Exosomale miR‑326 van M1 Macrofagen Remt Hepatocellulaire Carcinoma Progressie door Modulatie van NF‑κB Signalering

Samenvatting

Ophopende bewijzen tonen aan dat microRNA (miR) afkomstig van M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen de progressie van hepatocellulaire carcinoom (HCC) kan reguleren. Het effect van miR-326 afkomstig van M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen op HCC is echter nog niet gerapporteerd. Daarom was het doel van de huidige studie om het mechanisme van exosomale miR-326 van M1 macrofagen in de regulatie van HCC-celprogressie te verkennen. RT-qPCR detecteerde miR-326 expressie in HCC-cellijnen. De miR-326 expressie in HCC werd gewijzigd door transfactie, en het effect van miR-326 op CD206 en NF-κB expressie, celproliferatie, kolonievorming, migratie, apoptose en invasie werd gedetecteerd. Vervolgens werden exosomen geïsoleerd van M1 macrofagen. RT-qPCR identificeerde miR-326 expressie in M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen. De miR-326 expressie in M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen werd gewijzigd door transfactie. M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen werden geco-cultureerd met HCC-cellen om hun effecten op de biologische voortgang van HCC-cellen te bepalen. Tenslotte werden in vivo experimenten uitgevoerd om de in vitro resultaten te verifiëren. MiR-326 was verlaagd in HCC-cellen en verrijkt in M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen. Up-regulatie van miR-326 remde HCC-celproliferatie, kolonievorming, migratie, invasie, en CD206 en NF-κB expressie en bevorderde apoptose, en remde de groei van HCC-tumor in vivo, terwijl down-regulatie van miR-326 tegenovergestelde effecten toonde. M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen remden HCC-celproliferatie, kolonievorming, migratie, invasie, en CD206 en NF-κB expressie en versterkten apoptose, terwijl overexpressie van miR-326 het effect van M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen op HCC-cellen versterkte. Het is onthuld dat M1 macrofagen-gexosomeerde exosomale miR-326 proliferatie, migratie en invasie van HCC onderdrukt en apoptose bevordert door down-regulatie van NF-κB expressie.

Inleiding

Hepatocellulaire carcinoom (HCC) is de vijfde meest voorkomende kanker wereldwijd en de meest voorkomende primaire leverkanker. Volgens gegevens van het China National Cancer Registry is de sterftescijfer van primaire leverkanker de derde, terwijl de incidentie de vierde is onder veelvoorkomende maligniteiten. De belangrijkste risicofactoren voor HCC zijn chronische infectie met hepatitis C-virus en hepatitis B-virus, aflatoxine-gecontamineerde voedingsmiddelen, obesitas, roken, overmatige alcoholconsumptie en diabetes type 2. Transarteriële chemo-embolisatie is een gevestigde behandeling voor HCC in intermediaire stadia, wat de overleving verbetert in de meerderheid van HCC-patiënten in intermediaire of gevorderde stadia. Momenteel hangt de diagnose van HCC voornamelijk af van serum biomarkers en imaging technieken. HCC-gerelateerde 5-jaars overlevingscijfer is slechts ongeveer 60%, en de incidentie stijgt jaarlijks in de laatste jaren. Gezien dit, is het zoeken naar nauwkeurige therapeutische doelen een prioriteit in de behandeling van HCC.

Macrofagen zijn effectorcellen en belangrijke regulatoren van het immuunsysteem, uitoefenende enorme functies op weefselherstel en -reparatie, en uitvoerende orchestrerende metabolische functies in vrijwel alle weefsels in vivo. Het is onthuld dat M1 macrofagen tumor-bevorderende effecten uitoefenen en de motiliteit van HCC-cellen vergroten. Exosoom is een discoïde vesikel met een diameter van 40–150 nm. Volgens Xu et al. hebben exosomale microRNAs (miRNAs) functies op proliferatie, invasiviteit, metastase en medicamentenresistentie van HCC via modulatie van genexpressie in de doelcellen. Een studie heeft aangetoond dat miR-326 bevattende exosomen een potentiële klinische doelmogelijkheid kunnen zijn in multiple sclerose. MiRNAs kunnen fungeren als oncogenen of tumorremmers door modulatie van een groot aantal proteïne-coderende genen expressie via mRNA-afbraak en vertaalblokkade in een specifieke sequentie. Een studie heeft besproken dat miR-326 HCC-celgroei onderdrukt door verstoring van celcyclusvoortgang en versterking van apoptose, bovendien onderdrukt celinvasie via afname van het epitheel-mesenchymale transitiefenotype. Een andere studie heeft gerapporteerd dat miR-326 een potentiële therapeutisch doel kan zijn voor HCC-patiëntenbehandeling. Daarom bespreekt deze huidige studie het mechanisme van exosomale miR-326 die de invasie en migratie van HCC-cellen reguleert.

