M1 van macrofagen afgeleid exosomaal microRNA-326 onderdrukt hepatocellulair carcinoomcelprogressie via mediërende NF-κB-signaleringsroute

Abstract

Accumulerend bewijs heeft aangetoond dat microRNA (miR) afgeleid van van M1 macrofaag afgeleide exosomen de progressie van hepatocellulair carcinoom (HCC) kan reguleren. Het effect van miR-326 afgeleid van M1-macrofaag-afgeleide exosomen op HCC is echter niet gerapporteerd. Daarom was het doel van de huidige studie om het mechanisme van exosomale miR-326 van M1-macrofagen te onderzoeken bij het reguleren van HCC-celprogressie. RT-qPCR detecteerde miR-326-expressie in HCC-cellijnen. miR-326-expressie in HCC werd veranderd door transfectie en het effect van miR-326 op CD206- en NF-KB-expressie, celproliferatie, kolonievorming, migratie, apoptose en invasie werd gedetecteerd. Vervolgens werden exosomen geïsoleerd uit M1-macrofagen. RT-qPCR identificeerde miR-326-expressie in van M1 macrofaag afgeleide exosomen. miR-326-expressie in van M1-macrofaag afgeleide exosomen werd veranderd door transfectie. M1-macrofaag-afgeleide exosomen werden samen gekweekt met HCC-cellen om hun effecten op de biologische voortgang van HCC-cellen te achterhalen. Ten slotte werden in vivo experimenten uitgevoerd om de in vitro resultaten te verifiëren. MiR-326 was verlaagd in HCC-cellen en verrijkt in van M1 macrofaag afgeleide exosomen. Het opwaarts reguleren van miR-326 zou de proliferatie van HCC-cellen, kolonievorming, migratie, invasie en CD206- en NF-KB-expressie remmen en apoptose bevorderen, en de groei van HCC-tumoren in vivo remmen , terwijl het neerwaarts reguleren van miR-326 tegengestelde effecten vertoonde. M1-macrofaag-afgeleide exosomen remden HCC-celproliferatie, kolonievorming, migratie, invasie en CD206- en NF-KB-expressie en verbeterde apoptose, terwijl overexpressie van miR-326 het effect van M1-macrofaag-afgeleide exosomen op HCC-cellen versterkte. Het is gebleken dat exosomaal miR-326 afkomstig van M1 macrofagen de proliferatie, migratie en invasie onderdrukt en apoptose van HCC bevordert door de NF-KB-expressie neerwaarts te reguleren.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd de vijfde meest voorkomende kanker en de meest voorkomende primaire leverkanker [1]. Uit de gegevens van het China National Cancer Registry blijkt dat het sterftecijfer van primaire leverkanker op de derde plaats staat, terwijl de incidentie de vierde is van veel voorkomende maligniteiten [2]. De belangrijkste risicofactoren voor HCC zijn chronische infectie met het hepatitis C-virus en het hepatitis B-virus, met aflatoxine besmette voedingsmiddelen, obesitas, roken, zwaar alcoholgebruik en type 2 diabetes [3]. Transarteriële chemo-embolisatie is een gevestigde behandeling voor HCC in een tussenstadium, wat de overleving verbetert bij de meerderheid van de HCC-patiënten in de tussenliggende of gevorderde stadia [4]. Momenteel hangt de diagnose van HCC grotendeels af van serumbiomarkers en beeldvormingstechnieken [5]. HCC-gerelateerde 5-jaarsoverleving is slechts ongeveer 60%, en de incidentie neemt de afgelopen jaren jaar na jaar toe [6]. Gezien het feit dat onderzoek naar een nauwkeurig therapeutisch doelwit een prioriteit is bij de behandeling van HCC.

Macrofagen zijn effectorcellen en belangrijke regulatoren van het immuunsysteem, oefenen enorme functies uit bij het hermodelleren en herstellen van weefsel en voeren in vivo orkestrale metabolische functies uit in bijna alle weefsels [7]. Het is onthuld dat M1-macrofagen tumorbevorderende effecten uitoefenen en de beweeglijkheid van HCC-cellen verbeteren [8]. Exosoom is een schijfvormig blaasje met een diameter van 40-150 nm [9]. Volgens Xu et al. hebben exosomale microRNA's (miRNA's) functies op proliferatie, invasiviteit, metastase en geneesmiddelresistentie van HCC via het moduleren van genexpressie in de doelcellen [10]. Een studie heeft aangetoond dat miR-326-bevattende exosomen een potentieel klinisch doelwit kunnen zijn bij multiple sclerose [11]. MiRNA's zouden kunnen werken als oncogenen of tumorremmers door een groot aantal door eiwit gecodeerde genenexpressie te moduleren door middel van mRNA-afbraak en translatieblokkering in een specifieke sequentie [12]. Een studie heeft besproken dat miR-326 de HCC-celgroei onderdrukt door de voortgang van de celcyclus te verstoren en apoptose te versterken, en bovendien de celinvasie onderdrukt door het epitheliale-mesenchymale overgangsfenotype te verminderen [13]. Een andere studie heeft gemeld dat miR-326 een potentieel therapeutisch doelwit zou kunnen zijn voor de behandeling van HCC-patiënten [14]. Daarom besprak deze huidige studie het mechanisme van exosomaal miR-326 dat de invasie en migratie van HCC-cellen reguleert.

