Chitosaan-gecapte, enzyme-responsieve holle mesoporeuze silicananopartikels voor gerichte darmstofafgifte

Samenvatting

Er is een enzyme-responsief, darmspecifiek afgiftesysteem ontwikkeld op basis van holle mesoporeuze silicasferen (HMSS) waaraan biologisch afbreekbare chitosaan (CS) is gekoppeld via splijtbare azobindingen (HMSS–N=N–CS). Doxorubicine (DOX) werd in een niet-kristallijne toestand geencapsuleerd in de holle kaviteit en mesoporen van HMSS met een hoge ladingsefficiëntie van 35,2%. In vitro-vrijgifte-experimenten bewijzen dat HMSS–N=N–CS/DOX enzyme-responsieve medicijnvrijgifte vertoont. De gegraftte CS verbetert de biocompatibiliteit en stabiliteit en verlaagt de eiwitaadsorptie op HMSS. Resultaten van maagdarmmucosa-irritatie en celcytotoxiciteit tonen de goede biocompatibiliteit van HMSS en HMSS–N=N–CS. Celopname-resultaten wijzen erop dat de opname van DOX duidelijk toeneemt nadat HMSS–N=N–CS/DOX vooraf geïncubeerd is met een darmenzymenmengsel. HMSS–N=N–CS/DOX geïncubeerd met darmenzymen vertoont verhoogde cytotoxiciteit, en de IC₅₀-waarde is drie keer lager dan die van de HMSS–N=N–CS/DOX-groep zonder darmenzymen. Dit werk legt de basis voor verder onderzoek naar mesoporeuze dragers voor orale darmspecifieke medicijnafgifte.

Inleiding

Recentelijk hebben stimuli-responsieve medicijnafgiftesystemen (DDS) veel aandacht getrokken voor de efficiënte lading en selectieve vrijgifte van geneesmiddelen in doelwitweefsels. Dergelijke systemen kunnen worden afgeleverd aan ziekteplaatsen en realiseren op aanvraag medicijnvrijgifte om therapeutische effecten te verbeteren en bijwerkingen door vroege lekkage te voorkomen. Alle interne en externe stimuli, zoals redoxpotentiaal, pH, enzymen, temperatuur en licht, worden gebruikt om stimuli-responsieve DDS te ontwerpen. Onder deze stimuli hebben enzymen, als interne stimuli, veel aandacht gekregen vanwege hun duidelijke concentratieverschillen in verschillende weefsels.

In de afgelopen twee decennia zijn mesoporeuze silicasferen (MSS) met mesoporen van 2–50 nm gevestigd als stimuli-responsieve medicijndragers, aangezien MSS over een bijzonder groot poriënvolume en hoge oppervlakte beschikken voor hoge ladingcapaciteit, een goed georganiseerde poriënstructuur, een gemakkelijk te functionaliseren oppervlak en goede biocompatibiliteit. Bovendien zijn holle mesoporeuze silicasferen (HMSS) nanodeeltjes met een mesoporeuze schilstructuur en een holle kaviteit superieur aan conventionele MSS, omdat de holle structuur efficiënt meer geneesmiddelen kan opslaan met een hogere opslagcapaciteit. Alle soorten stimuli-responsieve nanodragers op basis van MSS zijn ontwikkeld om medicijnmoleculen te huisvesten met behulp van diverse gatekeepers, zoals polymeren, anorganische nanodeeltjes, dendrimers, biomacromoleculen, macrocyclische verbindingen, peptiden en lipiden. Hoewel talloze DDS op basis van MSS met functionele capping vrijgifte kunnen realiseren in respons op diverse externe of interne stimuli, zijn er nog weinig van toepassing voor darmspecifieke gerichte medicijnafgifte.

Het is bekend dat orale medicijnafgifte de favoriete en eenvoudige manier is om geneesmiddelen toe te dienen. Darmspecifieke gerichte medicijnafgifte is zeer aantrekkelijk voor de behandeling van darmziektes, zoals de ziekte van Crohn, darmkanker en ulcerative colitis. Echter, darspecifieke medicijnafgifte kan verschillende problemen ondervinden, waaronder een lagere waterinhoud en relatief minder oppervlak voor orale absorptie dan op andere plaatsen in de maagdarmtractus (MDT). Verder moeten orale DDS te maken hebben met een sterk zuur milieu in de maag, wat de afbraak van geladen geneesmiddelen in de MDT kan versnellen, waardoor de capaciteit voor darmgerichte afgifte verloren gaat. Daarom zijn verschillende pH-afhankelijke DDS ontworpen om pH-getriggerde medicijnvrijgifte te realiseren bij de bijna neutrale pH-waarden (6–7) van de MDT, weerstand biedend tegen de sterk zuure omstandigheden in de maagregio. Omdat er slechts een klein zuurgraadverschil bestaat tussen de darm (pH 6,8) en de dikke darm (pH 7,4), hebben dergelijke pH-responsieve DDS moeite om darm-specifieke vrijgifte te realiseren.

