegen PBS (pH 7,4).

DOX (1,5 mg/mL, 2 mL) werd toegevoegd aan 8 mL van de ERL-geladen liposomes en geladen door ofwel een pH-gradient of een AS-gradient. Vier DOX-laadprotocollen (incubatie, sonicatie, evenwicht, dialyse) werden geëvalueerd om EE te optimaliseren.

Karakterisatie

Dynamische lichtverstrooiing meet grootte en polydispersiteit; TEM (JEM-2100F) visualiseerde morfologie en kristalstructuren. Encapsulatie-efficiëntie werd berekend uit geneesmiddel vrijgegeven door Triton X-100 en gekwantificeerd door UV-Vis (ERL) of fluorescentie (DOX). In vitro vrijgave gebruikte dialysecassettes in PBS (pH 7,4) bij 37 °C. Fysieke stabiliteit werd beoordeeld door grootte te monitoren bij 4, 25, en 37 °C over 21 dagen.

Resultaten en discussie

Groottecontrole door sonicatie

Onbehandelde ERL liposomes waren ~760 nm, krimpend tot ~222 nm binnen 10 min zoond-sonicatie; verdere sonicatie leverde verwaarloosbare grootteveranderingen op. Waterbad-sonicatie bereikte een vergelijkbare reductie sneller maar verhoogde verwarming, dus ijs-waterkoeling was bevorzugd. Na dialyse gemiddelden liposomes 140 nm.

DOX Laadefficiëntie

AS-gradient laden produceerde 90%+ EE, ver overtreffend de ~17% van pH-gradient. Een 350 mM AS concentratie maximaliseerde EE en minimaliseerde variabiliteit, waarschijnlijk door gunstige DOX-sulfaat kristallisatie. Onder de vier protocollen leverde de combinatie van 65 °C incubatie, 15 min zoond-sonicatie, en 30 min kamertemperatuur evenwicht (Groep 2) de hoogste EE (~98%) op. Langere sonicatie of uitgestelde evenwichtsverwezenlijking verlaagde EE, vermoedelijk door AS lekkage.

Morfologie en kristalliniteit

TEM beelden bevestigden sferische vesikels <200 nm. Hoog-resolutie TEM en SAED onthulden hoog geordende DOX-sulfaat kristallen in de kern en minder-geordende ERL kristallen aan de dubbellaag buitenoppervlak. Single-drug controles toonden vergelijkbare kristallijne patronen, wat de structurele integriteit van het dual-drug systeem valideert.

Fysieke stabiliteit

Diameter veranderingen waren <15% bij 4 °C, <10% bij 25 °C, en <6% bij 37 °C over 21 dagen, wat robuuste stabiliteit aangeeft. DSPC's hoge fasovergangstemperatuur en 40% cholesterol inhoud droegen waarschijnlijk bij aan deze veerkracht.

Tijds-differentiele vrijgave

In PBS, gaf ERL ~65% vrij tot 48 u, terwijl DOX ~30% vrijgaf. Het initiële 8 u venster toonde >4% h⁻¹ ERL vrijgave versus <1% h⁻¹ DOX, wat een sequentiële vrijgaveprofiel bevestigt dat gunstig is voor synergistische actie.

Conclusies

We vestigden een schaalbaar, niet-PEGyleerd nanoliposom platform dat ERL en DOX co-encapsuleert met hoge EE en gecontroleerde grootte. Zond-sonicatie na filmhydratatie optimaliseert vesikeldiameter reductie. AS-gradient laden, met name met 350 mM AS en een korte na-sonicatie evenwichtsverwezenlijking, levert de hoogste DOX EE op. TEM en SAED bevestigen distincte kristallijne rangschikkingen van elk geneesmiddel. De vesikels zijn fysiek stabiel en vertonen een tijds-differentiele vrijgave van ERL en DOX, wat ze positioneert als een veelbelovend voertuig voor synergistische kankertherapie.

Afkortingen

DOX

Doxorubiccine

DSPC

1,2-Distearoïl-sn-glycero-3-fosfocholine

EE

Encapsulatie-efficiëntie

EPR

Enhanced permeability and retention

ERL

Erlotinib

PK

Farmacokinetisch

POPG

1-Palmitoïl-2-oleoïl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (natriumzout)

SAED

Geselecteerd gebied elektronen diffractie

SEM

Standaardfout van het gemiddelde

Tc

Fasovergangstemperatuur

TEM

Transmissie elektronenmicroscopie