Materialen en methoden

Ethische verklaring

Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren door internationale comités. Het protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care Use Committee van het derde ziekenhuis van Jilin University.

Inductie en identificatie van macrofagen

Menselijke monocytische cellijn THP-1 (Kunming Institute of Zoology, CAS, Kunming, China) werd gekweekt in RPMI 1640-medium (Gibco, CA, VS; Thermo Fisher Scientific, MA, VS) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum ( FBS). THP-1-cellen werden gereageerd met 150 ng / ml forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, VS) en gedurende 24 uur in RPMI-medium geïncubeerd om M0-macrofagen te verkrijgen. Vervolgens werd de celmorfologie voor en na inductie waargenomen door Wright-kleuring. THP-1-cellen en geïnduceerde macrofagen werden opnieuw gesuspendeerd in 5 L PBS, op het glasplaatje gedruppeld, gekleurd met Wright's kleurstofoplossing en gemengd met de bufferoplossing bij 1:2. Geverfd gedurende 10 minuten en gespoeld met stromend water, werden de cellen onder de microscoop bekeken. Bovendien werden M0-macrofaagmarkers (CD68 en CD206) gemeten door reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Vervolgens werden macrofagen in M1-macrofagen geïnduceerd door incubatie met 20 ng/mL Interferon (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, VS) en 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) gedurende 18 H. M1-macrofaagmarkers (IDO1 en IL-12 p35) werden onderzocht met RT-qPCR [15].

Extractie van exosomen

De exosomen werden geëxtraheerd met een exosomenscheidingskit (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Duitsland). Supernatant van macrofagen werd onder aseptische omstandigheden in een centrifugebuis van 15 ml verzameld en gefiltreerd door een filterfilm van 0,8 M. Celsupernatant in elke groep werd toegevoegd met XBP-buffer (1:1) en vervolgens gecentrifugeerd met exoEasy-membraanaffiniteitscentrifugatiekolom bij 500g . Cellen werden aangevuld met 10 ml XWP-buffer en gecentrifugeerd met 3000-5000g . De exoEasy-membraanaffiniteitscentrifugatiekolom werd uitgebroed met 400 L XE-elueringsbuffer en gecentrifugeerd bij 500g . De elutiebuffer werd overgebracht naar een exoEasy-membraanaffiniteitscentrifugatiekolom en gecentrifugeerd bij 500g . De elutiebuffer werd 24 uur bij 4 ° C bewaard en vervolgens voor identificatie gebruikt. De rest werd bewaard bij -80 °C.

TEM-observatie en analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)

De hierboven verkregen exosomen werden gedruppeld in het door koolstof gedragen membraan kopergaas en toegevoegd met 2% fosfowolfraamzuur. Het monster werd waargenomen onder een TEM en het optimale beeld werd verzameld en geanalyseerd.

De onzuiverheden en deeltjes in PBS werden verwijderd door een microporeus filter van 0,22 M. Volgens de deeltjesdichtheid van de exosomen werd het gefilterde PBS verdund tot de juiste concentratie en gedetecteerd met behulp van een Nanosight NS300 nanodeeltjesdetector (Malvern, Westborough, MA, VS).

Na identificatie werden van macrofaag afgeleide exosomen getransfecteerd met miR-326-remmer en miR-326-remmer-negatieve controle (NC), miR-326-nabootsing en miR-326-nabootsende NC geëxtraheerd door exosomenscheidingskit (Invitrogen).

RT-qPCR

Het totale RNA werd geëxtraheerd met Trizol Reagent (Thermo Fisher) en real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van de SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) en het ABI 7500 Real-Time PCR-systeem (Life Technologies, Grand Island, NY, VS. ). De primersequenties worden getoond in Tabel 1. De kwantitatieve analyse werd uitgevoerd met behulp van de methode van 2^−△△Ct .

Western Blot-analyse

Het totale eiwit van cellen en exosomen werd geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchoninezuur (BCA) -kit (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Aan het eiwit werd monsterbuffer toegevoegd en bij 95°C gekookt, en elk putje werd geladen met 30 µg. Het eiwit werd gescheiden met 10% polyacrylamidegelelektroforese (Boster Biological Technology) en geëlektroblot op een polyvinylideenfluoridemembraan, gevolgd door verzegeling in 5% runderserumalbumine (BSA). Het membraan werd uitgebroed met primair antilichaam tegen CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA, VS), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, VS) en met het secundaire antilichaam (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) gelabeld met mierikswortelperoxidase. De afbeeldingen zijn verkregen door Odyssey tweekleurig infrarood fluorescentiescanning-beeldvormingssysteem en de grijswaarden van banden werden gemeten met Quantity One-beeldanalysesoftware.

Celcultuur en screening

Normale levercellijn HL-7702 en menselijke HCC-cellijn BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 en QGY-7703 werden geselecteerd en gekweekt in Gibco RPMI Media 1640 met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 U/ml ) en streptomycine (100 mg/ml). MiR-326-expressie werd gedetecteerd door RT-qPCR en de geschikte cellijnen werden gescreend.