Materialen en Methodes

Ethiekverklaring

Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Richtlijn voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren door Internationale Commissies. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutionele Dierproevencommissie van het Derde Ziekenhuis van de Universiteit van Jilin.

Inductie en Identificatie van Macrofagen

Humane monocytaire cellijn THP-1 (Kunming Instituut voor Zoologie, CAS, Kunming, China) werd gekweekt in RPMI 1640 medium (Gibco, CA, USA; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) met 10% hitte-geïnactiveerde foetale kalvesserum (FBS). THP-1 cellen werden gereageerd met 150 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, USA) en geïnculeerd in RPMI medium gedurende 24 uur om M0 macrofagen te verkrijgen. Vervolgens werd de celmorfologie voor en na inductie waargenomen door Wright kleuring. THP-1 cellen en geïnduceerde macrofagen werden heropgelost in 5 μL PBS, op het glasplaatje gedropt, gekleurd met Wright's kleurstofoplossing en gemengd met de buffoplossing 1:2. 10 min gekleurd en gespoeld met lopend water, de cellen werden waargenomen onder de microscoop. Daarnaast werden M0 macrofaagmarkers (CD68 en CD206) gemeten door reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR). Vervolgens werden macrofagen geïnduceerd tot M1 macrofagen door incubatie met 20 ng/mL Interferon (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, USA) en 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) gedurende 18 uur. M1 macrofaagmarkers (IDO1 en IL-12 p35) werden onderzocht door RT-qPCR.

Exosom Extractie

De exosomen werden geëxtraheerd door exosom scheidingskit (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Duitsland). Macrofag supernatant werd verzameld in een 15-mL centrifugerbuis onder aseptische condities en gefiltreerd door 0,8-μM filterfilm. Celsupernatant in elke groep werd aangevuld met XBP buffer (1:1) en vervolgens gecentrifugeerd met exoEasy membraanaffiniteitscentrifugekolom bij 500g. Cellen werden aangevuld met 10 mL XWP buffer en gecentrifugeerd met 3000–5000g. De exoEasy membraanaffiniteitscentrifugekolom werd bebroed met 400 μL XE elueringsbuffer en gecentrifugeerd bij 500g. De elueringsbuffer werd overgebracht naar exoEasy membraanaffiniteitscentrifugekolom en gecentrifugeerd bij 500g. De elueringsbuffer werd 24 uur opgeslagen bij 4 °C en vervolgens gebruikt voor identificatie. De rest werd opgeslagen bij −80 °C.

TEM Waarneming en Nanopartikel Tracking Analyse (NTA)

De bovengenoemde exosomen werden gedropt in het koolstof-ondersteunde membraankoperen gaasje en toegevoegd met 2% fosfortungstenzuur. Het monster werd waargenomen onder een TEM en de optimale afbeelding werd verzameld en geanalyseerd.

De onzuiverheden en deeltjes in PBS werden verwijderd door een 0,22-μM microporeus filter. Volgens de deeltjesdichtheid van de exosomen, werd het gefiltreerde PBS gedilueerd tot de juiste concentratie en gedetecteerd met een Nanosight NS300 nanoparticledetector (Malvern, Westborough, MA, USA).

Na identificatie werden macrofaag-gexosomeerde exosomen getransfecteerd met miR-326 inhibitor en miR-326 inhibitor negatieve controle (NC), miR-326 mimic en miR-326 mimic NC geëxtraheerd door exosom scheidingskit (Invitrogen).

RT-qPCR

De totale RNA werd geëxtraheerd met Trizol Reagent (Thermo Fisher), en real-time PCR werd uitgevoerd met SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) en het ABI 7500 Real-Time PCR Systeem (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). De primer sequenties zijn weergegeven in Tabel 1. De kwantitatieve analyse werd uitgevoerd met de 2⁻ΔΔCt methode.