Chitosaan (CS), een kationisch en biologisch afbreekbaar natuurlijk polysacharide, bestaat uit β-(1-4)-gelinkte glucosamine en N-acetyl-D-glucosamine eenheden. CS heeft veel aandacht in de biomedische sector gekregen vanwege de fascinerende eigenschappen, waaronder afbreekbaarheid, biocompatibiliteit, muco-adhesiviteit en antibacteriële activiteit. Vergeleken met polymeren, polyelektrolyten en supramoleculen die via ingewikkelde processen worden gesynthetiseerd, is CS relatief goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar door uitgeputte deacetylatie van chitine. Daarnaast is gerapporteerd dat CS de strakke verbindingen tussen cellen kan openen, wat de medicijnabsorptie verhoogt. Daarom is het polymer CS gekozen als capping-agent vanwege de goede biocompatibiliteit en geschikte grootte om de mesoporen van HMSS af te dekken en medicijnvrijgifte te blokkeren.

In ons werk is voor de eerste keer een darm-specifiek enzyme-responsief DDS gebaseerd op HMSS-materiaal (HMSS–N=N–CS) ontworpen, zoals weergegeven in Schema 1. In dit systeem werden de HMSS-dragers bereid via een selectieve etsstrategie. Het polymer CS werd via azobindingen aan het oppervlak van HMSS gehecht om als gatekeeper de openingen van HMSS te blokkeren. De azobindingen tussen HMSS en CS kunnen worden gespleten door enzymen in de darm, wat resulteert in de scheiding van CS van de openingen van HMSS. DOX werd gebruikt als modelgeneesmiddel om in de kaviteit van HMSS in te sluiten, en in vitro-vrijgifte-experimenten werden uitgevoerd om de enzyme-responsieve vrijgifte in aanwezigheid van darmenzymen te evalueren. Confocale laserscannemicrocopie (CLSM) en flowcytometrie (FCM) werden gebruikt om de celopname door Caco-2-cellen te onderzoeken. Tot slot werd de cytotoxiciteit van HMSS–N=N–CS/DOX tegenover Caco-2-cellen gemeten.

Materialen en methoden

Materialen

Tetraethoxysilaan (TEOS); N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC); chitosaan (DAC ≥ 95%); cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB); 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES); 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT); azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur; kaliumbromide (spectrale zuiverheid, ≥ 99,5%); N-hydroxysuccinimide (NHS) en DOX werden gekocht bij Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). Azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur werd geleverd door Inno-chem Technology Co. Ltd. (Peking, China). Celcultuurmedia DMEM, penicilline-streptomycine en foetaal kalverseerum (FBS) werden geleverd door GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, VS). Alle analytische reagenties werden niet verder gezuiverd voor gebruik.

Bereiding van HMSS–N=N–CS

Bereiding van HMSS–NH₂

De HMSS-nanodeeltjes werden bereid op basis van gepubliceerd werk met behulp van een selectieve etsmethode. Eerst werden vaste silicasferen gesynthetiseerd via een gewijzigde Stöber-methode. Kortom, 6 mL TEOS werd toegevoegd aan een mengsel van 10 mL gedemineraliseerd water, 74 mL ethanol en 3 mL geconcentreerd NH₃·H₂O. Vervolgens werd het mengsel 60 min geroerd om colloïdale silica-suspensies te verkrijgen bij kamertemperatuur. De vaste spheren werden gecentrifugeerd, gewassen en gedroogd voor verder gebruik. Vervolgens werd het mesoporeuze silicaschil op de vaste silicasferen aangebracht. Driehonderd milligram vast silica werd gedispergeerd in 50 mL gedemineraliseerd water door ultrasoonbehandeling gedurende 45 min. De silica-suspensies werden in een mengsel van 60 mL ethanol, 450 mg CTAB, 90 mL water en 1,7 mL NH₃·H₂O gegoten. Na 60 min roeren werd TEOS (0,75 mL) toegevoegd. Vervolgens werden de nanodeeltjes na 6 uur roeren gecentrifugeerd om monsters te verzamelen en vervolgens hergedispergeerd in 40 mL water. Ongeveer 1,2 g Na₂CO₃ werd met hevig roeren aan de watersuspensie toegevoegd. Na 12 uur bij 55 °C werden de HMSS-nanodeeltjes verzameld en gewassen met anhydre ethanol. De post-graftingmethode met een verhouding HMSS en APTES van 4:1 (m/v) werd gebruikt om HMSS–NH₂ te bereiden bij 80 °C onder N₂-omstandigheden gedurende 8 uur, waarna CTAB door reflux werd verwijderd.

Bereiding van HMSS–N=N–COOH

Azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur (50 mg) werd in pH 5,8 PBS opgelost. Vervolgens werden EDC (5 mg/mL) en NHS (3 mg/mL) toegevoegd om azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur te activeren bij 30 °C gedurende 1 uur. Daarna werd 10 mL PBS met 15 mg/mL HMSS–NH₂ toegevoegd en het mengsel 24 uur geroerd. Het resulterende HMSS–N=N–COOH werd door centrifugatie gescheiden en met ethanol gewassen.