Etikettering van exosomen en opname van exosomen

De exosomen werden opnieuw gesuspendeerd met 250 L verdunningsmiddel C en voorzichtig getritureerd om schade aan het membraan van het exosoom te voorkomen. De PKH67-kleurstof (1 L, Sigma-Aldrich) werd toegevoegd aan 250 L verdunningsmiddel C om 500 L te bereiken en geïncubeerd. Aan de oplossing werd 500 L 1% BSA toegevoegd en gedurende 1 minuut bij 37 ° C geïncubeerd. De exosomen werden verkregen door centrifugatie bij 120.000g 4 ° C gedurende 2 uur. De exosomen gelabeld met PKH67 werden verkregen door centrifugatie bij 120.000g 4 ° C gedurende 2 uur. De exosomen werden opnieuw gesuspendeerd met 6 ml RPMI-1640-medium waarbij licht werd vermeden. Vervolgens werden de gelabelde exosomen gedurende 12 uur samen met HCC-cellen gekweekt. Daarna werd het kweekmedium verwijderd en gewassen met PBS gedurende 3 keer, 5 min/tijd, en de fluorescerend gelabelde exosomen die niet intern werden geabsorbeerd door HCC-cellen werden grondig afgewassen. De exosomen werden vastgemaakt met 4% paraformaldehyde en geverfd met 4′-6-diamidino-2-fenylindol. Na verzegeling werd de fluorescentieverdeling waargenomen door een confocale lasermicroscoop.

Celgroepering en behandeling

HepG2-cellen en SMMC-7721-cellen werden uitgezaaid in de plaat met 12 putjes bij 0,5-1 × 10⁶ cellen/put. Met 50-60% confluentie werden cellen getransfecteerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). HepG2-cellen werden verdeeld in miR-326-nabootsende groep (getransfecteerd met miR-326-nabootsing) en NC-nabootsende groep (getransfecteerd met miR-326-nabootsende NC). SMMC-7721-cellen werden toegewezen aan miR-326-remmergroep (getransfecteerd met miR-326-remmer) en NC-remmergroep (getransfecteerd met miR-326-remmer NC). miR-326-mimic, miR-326-remmer en hun NC's werden gemengd met Lipofectamine 2000 voor transfectie. HepG2-cellen en SMMC-7721-cellen zonder enige behandeling werden ingesteld als de blanco groep. miR-326-mimic, miR-326-remmer en hun NC werden bedacht en samengesteld door Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, China) (Tabel 1).

Co-cultuur van van M1 macrofaag afgeleide exosomen met HCC-cellen

De eiwitconcentratie van van M1 macrofaag afgeleide exosomensuspensie werd gedetecteerd met de BCA-methode en het volume van de overeenkomstige exosomensuspensie met 50 g eiwit werd berekend. HepG2-cellen en SMMC-7721-cellen werden uitgezaaid in een plaat met 12 putjes bij 1 × 10⁵ cellen/ml per putje. HepG2-cellen werden verdeeld in 4 groepen:controlegroep (HepG2-cellen niet samen gekweekt met exosomen), exosomen (Exo) groep (HepG2-cellen samen gekweekt met van M1 macrofagen afgeleide exosomen), Exo-miR-326-nabootsende groep (HepG2 cellen die samen zijn gekweekt met van M1 macrofaag afgeleide exosomen die zijn getransfecteerd met miR-326-nabootsing), Exo-NC-nabootsende groep (HepG2-cellen die samen zijn gekweekt met van M1-macrofaag afgeleide exosomen die zijn getransfecteerd met miR-326 nabootsen van NC). SMMC-7721-cellen werden ook ingedeeld in 4 groepen:blanco groep (SMMC-7721-cellen die niet samen met exosomen werden gekweekt), Exo-groep (SMMC-7721-cellen die samen werden gekweekt met van M1 macrofagen afgeleide exosomen), Exo-miR-326- remmergroep (SMMC-7721-cellen samen gekweekt met M1-macrofaag-afgeleide exosomen die getransfecteerd met miR-326-remmer), Exo-NC-remmergroep (SMMC-7721-cellen samen gekweekt met M1-macrofaag-afgeleide exosomen die getransfecteerd met miR- 326 remmer NC).

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay

De cellen werden losgemaakt met trypsine en uitgezaaid op een plaat met 96 putjes met een celdichtheid van 4 × 10⁴ cellen per putje. Het kweekmedium werd verlaten na respectievelijk 12, 24, 36, 48, 60 uur kweken. Geïncubeerd met 500 L 0,5 g/L MTT-oplossing, werden de cellen toegevoegd aan 200 μL dimethylsulfoxide-oplossing, getritureerd en uitgebroed. Optische dichtheidswaarden (OD, 490 nm) werden gemeten door een microplaatlezer.

Kolonievormingstest

Gekweekt gedurende 24 uur en losgemaakt met trypsine, werden de cellen gezaaid in een kleine schaal van 35 mm met 300 cellen per schaal. De oplossing werd elke 3 dagen vervangen. Na 10 dagen kweken werden de cellen gefixeerd met 40 g/L⁻¹ paraformaldehyde en geverfd met 1 g/L⁻¹ kristalviolette oplossing en gedroogd. Kolonienummer (meer dan 50 cellen) werd berekend onder een microscoop.