Western Blot Analyse

Het totale eiwit van cellen en exosomen werd geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald door bicinchoninezuur (BCA) kit (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Het eiwit werd aangevuld met monsterbuffer en gekookt bij 95 °C, en elk putje werd geladen met 30 µg. Het eiwit werd gescheiden met 10% polyacrylamidgelektroforese (Boster Biological Technology) en geëlectroblotted op een polyvinylideenfluoride membraan, wat gevolgd werd door afsluiting in 5% bovine serum albumine (BSA). Het membraan werd bebroed met primaire antilichaam tegen CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universiteit van Iowa, Ames, IA, USA), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA) en met het secundaire antilichaam (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) gelabeld met peroxidase. De beelden werden verkregen door Odyssey dual-kleur infrarood fluorescentie scanner beeldsysteem, en de grijze waarden van banden werden gemeten door Quantity One beeldanalysesoftware.

Celkweek en Screening

Normale lepercellijnen HL-7702 en humane HCC-cellijnen BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 en QGY-7703 werden geselecteerd en gekweekt in Gibco RPMI Media 1640 met 10% foetale kalvesserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 mg/mL). MiR-326 expressie werd gedetecteerd door RT-qPCR, en de geschikte cellijnen werden gescreend.

Exosom Labeling en Opname van Exosomen

De exosomen werden heropgelost met 250 μL Verdunner C en zacht getritureerd om schade aan het exosoommembraan te vermijden. De PKH67 kleurstof (1 μL, Sigma-Aldrich) werd toegevoegd aan 250 μL Verdunner C om 500 μL te bereiken en geïnculeerd. De oplossing werd aangevuld met 500 μL 1% BSA en geïnculeerd bij 37 °C gedurende 1 min. De exosomen werden verkregen door centrifugatie bij 120.000g 4 °C gedurende 2 uur. De met PKH67 gelabelde exosomen werden verkregen door centrifugatie bij 120.000g 4 °C gedurende 2 uur. De exosomen werden heropgelost met 6 mL RPMI-1640 medium vermijdend licht. Vervolgens werden de gelabelde exosomen 12 uur geco-cultureerd met HCC-cellen. Daarna werd het kweekmedium verwijderd en 3 keer met PBS gewassen, 5 min/keer, en de fluorescentie-gelabelde exosomen die niet intern geabsorbeerd waren door HCC-cellen werden grondig afgewassen. De exosomen werden vastgezet met 4% paraformaldehyde en gekleurd met 4'-6-diamidino-2-fenylindole. Na afsluiting werd de fluorescentieverdeling waargenomen door een laserconfocale microscoop.

Celgroepering en Behandeling

HepG2 cellen en SMMC-7721 cellen werden gezaaid in de 12-putten plaat bij 0,5–1 × 10⁶ cellen/put. Bij 50–60% confluentie werden cellen getransfecteerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). HepG2 cellen werden verdeeld in miR-326-mimic groep (getransfecteerd met miR-326 mimic) en NC-mimic groep (getransfecteerd met miR-326 mimic NC). SMMC-7721 cellen werden toegewezen aan miR-326-inhibitor groep (getransfecteerd met miR-326 inhibitor) en NC-inhibitor groep (getransfecteerd met miR-326 inhibitor NC). miR-326-mimic, miR-326-inhibitor en hun NC's werden gemengd met Lipofectamine 2000 voor transfactie. HepG2 cellen en SMMC-7721 cellen zonder enige behandeling werden ingesteld als blanco groep. miR-326-mimic, miR-326-inhibitor en hun NC werden ontworpen en samengesteld door Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, China) (Tabel 1).

Co-cultuur van M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomen met HCC-cellen

De eiwitconcentratie van M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen suspensie werd gedetecteerd door BCA methode, en het volume van de corresponderende exosomen suspensie met 50 μg eiwit werd berekend. HepG2 cellen en SMMC-7721 cellen werden gezaaid in 12-putten plaat bij 1 × 10⁵ cellen/mL per put. HepG2 cellen werden verdeeld in 4 groepen: controle groep (HepG2 cellen niet geco-cultureerd met exosomen), exosomen (Exo) groep (HepG2 cellen geco-cultureerd met M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen), Exo-miR-326-mimic groep (HepG2 cellen geco-cultureerd met M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen getransfecteerd met miR-326 mimic), Exo-NC-mimic groep (HepG2 cellen geco-cultureerd met M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen getransfecteerd met miR-326 mimic NC). SMMC-7721 cellen werden ook toegewezen aan 4 groepen: blanco groep (SMMC-7721 cellen niet geco-cultureerd met exosomen), Exo groep (SMMC-7721 cellen geco-cultureerd met M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen), Exo-miR-326-inhibitor groep (SMMC-7721 cellen geco-cultureerd met M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen getransfecteerd met miR-326 inhibitor), Exo-NC-inhibitor groep (SMMC-7721 cellen geco-cultureerd met M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen getransfecteerd met miR-326 inhibitor NC).