Bereiding van HMSS–N=N–CS

0,15 g CS en 0,5 mL azijnzuur werden in 50 mL water opgelost om een CS-oplossing te bereiden. 100 mg HMSS–N=N–COOH werd gedispergeerd in 25 mL pH 5,0 PBS en geactiveerd door EDC en NHS gedurende 0,5 uur. Vervolgens werd 10 mL CS-oplossing in de suspensie gegoten met continu roeren gedurende 1 dag. Ten slotte werd het gesynthetiseerde HMSS–N=N–CS gecentrifugeerd en gewassen om de monsters te verzamelen.

Extractie van darmenzymenmengsel uit microflora

De darmmicroflora werd verzameld volgens een gepubliceerde methode. Vervolgens werd de cultuur geïnculeerd om het door darmmicroflora gesecreteerde enzymenmengsel te verkrijgen bij 37 °C. Het gesimuleerde darmmedium met enzymenmengsel werd gefiltreerd door een 0,22-µm filter om alle celrestanten uit de cultuurvloeistof te verwijderen. Vervolgens werd het filtraat vriesgedroogd om het enzymenmengsel in poedervorm te verkrijgen, wat in verder onderzoek werd gebruikt.

Medicijnladingsproces en enzyme-responsieve vrijgifte

Vijfentwintig milligram DOX werd opgelost in 5 mL pH 3,5 HCl-oplossing. 100 mg HMSS–N=N–CS werd toegevoegd aan de DOX-oplossing en 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werd 0,2 M NaOH-oplossing gebruikt om de pH van het mengsel op 7,0 te brengen, en de suspensie werd nog eens 12 uur geroerd. De DOX-geladen HMSS–N=N–CS (aangeduid als HMSS–N=N–CS/DOX) werd gecentrifugeerd en gewassen om het geadsorbeerde DOX op het oppervlak van HMSS–N=N–CS te verwijderen. Het supernatans werd bij elke stap verzameld om de DOX-ladingsefficiëntie (LE) te meten bij 480 nm met UV-Vis-spectrofotometrie. De totale massa DOX geladen in HMSS–N=N–CS werd berekend door de niet-geladen DOX na het ladingsproces af te trekken van de initiële massa DOX. HMSS/DOX werd als controle bereid met HMSS als initiële drager. De LE van DOX werd berekend volgens de vergelijking:

$$ \mathrm{LE}\ (\%)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

Waarbij m_A de toegevoegde massa DOX was, m_B de massa DOX in het supernatans, en m_C de totale massa HMSS–N=N–CS.

De in vitro enzyme-responsieve vrijgifte van DOX uit HMSS–N=N–CS/DOX werd als volgt geëvalueerd. Twee milligram HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS/DOX nanodeeltjes werden gedispergeerd in pH 7,4 PBS schuddend bij 125 rpm met verschillende concentraties darmenzymenmengsel (0 mg/mL, 0,3 mg/mL en 1 mg/mL). Op vaste tijdstippen werd 1 mL vrijgiftemedium genomen om de absorbantie te meten. De vrijgifte van DOX werd bij 480 nm gemeten. HMSS/DOX werd als controle gebruikt.

BSA-adsorptie

De BSA-adsorptiehoeveelheid werd geëvalueerd op basis van gepubliceerde werken. BSA werd in pH 7,4 PBS (0,5 mg/mL) toegevoegd. Vijf milligram HMSS, HMSS–NH₂ en HMSS–N=N–CS werden in 2,5 mL PBS (pH 7,4) toegevoegd. Een gelijk volume BSA-oplossing werd toegevoegd en de suspensie werd in een schuddende incubator bij 100 rpm geplaatst. Na 6 uur werd centrifugatie gebruikt om de bovenvloeistof te verzamelen. Ten slotte werd de BSA-concentratie gemeten bij 595 nm na kleuring met Coomassie briljant blauw oplossing.

Karakterisatie

De mesoporeuze netwerkstructuur en morfologie van de HMSS-nanodeeltjes werden geëvalueerd door TEM-beelden (EM–208S, CSIS, VS). De oppervlakte en poriêngrootteverdeling van nanodeeltjes werden gekarakteriseerd met een stikstofadsorptie-analyseapparaat (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). De ξ-potentialen en deeltjesgroottes werden gekarakteriseerd op een Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, VK). TGA-analyse werd gemeten op een TGA-50 apparaat (Shimadzu, Kyoto, Japan) met een verhittingsnelheid van 10 °C/min onder stroomstikstof. Fourier-transformatie-infraroodspectrofotometrische (FT-IR) spectra werden gemeten met een FT-IR-spectrometer (Bruker Tensor27, Zwitserland). Het bereik werd uitgevoerd van 400 tot 4000 cm⁻¹ met de KBr-tabletmethode. Poeder-XRD werd uitgevoerd op een Siemens D5005 X-ray diffractometer (Karlsruhe, Duitsland) met Cu-Kα straling (λ = 1,5418 Å).