Transwell-assay

Cellen (1 × 10⁵ ) werden gesuspendeerd met 200 L blanco kweekmedia. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de Transwell-kamer (Corning Glass Works, Corning, NY, VS) (matrigel was nodig voor invasie-experiment, maar niet voor migratie-experiment). RPIM 1640 (10% FBS, 600 L) werd in de onderste kamer toegevoegd. De bovenste en onderste kamers werden gescheiden door een Transwell-membraan dat vooraf was gecoat met matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS). Gekweekt gedurende 24 uur, werd de kamer gefixeerd met 95% alcohol. Na kleuring met kristalvioletoplossing werden cellen waargenomen in vijf visuele velden onder de microscoop.

Flowcytometrie

Celcyclus:cellen werden losgemaakt door trypsine. Cellen (1 × 10⁶ ) werden gesuspendeerd met 0,5 ml PBS en getritureerd tot een enkele suspensie. Gemengd met 4,5 ml voorgekoelde 70% ethanol op ijs, werden de cellen gecentrifugeerd bij 3000g , gespoeld met 5 ml PBS en opnieuw gecentrifugeerd bij 3000g . Daarna werden de cellen gesuspendeerd met 1 ml PI/Triton X-100 kleuroplossing (20 g PI/0,1% Triton X-100) die 0,2 mg RnaseA bevatte. Celcyclus werd gedetecteerd door flowcytometrie.

Celapoptose:Getrypsiniseerde cellen (1 × 10⁶ ) werden gesuspendeerd met 1 ml PBS, getritureerd en gecentrifugeerd bij 3000g . Cellen werden op hun beurt gespoeld met incubatiebuffer (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂ ) en gecentrifugeerd bij 3000g . Vervolgens werden cellen geïncubeerd met 100 μL markeringsoplossing (FITC-Annexin V en PI werden toegevoegd aan de incubatiebuffer om 1 μg/ml te bereiken), gecentrifugeerd bij 3000g , eenmaal gewassen met incubatiebuffer en uitgebroed met fluorescerende (SA-FLOUS) oplossing. Celapoptose werd gedetecteerd door flowcytometrie. De golflengte van flowcytometrie was 488 nm en FITC-fluorescentie werd gedetecteerd door bandfilter bij 515 nm, terwijl PI met een golflengte groter dan 560 nm. De resultaten werden automatisch door de computer geanalyseerd.

Tumor xenograft bij naakte muizen

Veertig muizen (College of Animal Science, Jilin University, Jilin, China) van 4-6 w werden willekeurig verdeeld in 8 groepen, met 5 muizen in elke groep. De muizen werden gedurende 1 w gevoerd in een specifiek pathogeenvrij dierlaboratorium en het voer, het kussen en de waterfles werden op tijd vervangen. De gezondheidsstatus van muizen moet elke dag worden geobserveerd. Een week later werden HCC-cellen in celsuspensie bereid en subcutaan in de nek en terug geïnjecteerd in een celsuspensie van 0,1 ml (1 × 10⁶ ). De groei van de tumor werd waargenomen na 3-5 dagen. De naakte muizen werden elke 4 dagen gewogen en het tumorvolume werd gemeten. De naakte muizen werden 20 dagen na injectie geëuthanaseerd.

Statistische analyse

Alle gegevens werden geïnterpreteerd door SPSS 17.0-software (SPSS Statistics, Chicago, IL, VS). Meetgegevens werden aangegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden gemaakt door de t -test, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). P waarde < 0,05 was indicatief voor een statistisch significant verschil.

Resultaten

Identificatie van M1-macrofaag en exosomen

Wright's kleuring werd gebruikt om de morfologie van door PMA geïnduceerde THP-1-cellen te observeren. Er werd voorgesteld dat het volume van THP-1-cellen vóór inductie klein was en dat het aandeel caryoplasma hoger was; de morfologie van cellen na inductie was onregelmatig, het volume werd groter en het aandeel caryoplasma nam af; het cytoplasma was rijker en presteerde lichtblauw, met overvloedige deeltjes en een paar vacuolen; de kern was paarsrood en vaak schuin naar één kant, wat aantoont dat de cellen de typische morfologische kenmerken van macrofagen hadden (Fig. 1a).

Identificatie van M1-macrofaag en exosomen. een Wright's kleuring voor het observeren van de morfologie van THP-1-cellen voor en na PMA-behandeling. b CD68- en CD206-expressie in THP-1-cellen en met PMA behandelde THP-1-cellen gedetecteerd door RT-qPCR; c morfologie van macrofagen en M1-macrofagen. d Expressie van IDO1 en IL-12 p35 in M0-macrofagen en met LPS en INF-γ behandelde M0-macrofagen gedetecteerd door RT-qPCR. e TEM voor observatie van exosomen. v Detectie van deeltjesgrootteverdeling van exosomen door NTA. g Eiwitbanden van CD63 en CD181. In paneel b, *P < 0,05 versus THP-1-cellen; In paneel d, *P < 0,05 versus M0-macrofagen. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (N = 3), werden vergelijkingen tussen twee groepen uitgevoerd door t-test

Om de succesvolle inductie van macrofagen verder te verifiëren, werd CD68- en CD206-expressie voor en na inductie getest met RT-qPCR. Het bleek dat CD68- en CD206-expressie verhoogd waren sinds PMA-inductie, wat aangeeft dat de PMA met succes THP-1-cellen in M0-macrofagen induceerde (Fig. 1b). Vervolgens werden M0-macrofagen gepolariseerd tot M1-macrofagen door inductie van LPS en INF-γ. De morfologie en M1-type macrofaagoppervlaktemarker IDO1 en IL-12 p35-expressie van macrofagen werden waargenomen en getest. M0-macrofagen vertoonden verschillende en onregelmatige hechtende morfologieën, met ronde, elliptische of spilvorm. De morfologie van macrofagen gestimuleerd door IFN-γ aangetoond met meer pseudopoden en uitsteeksels en fusiformis (figuur 1c). RT-qPCR schetste (Fig. 1d) dat na LPS- en INF-γ-behandeling M1-macrofagen een toename van hun markers vertoonden (IDO1 en IL-12p35).