MTT Assay

De cellen werden losgemaakt met trypsine en gezaaid op 96-putten plaat met een celdichtheid van 4 × 10⁴ cellen per put. Het kweekmedium werd achtergelaten na kweken van 12, 24, 36, 48, 60 uur respectievelijk. Geïnculeerd met 500 μL 0,5 g/L MTT oplossing, werden de cellen aangevuld met 200 μL dimethylsulfoxide oplossing, getritureerd en bebroed. Optische dichtheid (OD, 490 nm) waarden werden gemeten door een microplaatlezer.

Kolonievormingsassay

Gekweekt gedurende 24 uur en losgemaakt met trypsine, werden de cellen gezaaid in een 35-mm klein schotel met 300 cellen per schotel. De oplossing werd elke 3 dagen verversd. Na 10 dagen kweek werden de cellen vastgezet met 40 g/L paraformaldehyde en gekleurd met 1 g/L kristalvioleetoplossing en gedroogd. Kolomienummer (meer dan 50 cellen) werd geteld onder een microscoop.

Transwell Assay

Cellen (1 × 10⁵) werden opgelost met 200 μL blanco kweekmedia. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de instructie van Transwell kamer (Corning Glass Works, Corning, N.Y., USA) (matrigel was nodig voor invasie-experiment, maar niet voor migratie-experiment). RPIM 1640 (10% FBS, 600 μL) werd toegevoegd aan de onderste kamer. De boven- en onderste kamers werden gescheiden door een Transwell membraan voorbehandeld met matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Gekweekt gedurende 24 uur, werd de kamer vastgezet met 95% alcohol. Na kleuring met kristalvioleetoplossing werden cellen waargenomen in vijf visuele velden onder de microscoop.

Flow Cytometrie

Celcyclus: cellen werden losgemaakt door trypsine. Cellen (1 × 10⁶) werden opgelost met 0,5 mL PBS en getritureerd tot enkele suspensie. Gemengd met 4,5 mL voorverkoelde 70% ethanol op ijs, werden de gecentrifugeerd bij 3000g, gespoeld met 5 mL PBS en opnieuw gecentrifugeerd bij 3000g. Vervolgens werden de cellen opgelost met 1 mL PI/Triton X-100 kleurstofoplossing (20 μg PI/0,1% Triton X-100) bevattende 0,2 mg RnaseA. Celcyclus werd gedetecteerd door flow cytometrie.

Celapoptose: Trypisiniseerde cellen (1 × 10⁶) werden opgelost met 1 mL PBS, getritureerd en gecentrifugeerd bij 3000g. Celen werden om de beurt gespoeld met incubatiebuffer (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂) en gecentrifugeerd bij 3000g. Vervolgens werden cellen geïnculeerd met 100 μL merkingsoplossing (FITC-Annexin V en PI werden toegevoegd aan de incubatiebuffer om 1 μg/mL te bereiken), gecentrifugeerd bij 3000g, eenmaal gewassen met incubatiebuffer en bebroed met fluorescerende (SA-FLOUS) oplossing. Celapoptose werd gedetecteerd door flow cytometrie. De golflengte van flow cytometrie was 488 nm, en FITC fluorescentie werd gedetecteerd door bandfilter bij 515 nm, terwijl PI met golflengte groter dan 560 nm. De resultaten werden automatisch geanalyseerd door computer.

Tumor Xenograft in Naakte Muizen

Veertig muizen (Faculteit Dierwetenschappen, Universiteit van Jilin, Jilin, China) van 4–6 weken oud werden willekeurig verdeeld in 8 groepen, met 5 muizen in elke groep. De muizen werden gevoed in een specifiek pathogen-vrij dierenlaboratorium gedurende 1 week, en het voer, bedje en waterflesje werden tijdig vervangen. De gezondheidstoestand van de muizen moet elke dag waargenomen worden. Een week later werden HCC-cellen voorbereid tot celsuspensie en subcutaneus geïnjecteerd in de nek en rug bij 0,1 mL celsuspensie (1 × 10⁶). De groei van de tumor werd waargenomen na 3–5 dagen. De naakte muizen werden elke 4 dagen geweegd, en het tumort volume werd gemeten. De naakte muizen werden gedood 20 dagen na injectie.