Celcultuur en celopname-experiment

Caco-2-cellen werden gekweekt in een medium aangevuld met 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% (v/v) pyruvinezuurnatrium en 1% streptomycine. NIH-3T3-cellen werden gekweekt in DMEM met 1% streptomycine en 10% FBS. De opname van de nanodragers door Caco-2-cellen werd gekarakteriseerd met FCM en CLSM. Caco-2-cellen werden gezaaid in 24-putplaten. Na overnachten kweken werden vrij DOX, HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS–N=N–CS/DOX vooraf geïncubeerd met darmenzymen-nanodeeltjes (gelijk aan de concentratie van 5 µg/mL DOX) aan de corresponderende putten toegevoegd. Na voortgezette incubatie van 2 uur werd het celmedium verwijderd en grondig met PBS gewassen. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% formaldehyde en gekleurd met Hoechst 33258 voor CLSM-observatie. FCM werd gebruikt voor een kwantitatieve evaluatie van de celopname. Caco-2-cellen werden gezaaid in 6-putplaten en verder geïncubeerd gedurende 24 uur. Na wassen met PBS werden de Caco-2-cellen geïncubeerd met vrij DOX, HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS–N=N–CS/DOX vooraf geïncubeerd met darmenzymen-nanodeeltjes (gelijk aan de concentratie van 5 µg/mL DOX) in serumvrij DMEM gedurende 2 uur. Vervolgens werden de Caco-2-cellen gespoeld met koud PBS, getrypsiniseerd en heropgelost in 0,5 mL PBS. De DOX-fluorescentie in cellen werd gemeten met een FACS Canto flowcytometer (Becton, Dickinson, VS).

In vitro celproliferatie-assay

De cytotoxiciteit van lege HMSS en HMSS–N=N–CS dragers tegenover NIH-3T3 en Caco-2 cellen werd getoetst met een MTT-assay. Kortom, Caco-2-cellen en NIH-3T3-cellen werden apart gezaaid in 96-putplaten en verder geïncubeerd overnacht. Het oude celmedium werd vervangen door een serumvrij medium met verschillende concentraties nanodeeltjes. Na incubatie van 2 dagen werd 50 µL MTT-oplossing (2 mg mL^–1) toegevoegd en 4 uur geïncubeerd om de levende cellen te meten. Vervolgens werd de MTT-oplossing verwijderd en 150 µL DMSO toegevoegd om formazan op te lossen. Daarna werd de absorbantie gemeten op een microplaatlezer (Tecan, Männedorf, Zwitserland) bij 570 nm. De cytotoxiciteit van vrij DOX, HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS–N=N–CS/DOX vooraf geïncubeerd met enzymenmengsels geëxtraheerd uit darmmicroflora werd gemeten met Caco-2-cellen bij de overeenkomende DOX-concentraties van (0,1, 1, 5, 10 en 20 µg/mL). De incubatietijd was 48 uur, en de overige experimentprocessen waren hetzelfde als hierboven beschreven.

Toxiciteitsstudies

Maagdarmmucosa-irritatietesten zijn essentieel voor de evaluatie van de in vivo-bioveiligheid van orale medicijnafgifte. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (180 ± 10 g) werden willekeurig verdeeld in drie groepen (drie ratten per groep). Ratten werden geadministreerd met fysiologisch zout, HMSS en HMSS–N=N–CS nanodeeltjes met een dosis van 100 mg/kg per dag. Na 7 dagen werden alle ratten geofferd en de weefsels verzameld en onderzocht door histopathologisch onderzoek (H&E). Om de bioveiligheid van HMSS en HMSS–N=N–CS nanodeeltjes te evalueren, werden de lichaamsgewichten van BALB/c-muizen (18–20 g) vastgelegd na orale administratie met een dosis van 100 mg/kg om de twee dagen. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren van de Qiqihar Medische Universiteit en goedgekeurd door de Ethiekcommissie van de Qiqihar Medische Universiteit.

Statistiek

Statistische gegevens werden geanalyseerd met SPSS-software met behulp van een tweezijdige Student's t-toets. Foutbalken in deze studie zijn SD. Een p < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Bereiding en karakterisatie van HMSS–N=N–CS

HMSS werden bereid op basis van eerdere werken met kleine wijzigingen. Eerst werden vaste SiO₂-nanospheren bereid en een mesoporeus schil op het oppervlak van de vaste silicananospheren aangebracht met het CTAB-sjabloon. Vervolgens werd Na₂CO₃ gebruikt om de vaste SiO₂-nanoselectief te etsen, terwijl het mesoporeuze schil beschermd werd door sjabloon CTAB. De bereiding van HMSS–N=N–CS met CS als "gatekeeper" gekoppeld via een azoverbinding wordt beschreven in Fig. 1a. Eerst werden de oppervlakken van HMSS-nanodeeltjes gemodificeerd met APTES als alkylkoppelingsmiddel om amino-gefunctionaliseerde HMSS (HMSS–NH₂) te worden via een post-modificatiemethode. Vervolgens werd HMSS–N=N–COOH bereid door een amidatiereactie tussen de aminogroepen van HMSS–NH₂ en de carboxylgroepen van azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur. Daarna werd CS covalente gemodificeerd op het oppervlak van HMSS-nanodeeltjes door een amidatiereactie tussen de carboxylgroepen van HMSS–N=N–COOH en de aminogroepen in CS.