Vervolgens werden de exosomen afgeleid van macrofagen waargenomen door de TEM. Er werd onthuld dat de exosomen afgeleid van macrofagen rijk waren en dat de vorm rond of ovaal was, met een vliezige structuur, uniforme grootte en minder verontreinigende stoffen (figuur 1e). NTA liet zien dat exosomen met een gecentraliseerde piek van de MODE-curve en vloeiende lineaire een meer geconcentreerde diameter en minder onzuiverheden hadden (figuur 1f). Western-blot-analyse rapporteerde dat versus macrofagen de expressie van het specifieke markereiwit CD63 en CD181 werd verhoogd in exosomen afgeleid van macrofagen (Fig. 1g). Deze resultaten geven aan dat we monocyten met succes hebben geïnduceerd om te differentiëren tot macrofagen en ze hebben gepolariseerd tot M1-macrofagen.

M1 macrofaag-afgeleide exosomen leveren miR-326 aan HCC-cellen en beïnvloeden miR-326-expressie in HCC-cellen

Om te verifiëren of exosomen afgeleid van M1-macrofagen miR-326 naar HCC-cellen transporteerden, werden HepG2- en SMMC-7721-cellen samen met exosomen gekweekt. Er kon worden herkend dat een groot aantal exosomen werd geassimileerd door HepG2- en SMMC-7721-cellen na 4 uur durende transfectie onder de fluorescentiemicroscoop (Fig. 2a, b).

M1-macrofaag-afgeleide exosomen leveren miR-326 aan HCC-cellen en beïnvloeden miR-326-expressie in HCC-cellen. een Opname van M1-macrofagen afgeleide exosomen door HepG2-cellen. b Opname van van M1 macrofagen afgeleide exosomen door SMMC-7721-cellen. c Vergelijking van miR-326-expressie van macrofaag-exosomen in elke groep voor en na INF-γ- en LPS-inductie. d miR-326-expressie in HCC-cellijnen (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) en menselijke normale hepatocyten HL-7702-cellijn gedetecteerd door RT-qPCR. e RT-qPCR detecteerde het effect van miR-326-nabootsing op miR-326-expressie in HepG2-cellen. v RT-qPCR detecteerde het effect van miR-326-remmer op miR-326-expressie in SMMC-7721-cellen. g RT-qPCR detecteerde de effecten van miR-326 mimic-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op miR-326-expressie in HepG2-cellen. u RT-qPCR detecteerde de effecten van miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op miR-326-expressie in SMMC-7721-cellen. In paneel c, *P <0,05 versus de M0-macrofaag; In paneel d, *P <0,05 versus HL-7702-cellen; In paneel e, *P <0,05 versus de NC-nabootsende groep; In paneel f, *P <0,05 versus de NC-remmergroep; In paneel g, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-nabootsende groep; In paneel h, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-remmergroep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (N = 3), werden vergelijkingen tussen meerdere groepen uitgevoerd door eenrichtingsanalyse van variantie

Vervolgens werd miR-326-mimic / remmer getransfecteerd in macrofagen en gecontroleerde miR-326-expressie in hun exosomen voor en na transfectie. Er werd aangetoond dat in tegenstelling tot de exosomen van M0-macrofagen, miR-326-expressie werd verhoogd in van M1-macrofagen afgeleide exosomen. Verhoogde miR-326-expressie werd gezien in de van M1-macrofagen afgeleide exosomen met miR-326-nabootsende behandeling. MiR-326-expressie verminderd in van M1-macrofagen afgeleide exosomen met miR-326-remmerbehandeling (Fig. 2c).

Vervolgens werd miR-326-expressie in HCC-cellijnen getest. Zoals gemanifesteerd, was miR-326-expressie verlaagd in BEL-7404-, HepG2-, SMMC-7721- en QGY-7703-cellen in vergelijking met HL-7702-cellen, waaronder HepG2-cellen met de laagste expressie, terwijl SMMC-7721-cellen met de hoogste expressie (Fig. 2d).

Daarna werden miR-326-mimic en miR-326-remmer getransfecteerd in respectievelijk HepG2- en SSMC-7721-cellen en onderzochten ze hun effecten op miR-326-expressie. MiR-326 bootst verhoogde miR-326-expressie in HepG2-cellen na, terwijl miR-326-remmer miR-326-expressie in SSMC-7721-cellen verminderde (Fig. 2e, f).