Statistische Analyse

Alle data werden geïnterpreteerd door SPSS 17.0 software (SPSS Statistics, Chicago, IL, USA). Meetdata werden aangegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden geformuleerd door de t-toets, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen beoordeeld werden door eenzijdige variantieanalyse (ANOVA). P-waarde < 0,05 was indicatief voor statistisch significant verschil.

Resultaten

Identificatie van M1 Macrofaag en Exosomen

Wright's kleuring werd gebruikt om de morfologie van THP-1 cellen geïnduceerd door PMA te observeren. Het was afgebeeld dat het volume van THP-1 cellen voor inductie klein was en de verhouding van caryoplasma hoger was; de morfologie van cellen na inductie was onregelmatig, het volume werd groter, en de verhouding van caryoplasma nam af; het cytoplasma was rijker en vertoonde lichtblauw, met veel deeltjes en enkele vacuolen; de kern was purperrood en vaak geneigd naar één kant, wat aantoonde dat de cellen de typische morfologische kenmerken van macrofagen hadden (Fig. 1a).

Om de succesvolle inductie van macrofagen verder te verifiëren, werd CD68 en CD206 expressie voor en na inductie getest door RT-qPCR. Het was manifesteerd dat CD68 en CD206 expressie verhoogd was sinds PMA inductie, wat aangeeft dat PMA succesvol THP-1 cellen in M0 macrofagen had geïnduceerd (Fig. 1b). Vervolgens werden M0 macrofagen gepolariseerd tot M1 macrofagen door inductie van LPS en INF-γ. De morfologie, en M1 type macrofaag oppervlaktemarkers IDO1 en IL-12 p35 expressie van macrofagen werden waargenomen en getest. M0 macrofagen vertoonden diverse en onregelmatige hechtende morfologieën, rond, elliptisch of spindelvormig. De morfologie van macrofagen gestimuleerd door IFN-γ vertoonde meer pseudopodia en uitstulpingen en fusiforme vorm (Fig. 1c). RT-qPCR schetste (Fig. 1d) dat na LPS en INF-γ behandeling, M1 macrofagen een toename vertoonden in hun markers (IDO1 en IL-12p35).

Vervolgens werden de exosomen afkomstig van macrofagen waargenomen door de TEM. Het werd onthuld dat de exosomen afkomstig van macrofagen rijk waren en de vorm rond of ovaal was, met membraanstructuur, uniforme grootte en minder verontreinigingen (Fig. 1e). NTA toonde aan dat exosomen met een gecentraliseerde piek van de MODE-kromme en soepel lineair een meer geconcentreerde diameter en minder onzuiverheden hadden (Fig. 1f). Western blot analyse rapporteerde dat versus macrofagen, de specifieke markerproteïnen CD63 en CD181 expressie verhoogd was in exosomen afkomstig van macrofagen (Fig. 1g). Deze resultaten geven aan dat we succesvol monocyten hebben gedifferentieerd in macrofagen en deze gepolariseerd in M1 macrofagen.

M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomen Leveren miR-326 aan HCC-cellen en Beïnvloeden miR-326 Expressie in HCC-cellen

Om te verifiëren of exosomen afkomstig van M1 macrofagen miR-326 transporteerden naar HCC-cellen, werden HepG2 en SMMC-7721 cellen geco-cultureerd met exosomen. Het kon herkend worden dat een groot aantal exosomen werden geassimileerd door HepG2 en SMMC-7721 cellen na 4-uurs transfactie onder de fluorescentiemicroscoop (Fig. 2a, b).

Vervolgens werd miR-326-mimic/inhibitor getransfecteerd in macrofagen en miR-326 expressie in hun exosomen voor en na transfactie gecontroleerd. Het werd getoond dat versus de exosomen van M0 macrofagen, miR-326 expressie verhoogd was in M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen. Verhoogde miR-326 expressie werd gezien in de M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen met miR-326-mimic behandeling. MiR-326 expressie verminderde in M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen met miR-326-inhibitor behandeling (Fig. 2c).