Zoals weergegeven in het transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-beeld in Fig. 1a, was de gemiddelde diameter van HMSS 280 nm, en de HMSS's hadden een uniforme holle structuur en een hoog geordende mesoporeuze schil. De gemiddelde dikte van het mesoporeuze schil was ongeveer 90 nm. In vergelijking met het gladde oppervlak van HMSS was het oppervlak van gegraft polymere HMSS–N=N–CS (Fig. 1b) ruw, wat aangeeft dat CS de HMSS-drager bedekte.

De oppervlaktes en poriënverdelingen van mesoporeuze materialen speelden een cruciale rol bij het laden en leveren van gastmoleculen voor gecontroleerde vrijgifte. Poriêngrootteverdelingscurven en isothermen werden gemeten door N₂-adsorptie- en desorptieanalyse (Fig. 2). Gedetailleerde parameters (de Brunauer-Emmett-Teller (BET)-oppervlakte (S_BET), totaal poriënvolume (V_P) en poriêngrootteverdeling (D_P)) zijn weergegeven in Tabel 1. De S_BET en V_P van zuivere HMSS waren respectievelijk 810,7 m²/g en 0,969 cm³/g, en de D_P was ongeveer 3,8 nm. De D_P van HMSS–NH₂ was bijna hetzelfde als die van HMSS na aminatie, wat aangeeft dat de mesoporen niet geblokkeerd waren na amino-functionalisaatie. De S_BET en V_P van HMSS–N=N–CS namen merkbaar af na modificatie door het azoverbindingsmolecuul en CS-coating, wat aangeeft dat CS het oppervlak van de HMSS had bedekt.

De succesvolle grafting van HMSS–N=N–CS werd geverifieerd door diverse methoden. De ξ-potentiaal van HMSS–NH₂ onderging een grote verandering na functionalisatie, varierend van −27,9 tot +31,4 mV, zoals getoond in Fig. 3a, wat toegeschreven werd aan de toevoeging van aminegroepen aan het oppervlak van HMSS. Na reactie van HMSS–NH₂ met azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur om HMSS–N=N–COOH te vormen, daalde de ξ-potentiaal verder tot −2,0 mV vanwege de carboxylgroepen op het oppervlak van de HMSS. Na verdere grafting van het CS-polymer op het oppervlak van de HMSS om HMSS–N=N–CS te vormen, keerde de ξ-potentiaal terug naar +32,4 mV. Het resultaat werd toegeschreven aan de amino-rijke, positief geladen CS-coating op het oppervlak van de HMSS. Thermogravimetrische analyse (TGA) curves van HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH en HMSS–N=N–CS soorten zijn weergegeven in Fig. 3b. In vergelijking met HMSS–N=N–COOH verloor HMSS–N=N–CS een additioneel gewicht van ongeveer 19%, wat te wijten was aan de verwijdering van CS-ketens. De grafting van azobindingen op het oppervlak van HMSS werd ook bevestigd door een kleurverandering tijdens de bereiding van HMSS–N=N–COOH, zoals getoond in het inset in Fig. 3b. Het reactant HMSS–NH₂ is wit, terwijl het product HMSS–N=N–COOH geelbruin was na reactie van azobenzeen-3,3′-dicarboxylzuur met de aminogroepen van HMSS. De hydrodynamische diameter (D_H) en polyverspreidingsindex (PDI) waarden van HMSS, HMSS–NH₂ en HMSS–N=N–CS werden in gedemineraliseerd water bepaald, zoals getoond in Fig. 3c. HMSS had een diameter van 309 nm en een PDI van 0,190. Na toevoeging van aminegroepen op de oppervlakken van HMSS om HMSS–NH₂ te vormen, steeg de D_H tot 324 nm. De diameter van HMSS–N=N–CS was 342 nm, groter dan die van HMSS–NH₂ door de gegrafte CS-ketens. De PDI van HMSS–N=N–CS (0,177) was kleiner dan die van HMSS–NH₂, wat erop wijst dat de gemiddelde deeltjesgroottes nog meer uniform geworden waren na grafting van CS. In vergelijking met de diameters verkregen uit TEM, waren de diameters van HMSS en HMSS–N=N–CS gemeten met DLS groter. De D_H van de nanodeeltjes werd gemeten in een wateromgeving met een hydratatielaag, terwijl de grootte van de nanodeeltjes verkregen uit TEM afkomstig was van gedroogde nanodeeltjes. FT-IR-spectra van HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS en CS zijn weergegeven in Fig. 4d. In vergelijking met de pieken voor HMSN–NH₂, werd een toename van de adsorptiepieken bij 2853 en 2925 cm⁻¹ toegeschreven aan de trilling van −CH₂ in de grafting van carboxyl-terminale azobindingen. Na toevoeging van CS aan het oppervlak van HMSS–N=N–COOH, waren er toenames van de adsorptiepieken bij 1660 cm⁻¹ en 3435 cm⁻¹, toegeschreven aan υ_(C=O) in de amideband en de trilling van N–H in de CS. Alle resultaten bewijzen de succesvolle bereiding van HMSS–N=N–CS.