Vervolgens werden de exosomen van M1-macrofagen getransfecteerd met miR-326-mimic en miR-326-remmer samen gekweekt met respectievelijk HepG2- en SSMC-7721-cellen. Er werd benadrukt dat co-cultuur met exosomen de miR-326-expressie in HCC-cellen verhoogde, miR-326-nabootsende getransfecteerde M1-macrofagen-afgeleide exosomen de miR-326-expressie in HepG2-cellen verder verhoogden, terwijl miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofagen -afgeleide exosomen degradeerden miR-326-expressie in SSMC-7721-cellen (Fig. 2g, h). Er wordt gesuggereerd dat M1-macrofaag-afgeleide exosomen miR-326 afleveren aan HCC-cellen en de miR-326-expressie in HCC-cellen beïnvloeden.

M1 van macrofagen afgeleide exosomale miR-326 vermindert celproliferatie en kolonievorming in HCC-cellen

Bij het onderzoeken van het effect van exosomaal miR-326 op de proliferatie van HCC-cellen, werden MTT- en kolonievormingstesten uitgevoerd om de proliferatie van HCC-cellen te onderzoeken. Er werd gesuggereerd dat in HepG2-cellen miR-326-restauratie de celproliferatie en het vermogen tot kolonievorming verslechterde (Fig. 3a, e, f). M1-macrofagen-afgeleide exosomen blokkeerden HepG2-cellen om te prolifereren en kolonies te vormen. MiR-326 mimic-getransfecteerde M1-macrofagen-afgeleide exosomen verder verminderde celproliferatie en kolonievormingsvermogen (Fig. 3c, i, j).

M1-macrofaag exosomaal miR-326 remt celproliferatie en kolonievorming in HCC-cellen. een MTT-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326-nabootsing op de proliferatie van HepG2-cellen. b MTT-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326-remmer op de proliferatie van SMMC-7721-cellen. c MTT-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-nabootsende getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de proliferatie van HepG2-cellen. d MTT-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de proliferatie van SMMC-7721-cellen. e Kolonievormingstest detecteerde het effect van transfectie van miR-326-nabootsing op het kolonievormingsvermogen van HepG2-cellen. v Kolonieaantallen HepG2-cellen. g Kolonievormingstest detecteerde het effect van transfectie van miR-326-remmer op het kolonievormingsvermogen van SMMC-7721-cellen. u Kolonienummers van SMMC-7721-cellen. ik Kolonievormingstest detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-nabootsende getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op het kolonievormingsvermogen van HepG2-cellen. j Kolonieaantallen HepG2-cellen behandeld met exosomen. k Kolonievormingstest detecteerde het effect van co-cultuur van miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op het kolonievormingsvermogen van SMMC-7721-cellen. ik Kolonieaantallen van SMMC-7721-cellen behandeld met exosomen. In paneel a en f, *P <0,05 versus de NC-nabootsende groep; In paneel b en h, *P <0,05 versus de NC-remmergroep; In paneel c en j, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-nabootsende groep; In paneel d en l, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-remmergroep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (N = 3), werden vergelijkingen tussen meerdere groepen uitgevoerd door eenrichtingsanalyse van variantie

In SMMC-7721-cellen verbeterde miR-326 knockdown de celproliferatie en het vermogen tot kolonievorming (Fig. 3b, g, h). In SMMC-7721-cellen die werden behandeld met van M1-macrofagen afgeleide exosomen, was de celproliferatie en het vermogen tot kolonievorming verminderd. MiR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofagen-afgeleide exosomen stimuleerden verder celproliferatie en kolonievormingsvermogen (Fig. 3d, k, l). Er wordt gesuggereerd dat miR-326 afgeleid van M1-macrofaag-afgeleide exosomen de proliferatie van HCC-cellen belemmert.

M1 van macrofagen afgeleide exosomale miR-326 onderdrukt migratie en invasie van HCC-cellen

Vervolgens werd het effect van exosomaal miR-326 op de invasie en migratie van HCC-cellen onderzocht. Er werd aangetoond dat in HepG2-cellen herstel van miR-326 invasie en migratie beperkte (Fig. 4a-c). M1-macrofagen-afgeleide exosomen verstoorden HepG2-cellen om binnen te vallen en te migreren. Invasie en migratie gingen verder achteruit toen HepG2-cellen samen werden gekweekt met miR-326-nabootsende getransfecteerde M1-macrofagen afgeleide exosomen (Fig. 4g-i).

M1-macrofaag exosomaal miR-326 remt migratie en invasie van HCC-cellen. een Transwell-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326-nabootsing op de invasie van HepG2-cellen. b Transwell-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326 en bootst de migratie van HepG2-cellen na. c Het aantal invasies en migraties van HepG2-cellen. d Transwell-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326-remmer op de invasie van SMMC-7721-cellen. e Transwell-assay detecteerde het effect van transfectie van miR-326-remmer op de migratie van SMMC-7721-cellen. v Het aantal invasies en migraties van SMMC-7721-cellen. g Transwell-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326 mimic-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de invasie van HepG2-cellen. u Transwell-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-nabootsende getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de migratie van HepG2-cellen. ik Het aantal invasies en migraties van HepG2-cellen die samen zijn gekweekt met van M1 macrofaag afgeleide exosomen. j Transwell-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de invasie van SMMC-7721-cellen. k Transwell-assay detecteerde het effect van co-cultuur met miR-326-remmer-getransfecteerde M1-macrofaag-afgeleide exosomen op de migratie van SMMC-7721-cellen. ik Het aantal invasies en migraties van SMMC-7721-cellen die samen zijn gekweekt met van M1 macrofaag afgeleide exosomen. In paneel c, *P <0,05 versus de NC-nabootsende groep; In paneel f, *P <0,05 versus de NC-remmergroep; In paneel i, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-nabootsende groep; In paneel l, *P <0,05 versus de controlegroep, #P <0,05 versus de Exo-NC-remmergroep. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (N = 3), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance

MiR-326 knockdown resulted in enhancements in SMMC-7721 cell invasion and migration (Fig. 4d–f). When treated with M1 macrophages-derived exosomes, SMMC-7721 cells were exhibited with decreased invasion and migration. However, SMMC-7721 cell invasion and migration were boosted upon co-culture with miR-326-inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes (Fig. 4j–l). It is implied that miR-326 derived from M1 macrophage exosomes impedes the invasion and migration of HCC cells.

M1 Macrophage-Derived Exosomal miR-326 Promotes Apoptosis of HCC Cells

When examining the effect of exosomal miR-326 on the cell cycle and apoptosis of HCC cells, PI single staining and Annexin V-FITC/PI double staining were applied. It was illustrated that miR-326 overexpression increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases and raised apoptosis in HepG2 cells (Fig. 5a–d). Co-culturing with M1 macrophages-derived exosomes increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases and raised cell apoptosis of HepG2 cells. Co-cultivation with exosomes from M1 macrophages transfected with miR-326-mimic further enhanced these effects (Fig. 5i–l).

M1 macrophage exosomal miR-326 promotes apoptosis of HCC cells. een , b Flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 mimic on HepG2 cell cycle; c , d flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 mimic on HepG2 cell apoptosis; e , v flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on SMMC-7721 cell cycle; g , u flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on SMMC-7721 cell apoptosis; i , j flow cytometry detected the effects of co-culture of with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on HepG2 cell cycle; k , ik flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on HepG2 cell apoptosis; m , n flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on SMMC-7721 cell cycle; o , p , flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on SMMC-7721 cell apoptosis. In panel b and d, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel f and h, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel j and l, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel n and p, *P <0.05 versus the controlgroup, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (N = 3), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance

In SMMC-7721 cells, miR-326 down-regulation reduced cells arrested at G0/G1 phase, elevated cells arrested at S and G2/M phases, and declined cell apoptosis (Fig. 5e–h). Untransfected M1 macrophages-derived exosomes increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases, and heightened cell apoptosis. MiR-326-inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes degraded cells arrested at G0/G1 phase, elevated cells arrested at S and G2/M phases, and decreased cell apoptosis (Fig. 5m–p). Briefly, it is summarized that miR-326 derived from M1 macrophage exosomes arrests cell cycle in G0/G1 phase and induces cell apoptosis in HCC.

M1 Macrophage-Derived Exosomal miR-326 Declines CD206 and NF-κB Expression in HCC Cells

Next, the potential mechanism of miR-326 derived from M1 macrophage exosomes in the biological progress of HCC cells was explored. NF-κB is the key link between inflammation and cancer. Many regulatory proteins and miRNAs could inhibit the excessively activated NF-κB signaling to suppress cancer [16]. Such a beneficial effect may include the polarization of M2 macrophages into M1 macrophages. CD206 and NF-κB expression in HepG2 and SMMC-7721 cells was tested by RT-qPCR. It was suggested that miR-326 restoration decreased CD206 and NF-κB expression in HepG2 cells, while miR-326 knockdown enhanced CD206 and NF-κB expression in SMMC-7721 cells (Fig. 6a, b). Moreover, co-culture with M1 macrophage exosomes significantly reduced CD206 and NF-κB expression in HepG2 cells, while co-culture with M1 macrophage exosomes-overexpressing miR-326 further decreased CD206 and NF-κB expression. Treated with untransfected M1 macrophages-derived exosomes, CD206 and NF-κB expression was decreased in SMMC-7721 cells. Co-cultured with miR-326-inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes, SMMC-7721 cells were featured by heightened CD206 and NF-κB expression (Fig. 6c, d). It was concluded that miR-326 from M1 macrophage exosomes played a tumor suppressor by inhibiting NF-κB in HCC cells.

M1 macrophage exosomal miR-326 declines CD206 and NF-κB expression in HCC cells. een RT-qPCR detected the effect of transfection of miR-326 mimic on the expression of CD206 and NF-κB in HepG2 cells; b RT-qPCR detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on the expression of CD206 and NF-κB in SMMC-7721 cells. c RT-qPCR detected the effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the expression of CD206 and NF-κB in HepG2 cells; d RT-qPCR detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the expression of CD206 and NF-κB in SMMC-7721 cells. In panel a, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel b, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel c, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel d, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (N = 3), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance

miR-326 from M1 Macrophage Exosomes Inhibits HCC Tumor Growth In Vivo

Finally, the in vivo results were validated through tumor xenografts. As displayed, miR-326 overexpression decreased volume and weight of tumors in HepG2 cells (Fig. 7a–c). In mice transplanted with HepG2 cells co-cultured with exosomes, the treatment with M1 macrophage exosomes significantly reduced the tumor volume and weight of HepG2 cells, while treatment with M1 macrophages-overexpressing miR-326 further reduced the tumor volume and weight of HepG2 cells (Fig. 7g–i).