Vervolgens werd miR-326 expressie in HCC-cellijnen getest. Zo manifesteerd, was miR-326 expressie verlaagd in BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 en QGY-7703 cellen vergeleken met HL-7702 cellen, waarvan HepG2 cellen de laagste expressie vertoonden, terwijl SMMC-7721 cellen de hoogste expressie vertoonden (Fig. 2d).

Daarna werden miR-326-mimic en miR-326-inhibitor getransfecteerd in HepG2 en SSMC-7721 cellen respectievelijk, en hun effecten op miR-326 expressie onderzocht. MiR-326 mimic verhoogde miR-326 expressie in HepG2 cellen, terwijl miR-326 inhibitor miR-326 expressie in SSMC-7721 cellen verlaagde (Fig. 2e, f).

Vervolgens werden de exosomen van M1 macrofagen getransfecteerd met miR-326-mimic en miR-326-inhibitor geco-cultureerd met HepG2 en SSMC-7721 cellen respectievelijk. Het werd benadrukt dat co-cultuur met exosomen miR-326 expressie in HCC-cellen verhoogde, miR-326-mimic-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen miR-326 expressie in HepG2 cellen verder verhoogden, terwijl miR-326-inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen miR-326 expressie in SSMC-7721 cellen degradeerden (Fig. 2g, h). Het wordt gesuggereerd dat M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen miR-326 leveren aan HCC-cellen en miR-326 expressie in HCC-cellen beïnvloeden.

M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomale miR-326 Vermindert Celproliferatie en Kolonievormingsvermogen in HCC-cellen

In het verkennen van het effect van exosomale miR-326 op de proliferatie van HCC-cellen, werden MTT en kolonievormingsassays uitgevoerd om HCC-celproliferatie te onderzoeken. Het werd gesuggereerd dat in HepG2 cellen, miR-326 herstel celproliferatie en kolonievormingsvermogen verstoorde (Fig. 3a, e, f). M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen belemmerden HepG2 cellen te prolifereren en koloniën te vormen. MiR-326 mimic-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen verstoorden celproliferatie en kolonievormingsvermogen verder (Fig. 3c, i, j).

In SMMC-7721 cellen versterkte miR-326 knockdown celproliferatie en kolonievormingsvermogen (Fig. 3b, g, h). In SMMC-7721 cellen behandeld met M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen, waren celproliferatie en kolonievormingsvermogen verminderd. MiR-326-inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen moedigten celproliferatie en kolonievormingsvermogen verder aan (Fig. 3d, k, l). Het wordt angedeut dat miR-326 afkomstig van M1 macrofaag-gexosomeerde exosomen de proliferatie van HCC-cellen belemmert.

M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomale miR-326 Onderdrukt Migratie en Invasie van HCC-cellen

Vervolgens werd het effect van exosomale miR-326 op de invasie en migratie van HCC-cellen onderzocht. Het werd gedemonstreerd dat in HepG2 cellen, herstel van miR-326 invasie en migratie beperkte (Fig. 4a–c). M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen stoorden HepG2 cellen te invadieren en migreren. Invasie en migratie degradeerden verder toen HepG2 cellen geco-cultureerd werden met miR-326-mimic-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen (Fig. 4g–i).

MiR-326 knockdown resulteerde in verbeteringen in SMMC-7721 celinvasie en migratie (Fig. 4d–f). Bij behandeling met M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen, vertoonden SMMC-7721 cellen verminderde invasie en migratie. Echter, SMMC-7721 celinvasie en migratie werden versterkt bij co-cultuur met miR-326-inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen (Fig. 4j–l). Het wordt geïmpliceerd dat miR-326 afkomstig van M1 macrofaag exosomen de invasie en migratie van HCC-cellen belemmert.

M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomale miR-326 Bevordert Apoptose van HCC-cellen

Bij het onderzoeken van het effect van exosomale miR-326 op de celcyclus en apoptose van HCC-cellen, werden PI enkelvlekken en Annexin V-FITC/PI dubbele vlekken toegepast. Het werd geïllustreerd dat miR-326 overexpressie cellen gearresteerd in G0/G1-fase verhoogde, cellen gearresteerd in S en G2/M-fasen verminderde en apoptose verhoogde in HepG2 cellen (Fig. 5a–d). Co-cultuur met M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen verhoogde cellen gearresteerd in G0/G1-fase, verminderde cellen gearresteerd in S en G2/M-fasen en verhoogde celapoptose van HepG2 cellen. Co-cultivatie met exosomen van M1 macrofagen getransfecteerd met miR-326-mimic versterkte deze effecten verder (Fig. 5i–l).

In SMMC-7721 cellen, verlaagde miR-326 regulatie cellen gearresteerd in G0/G1-fase, verhoogde cellen gearresteerd in S en G2/M-fasen, en verlaagde celapoptose (Fig. 5e–h). Ongetransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen verhoogden cellen gearresteerd in G0/G1-fase, verminderden cellen gearresteerd in S en G2/M-fasen, en verhoogden celapoptose. MiR-326-inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen degradeerden cellen gearresteerd in G0/G1-fase, verhoogden cellen gearresteerd in S en G2/M-fasen, en verminderden celapoptose (Fig. 5m–p). Samengevat, wordt geconcludeerd dat miR-326 afkomstig van M1 macrofaag exosomen celcyclus arresteert in G0/G1-fase en celapoptose induceert in HCC.

M1 Macrofaag-gexosomeerde Exosomale miR-326 Verlaagt CD206 en NF-κB Expressie in HCC-cellen

Vervolgens werd het potentiële mechanisme van miR-326 afkomstig van M1 macrofaag exosomen in de biologische voortgang van HCC-cellen verkend. NF-κB is de sleutelschakel tussen inflammatie en kanker. Veel regulatorische proteïnen en miRNAs kunnen de excessief geactiveerde NF-κB signalering remmen om kanker te onderdrukken. Zulke een gunstig effect kan de polarisatie van M2 macrofagen in M1 macrofagen omvatten. CD206 en NF-κB expressie in HepG2 en SMMC-7721 cellen werd getest door RT-qPCR. Het werd gesuggereerd dat miR-326 herstel CD206 en NF-κB expressie in HepG2 cellen verlaagde, terwijl miR-326 knockdown CD206 en NF-κB expressie in SMMC-7721 cellen verhoogde (Fig. 6a, b). Bovendien verlaagde co-cultuur met M1 macrofaag exosomen significant CD206 en NF-κB expressie in HepG2 cellen, terwijl co-cultuur met M1 macrofaag exosomen overexprimerend miR-326 CD206 en NF-κB expressie verder verlaagde. Behandeld met ongetransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen, werd CD206 en NF-κB expressie verlaagd in SMMC-7721 cellen. Geco-cultureerd met miR-326-inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen, vertoonden SMMC-7721 cellen verhoogde CD206 en NF-κB expressie (Fig. 6c, d). Het werd geconcludeerd dat miR-326 van M1 macrofaag exosomen een tumorsuppressor rol speelde door NF-κB in HCC-cellen te remmen.

miR-326 van M1 Macrofaag Exosomen Remt HCC Tumor Groei In Vivo

Tenslotte werden de in vivo resultaten gevalideerd door tumor xenografts. Zo getoond, verlaagde miR-326 overexpressie volume en gewicht van tumoren in HepG2 cellen (Fig. 7a–c). In muizen getransplanteerd met HepG2 cellen geco-cultureerd met exosomen, verminderde de behandeling met M1 macrofaag exosomen significant het tumort volume en gewicht van HepG2 cellen, terwijl behandeling met M1 macrofagen overexprimerend miR-326 het tumort volume en gewicht van HepG2 cellen verder verlaagde (Fig. 7g–i).

In SMMC-7721 cellen verhoogde miR-326 onderdrukking volume en gewicht van tumoren (Fig. 7d–f). Ongetransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen belemmerden tumorgroei in volume en gewicht van SMMC-7721 cellen. Geco-cultureerd met miR-326 inhibitor-getransfecteerde M1 macrofagen-gexosomeerde exosomen, werden SMMC-7721 cellen in muizen geïnjecteerd en veroorzaakten toename in tumort volume en gewicht (Fig. 7j–l). Samengevat, onderdrukte miR-326 afkomstig van M1 macrofaag exosomen tumorgroei van HCC in vivo.

Discussie

HCC is een veelvoorkomende kanker die gekenmerkt wordt door hoge morbiditeit en sterfte, moeilijke vroege diagnose en behandeling, slechte prognose en 5-jaars overlevingscijfer. Recentelijk heeft een studie benadrukt dat de laag geëxprimeerde lncRNA cox-2 de capaciteit van M1 macrofagen vermindert om HCC-celgroei, invasiviteit, angiogenese migratie te onderdrukken en apoptose te bevorderen. Hu et al. hebben besproken dat miR-326 duidelijk gedegradeerd is in HCC-weefsels en cellijnen, terwijl gedown-reguleerde miR-326 verbonden is met het TNM-stadium, lymfeknoedemetastase en differentiatie van HCC-patiënten. Het wordt gewoonlijk beschouwd dat HCC-cel-gexosomeerde exosomen een vruchtbare omgeving kunnen vormen om HCC-celgroei, invasiviteit en metastase alsook ontwikkeling van medicamentenresistentie te faciliteren. De huidige studie was ontworpen om het mechanisme van exosomale miR-326 in het reguleren van invasie en migratie van HCC-cellen te verkennen.

Onze resultaten gaven aan dat miR-326 expressie afnam in HCC-cellen maar toenam in exosomen. Een recente studie heeft aangewezen dat miR-326 expressie afneemt in HCC-weefsels. Een andere studie heeft gepresenteerd dat miR-326 expressie notable verminderd is in HCC-cellijnen en weefsels en de down-regulatie voorspelt een slechte prognose in HCC. Het wordt gerapporteerd dat miR-326 een tumor-onderdrukkende rol speelt en sterk gedempt is in HCC-cellen. Al deze bovengenoemde bewijzen zijn in lijn met onze bevindingen. Een studie heeft bewerd dat in vergelijking met de controles, miR-326 expressie verhoogd is in Tconv-gexosomeerde exosomen wat waargenomen is in relapserend-remitterende multiple sclerose patiënten.

Andere resultaten komen naar voren uit onze data dat hoog geëxprimeerde exosomale miR-326 celproliferatie, kolonievorming, migratie en invasie verminderde alsook apoptose van HCC-cellen in vitro bevorderde en het volume en gewicht van HCC-tumor in vivo verlaagde. Er is eerder gesuggereerd dat HCC-celgroei kan worden onderdrukt via overexpressie van miR-326, en HCC-cel migratie en invasie capaciteit zijn merkbaar verzwakt door verhooging van miR-326. Het wordt gerapporteerd dat de up-gereguleerde miR-326 expressie HCC-celgroei en invasiviteit onderdrukt alsook celapoptose in vitro stimuleert. Naast dat, heeft een eerdere studie geverifieerd dat overexpressie van miR-326 tumorgroei in vivo verminderde. Een studie heeft onthuld dat ectopisch geëxprimeerde miR-326 merkbaar celdeling verzwakt, en cellulaire migratie en invasiviteit onderdrukt in non-klein-cel longkanker cellijnen. Bovendien is gevonden dat miR-326 profibrotische genen zoals MMP-9 vermindert, wat zijn remmende functie in kankercelproliferatie impliceert. Ook wordt gepresenteerd dat miR-326 Bcl-2 proteïnexpressie onderdrukt en Bax expressie verhoogt om de apoptose te beïnvloeden. Vergelijkbaar met onze bevindingen, zijn er enkele miRNAs die interacteren met exosomen om een rol te spelen in HCC-ontwikkeling. Het wordt getoond dat hoog geëxprimeerde exosomale miR-638 de proliferatie van HCC-cellen kan onderdrukken, met betrekking tot de potentiële impact op carcinogenese. Een andere studie bewijst ook dat HCC-cel-gexosomeerde exosomale miR-451a tumorangiogenese onderdrukt door verstoring van endotheliale functies als apoptose, buisvorming, migratie en permeabiliteit. Een eerdere onderzoek bevestigt over het algemeen dat bij behandeling met de overexpressie van miR-744 exosomen, de proliferatie van HCC-cellen dramatisch onderdrukt wordt.

ConclusieKortom, onze studie levert bewijs dat M1 macrofaag-gexosomeerde exosomale miR-326 proliferatie, migratie en invasie van HCC-cellen onderdrukt alsook apoptose bevordert, wat een nieuw inzicht biedt in een nieuwe doeltherapie voor HCC. Vanwege de beperkte steekproefgrootte en beperkt bekende onderzoeken, is het exacte mechanisme van miR-326 niet volledig aufgehelderd, en daarom zijn verder grootschalige studies vereist om het onderliggende mechanisme te illustreren.