Medicijntoestand en ladings-efficiëntie

DOX werd gekozen om het laad- en vrijgiftegedrag van HMSS–N=N–CS te onderzoeken. Toen de pH-waarde van de HMSS–N=N–CS-nanodeeltjessuspensie op pH 3,5 werd ingesteld, werd het CS-biopolymeer positief geladen (de pK_a van CS was 6,3) door de geprotonerde aminogroepen in de zuure omgeving. Het CS-polymeer werd positief geladen en zwol op, wat leidde tot de opening van de mesoporen van HMSS ten gevolge van de afstotende interactie tussen CS-ladingen. DOX kreeg zo toegang tot de mesoporen van HMSS–N=N–CS door diffusie. Echter, nadat het medicijn-geladen mengsel op 7,4 werd ingesteld, deprotoneren de CS-ketens en vouwen ze samen om vroege vrijgifte van DOX te hinderen.

De LE van HMSS–N=N–CS/DOX was 35,2%, wat veel hoger was dan die van andere DOX-geladen mesoporeuze siliceafgiftesystemen. De hoge LE van DOX in HMSS-nanodragers werd toegeschreven aan de holle kaviteit, grote oppervlakte en het mesoporeuze netwerk, die als medicijnreservoir kunnen dienen. De fysieke toestand van DOX in HMSS–N=N–CS/DOX werd geëvalueerd door poeder-X-ray diffractie (XRD). Zoals getoond in de XRD-profielen (Fig. 4), vertoonde rauwe DOX kenmerkende en intense kristallijne diffractiepieken. De fysieke mengsel (PM) van HMSS–N=N–CS en DOX toonde ook duidelijke kristallijne diffractiepieken. HMSS–N=N–CS/DOX vertoonde echter geen duidelijke kristallijne pieken, wat bewijst dat de fysieke toestand van DOX in HMSS–N=N–CS/DOX niet-kristallijn was door de beperkingen van de mesoporeuze structuur van HMSS.

In vitro enzyme-responsieve vrijgifte in gesimuleerde darmomgeving

Om de enzyme-responsieve vrijgifte van HMSS–N=N–CS te onderzoeken, werden HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS/DOX nanodeeltjes toegevoegd aan pH 7,4 PBS met verschillende concentraties darmenzymenmengsel. Zoals weergegeven in Fig. 5a, vertoonde HMSS–N=N–CS/DOX een trage vrijgifte van DOX in PBS bij pH 7,4, en het cumulatieve vrijgiftepercentage was slechts ongeveer 10% binnen 24 uur, wat een goede capping-capaciteit van de CS-polymeren en azobindingen aangeeft. Zoals verwacht, was in het geval van gedund enzym in PBS bij pH 7,4 de cumulatieve vrijgifte van DOX verbeterd tot meer dan 20% binnen dezelfde periode. Bovendien steeg de vrijgiftehoeveelheid van DOX dramatisch tot bijna 40% in aanwezigheid van geconcentreerd enzym. In vergelijking met de enzyme-responsieve vrijgifte uit HMSS–N=N–CS/DOX, had de vrijgifte van DOX uit HMSS/DOX vergelijkbare trends in aanwezigheid of afwezigheid van geconcentreerd enzym. Het relatief lage medicijnvrijgiftepercentage was te wijten aan de elektrostatische interactie tussen de negatief geladen HMSS en de positief geladen DOX. De bovenstaande resultaten bewijzen dat de vrijgifte van DOX uit HMSS–N=N–CS/DOX merkbaar versneld werd door enzymen geëxtraheerd uit microflora in darmregio's. Het enzyme-responsieve vrijgifte-mechanisme zou kunnen zijn dat de azobindingen in HMSS–N=N–CS worden afgebroken door het enzym, wat leidt tot loslating van CS van het oppervlak van HMSS en snelle vrijgifte uit HMSS. Azobindingen zijn gerapporteerd om gespleten te worden door enzymen gesecreteerd door darmmicroflora.

Daarnaast, om de enzyme-responsieve vrijgifte van HMSS–N=N–CS/DOX in de napotsende MDT-omgeving verder te evalueren, werden de HMSS–N=N–CS/DOX-nanoplatformen initieel gedispergeerd in SGF gedurende 2 uur en vervolgens verder gedispergeerd in SIF gedurende 6 uur, en ten slotte werden de dragers toegevoegd aan pH 7,4 PBS met 1 mg/mL geëxtraheerd enzym. Zoals getoond in Fig. 5b, was in gesimuleerd maagsap de vrijgifte van DOX relatief snel, en het cumulatieve bedrag bereikte 15% binnen 2 uur. De relatief snelle vrijgifte was te wijten aan de zwakkere interactie tussen HMSS–N=N–CS en DOX onder zuure condities dan onder neutrale condities. Vervolgens werd de vrijgifte van DOX vertraagd in SIF gedurende 2–8 uur. Echter, na incubatie van HMSS–N=N–CS/DOX met geëxtraheerde enzymen in pH 7,4 PBS, nam de vrijgifte van DOX merkbaar toe, en het cumulatieve vrijgiftebedrag bereikte meer dan 50% binnen 24 uur. De onvolledige DOX-vrijgifte uit HMSS–N=N–CS/DOX was te wijten aan de sterke interactie tussen de positief geladen DOX en negatief geladen HMSS.

Eiwitaadsorptie door en stabiliteit van HMSS–N=N–CS

Voor orale administratie zullen de oppervlakte-eigenschappen van nanodragers onvermijdelijk de medicijnvrijgiftegedragingen en bio-adsorptie beïnvloeden. Een assay voor eiwitaadsorptie op het oppervlak werd gebruikt om het effect van gegraafde CS op het oppervlak van HMSS te evalueren. Zoals weergegeven in Fig. 6a, had kaal HMSS-nanodragers een dramatische BSA-adsorptie van tot 16,5%, toegeschreven aan het grote oppervlak en de holle kaviteit van HMSS, sterke adsorptiecapaciteit en niet-specifieke interacties tussen silanolgroepen van HMSS en BSA. Daarnaast had HMSS–NH₂ ook een relatief hoge geadsorbeerde BSA-hoeveelheid van 10,2%. Echter, het percentage geadsorbeerd BSA op het oppervlak daalde merkbaar tot 2,5% na toevoeging van het polymer CS als bedekking, wat het effect op het in vivo-gedrag van HMSS–N=N–CS dramatisch verminderde. Om de stabiliteit van de HMSS–N=N–CS en HMSS-monsters verder te observeren, werd 20 mg HMSS–N=N–CS en HMSS toegevoegd aan pH 7,4 PBS en gedemineraliseerd water. Zoals weergegeven in Fig. 6b, hoewel HMSS–N=N–CS en HMSS relatief stabiel waren in water, flocculeerde HMSS snel in pH 7,4 PBS. In tegenstelling, was de dispersie van HMSS–N=N–CS duidelijk verbeterd na grafting van het polymer CS op de oppervlakken van HMSS. Daarnaast kunnen HMSS–N=N–CS-dragers meer dan 12 uur stabiel blijven zonder neerslag in pH 7,4 PBS. Deze resultaten bewijzen dat bedekking met het hydrofiel CS-polymer de dispersie kan verbeteren en de eiwitaadsorptie op het oppervlak van HMSS–N=N–CS kan verminderen.

Celopname

Caco-2-cellen, als humane epitheliale colorectale adenoomcellen, worden veel gebruikt als modelcellen in orale medicijnafgifte. Zoals getoond in Fig. 7a, vertoonden Caco-2-cellen geïncubeerd met vrij DOX een relatief sterk fluorescentiesignaal afkomstig van DOX, omdat positief geladen DOX de cel en vervolgens de kern kon binnendringen. In vergelijking met de vrij DOX-groep, vertoonde de HMSS–N=N–CS/DOX-groep een zwakkere fluorescentie-intensiteit door onvolledige medicijnvrijgifte uit HMSS–N=N–CS/DOX. Echter, nadat HMSS–N=N–CS/DOX 1 uur vooraf geïncubeerd was met het darmenzymenmengsel, vertoonde het een duidelijk verhoogd fluorescentiesignaal. Dit werd toegeschreven aan het splijten van de azobindingen door het enzymenmengsel, wat leidde tot verwijdering van CS van de oppervlakken van HMSS, wat de DOX-vrijgifte uit HMSS–N=N–CS/DOX aanzienlijk versnelde. Om de verschillen in celopname voor HMSS–N=N–CS/DOX en HMSS–N=N–CS/DOX geïncubeerd met geëxtraheerde enzymen kwantitatief te evalueren, werd FCM gebruikt. Zoals getoond in Fig. 7b, was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor de HMSS–N=N–CS/DOX-groep 124,7, wat zwakker was dan die van de vrij DOX-groep, met een p-waarde kleiner dan 0,001. Opvallend was dat na 1 uur vooraf incubatie van HMSS–N=N–CS/DOX met het darmenzymenmengsel, de MFI merkbaar steeg tot 357 en zelfs die van de vrij DOX-groep overschreed, ten gevolge van de versnelde medicijnvrijgifte uit HMSS–N=N–CS/DOX na het breken van azobindingen. Al deze resultaten gaven aan dat de azobindingen in HMSS–N=N–CS/DOX gespleten konden worden in aanwezigheid van darmenzymen, wat leidde tot het lossen van CS van het oppervlak van HMSS en de versnelde DOX-vrijgifte uit HMSS.

In vitro celfeconditeits-evaluatie

Om het enzyme-responsieve vrijgifte-effect van HMSS–N=N–CS/DOX in gesimuleerde darmcondities te bewijzen, werd een in vitro celfeconditeitsassay uitgevoerd met Caco-2-cellen. Het klassieke anticancergeneesmiddel DOX werd gebruikt in de celfeconditeitsassay. Voorafgaand aan deze assay werden verschillende concentraties lege HMSS en HMSS–N=N–CS gebruikt om de biocompatibiliteit van het nanoplatform tegenover Caco-2-cellen en normale NIH-3T3 (muizenembryofibroblasten) cellen bij verschillende concentraties van 10 tot 250 µg/mL te bepalen met een MTT-assay. Zoals weergegeven in Fig. 8a, b, vertoonden HMSS en HMSS–N=N–CS bij verschillende concentraties verwaarloosbare cytotoxiciteit na incubatie met Caco-2-cellen of NIH-3T3-cellen, en de levensvatbaarheid van Caco-2-cellen was 87,9% en 88,3% bij de hoge concentratie van 100 µg/mL, respectievelijk, wat voldoende hoog is voor klinische toepassingen door de hoge medicijnlading van HMSS. Daarnaast hadden NIH-3T3-cellen geïncubeerd met HMSS en HMSS–N=N–CS gedurende 48 uur een hoge cellevensvatbaarheid (boven 80%) bij de relatief hoge concentratie van 100 µg/mL. Deze resultaten gaven aan dat HMSS en HMSS–N=N–CS cytocompatibel zijn en gebruikt kunnen worden voor orale afgifte.

Het effect van de DOX-geladen nanodrager HMSS–N=N–CS/DOX op de levensvatbaarheid van Caco-2-cellen is weergegeven in Fig. 8c. Vrij DOX vertoonde sterke en concentratie-afhankelijke cytotoxiciteit tegenover 4T1-cellen, wat toegeschreven werd aan het feit dat positief geladen vrij DOX gemakkelijk door 4T1-celmembranen kon passeren. De IC₅₀-waarde voor de vrij DOX-groep werd bepaald op 10,18 µg/mL met behulp van SPSS Statistics-software. In vergelijking met vrij DOX, vertoonde HMSS–N=N–CS/DOX een hogere cellevensvatbaarheid bij dezelfde DOX-concentratie vanwege de onvolledige vrijgifte van DOX uit HMSS–N=N–CS geïnduceerd door de sterke elektrostatische interacties tussen negatief geladen HMSS-dragers en positief geladen DOX. De IC₅₀-waarde voor de HMSS–N=N–CS/DOX-groep was 32,22 µg/mL, wat veel hoger was dan die voor vrij DOX. Echter, HMSS–N=N–CS/DOX vooraf geïncubeerd met geconcentreerde darmenzymen vertoonde een duidelijke concentratie-afhankelijke cytotoxiciteit, en de IC₅₀-waarde werd berekend op 9,41 µg/mL, wat veel lager was dan die van HMSS–N=N–CS/DOX. Deze reden kan toegeschreven worden aan de darmenzymen die de azobindingen in HMSS–N=N–CS afbreken, wat leidt tot loslating van gegraafde CS van het oppervlak van HMSS, wat de snelle vrijgifte van DOX uit HMSS-dragers veroorzaakt.

Toxiciteitsstudies

De risico's van het gebruik van HMSS–N=N–CS zijn een vitaal factor om te overwegen vóór toekomstige klinische toepassingen. H&E-kleuring van maagdarmmucosa-irritatie is essentieel om de in vivo-bioveiligheid van het afgiftesysteem voor orale administratie te evalueren (Fig. 9a). In vergelijking met een fysiologisch-zoutgroep, vertoonden zowel de HMSS- als de HMSS–N=N–CS-groep geen duidelijke histopathologische veranderingen of hyperemie na orale administratie gedurende een week met een administratiedosis van 100 mg/kg. Er werd geen dood of ongebruiklijk gedrag van ratten waargenomen tijdens het experimentele proces. Een afname van het lichaamsgewicht wordt algemeen beschouwd als een belangrijke en eenvoudige index voor in vivo-systeemtoxiciteit. Zoals getoond in Fig. 9b, namen de lichaamsgewichten van muizen in de HMSS- en HMSS–N=N–CS-groepen iets toe en waren vergelijkbaar met die van de fysiologisch-zoutgroep. De bovenstaande resultaten gaven aan dat HMSS en HMSS–N=N–CS goede biocompatibiliteit vertoonden als medicijndragers voor orale administratie.

Conclusies

Samengevat, werd biologisch afbreekbare CS via azobindingen gehecht om de openingen van HMSS af te sluiten om enzyme-responsieve darm-specifieke medicijnafgifte te bereiken. DOX werd in de holle kaviteit en mesoporen van HMSS in een niet-kristallijne toestand geladen met een hoge ladings-efficiëntie van 35,2%. Stabiliteits- en BSA-adsorptieresultaten toonden aan dat de CS-poorten de biocompatibiliteit en stabiliteit van HMSS konden verbeteren. In vitro-vrijgifte-resultaten bewijzen dat HMSS–N=N–CS/DOX enzyme-responsieve medicijnvrijgifte vertoonde in aanwezigheid van darmenzymen. CLSM-opname- en FCM-resultaten gaven aan dat de celopname van DOX duidelijk toename nadat HMSS–N=N–CS/DOX geïncubeerd was met het darmenzymenmengsel. Celfeconditeitsresultaten gaven aan dat HMSS–N=N–CS/DOX geïncubeerd met darmenzymen verhoogde cytotoxiciteit vertoonde, en de IC₅₀-waarde duidelijk daalde van 32,22 µg/mL voor HMSS–N=N–CS/DOX tot 9,41 µg/mL na incubatie.