M1 macrophage exosomal miR-326 reduces the volume and weight of HCC tumor in vivo. een –c The effect of transfection of miR-326 mimic on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with HepG2 cells. d –f The effect of transfection of miR-326 inhibitor on the tumor volume and tumors of nude mice xenografted with SMMC-7721 cells. g –ik The effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with HepG2 cells. j –l The effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with SMMC-7721 cells. In panel b and c, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel e and f, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel h and i, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel k and l, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (n = 5), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance

In SMMC-7721 cells, miR-326 suppression increased volume and weight of tumors (Fig. 7d–f). Untransfected M1 macrophages-derived exosomes obstructed tumor growth in volume and weight of SMMC-7721 cells. Co-cultured with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes, SMMC-7721 cells were injected into mice and caused elevations in tumor volume and weight (Fig. 7j–l). Summarily, miR-326 derived from M1 macrophage exosomes depressed tumor growth of HCC in vivo.

Discussion

HCC is a common cancer that is characterized with high morbidity and mortality, difficult early diagnosis and treatment, poor prognosis and 5-year survival rate [17]. Recently, a study has highlighted that the lowly expressed lncRNA cox-2 declines the ability of M1 macrophages to suppress HCC cell growth, invasiveness, angiogenesis migration and promote apoptosis [18]. Hu et al. have discussed that miR-326 is obviously degraded in HCC tissues and cell lines, while down-regulated miR-326 is connected to the TNM stage, lymph node metastasis and differentiation of HCC patients [14]. It is customarily considered that HCC cells-derived exosomes can form a fertile environment to facilitate HCC cells growth, invasiveness and metastasis as well as development of drug resistance [19]. The current study was designed to explore the mechanism of exosomal miR-326 in regulating invasion and migration of HCC cells.

Our results indicated that miR-326 expression decreased in HCC cells but increased in exosomes. A recent study has pointed out that miR-326 expression is declined in HCC tissues [20]. Another study has presented miR-326 expression is notably reduced in HCC cell lines and tissues and its down-regulation predicts a poor prognosis in HCC [13]. It is reported that miR-326 acts a tumor-suppression role and is greatly depressed in HCC cells [21]. All these aforementioned evidences are in line with our findings. A study has purported that in comparison with the controls, miR-326 expression is raised in Tconv-derived exosomes which is observed in relapsing–remitting multiple sclerosis patients [11].

Other results emerge from our data that highly expressed exosomal miR-326 reduced cell proliferation, colony formation, migration and invasion as well as facilitated apoptosis of HCC cells in vitro and reduced the volume and weight of HCC tumor in vivo. It has been suggested previously that HCC cell growth can be suppressed via overexpression of miR-326, and HCC cell migration and invasion ability are markedly attenuated through elevating miR-326 [21]. It is reported that the up-regulated miR-326 expression suppresses HCC cell growth and invasiveness as well as stimulates cell apoptosis in vitro [14]. Besides that, a prior study has verified that overexpression of miR-326 declined tumor growth in vivo [13]. A study has revealed that ectopic expressed miR-326 markedly attenuates cell growth, and suppresses cellular migration and invasiveness in non-small cell lung cancer cell lines [22]. Moreover, it is found that miR-326 decreases profibrotic genes like MMP-9, implying its repressive function in cancer cell proliferation [23]. Also, it is presented that miR-326 represses Bcl-2 protein expression and elevates Bax expression so as to affect the apoptosis [24]. Similar to our findings, there are some miRNAs interacting with exosomes to play a role in HCC development. It is displayed that highly expressed exosomal miR-638 can repress the proliferation of HCC cells, involving the potential impact on carcinogenesis [25]. Another study also proves that HCC cells-derived exosomal miR-451a suppresses tumor angiogenesis via disrupting endothelial functions as apoptosis, tube formation, migration and permeability [26]. A prior research generally confirms that when treated with the overexpression of miR-744 exosomes, the proliferation of HCC cells is dramatically suppressed [27].

Conclusion

To briefly conclude, our study provides evidence that M1 macrophage-derived exosomal miR-326 suppresses proliferation, migration and invasion as well as advances apoptosis of HCC cells, supplying a new insight in a novel target therapy for HCC. Due to the limited sample size and limited known researches, the exact mechanism of miR-326 is not fully elucidated, and therefore, further large-scale studies are required to illustrate the underlying mechanism.

Afkortingen

HCC:: Hepatocellular carcinoma
miRNAs:: MicroRNAs
FBS:: Fetal bovine serum
M/CSF:: Macrophage colony-stimulating factor
PBS:: Phosphate buffered saline
DMEM:: Dulbecco’s modified eagle medium
PPAR:: Peroxisome proliferator-activated receptor
TEM:: Transmissie elektronenmicroscoop
NTA:: Nanoparticle tracking analysis
NC:: Negative control
RT-qPCR:: Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction
BCA:: Bicinchoninic acid
BSA:: Bovine serum albumine
Exo:: Exosomes
ANOVA:: Eenrichtingsanalyse van variantie

Veelkleurige emitterende N-gedoteerde koolstofstippen afgeleid van ascorbinezuur en fenyleendiamine-precursoren hGC33-Modified en Sorafenib-Loaded Nanodeeltjes hebben een synergetisch anti-hepatoma-effect door de Wnt-signaleringsroute te remmen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal