hGC33-Gerichte Sorafenib Nanodeeltjes Remmen Synergistisch Hepatoom via Wnt Pathway Onderdrukking

Samenvatting

Aflevering van tumor-specifieke inhibitoren is een uitdaging in kankerbehandeling. Antistof-gemodificeerde nanodeeltjes hun hun geladen medicijnen af naar tumorcellen die specifieke tumor-geassocieerde antigenen overexprimeren. Hier bouwden we sorafenib-geladen polyetheen glycool-b-PLGA polymere nanodeeltjes gemodificeerd met antistof hGC33 tegen glypicaan-3 (GPC3+), een membraaneiwit dat overexprimeerd is in hepatocellulaire carcinoom. We vonden dat hGC33-gemodificeerde NPs (hGC33-SFB-NP) GPC3+ hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellen specifiek aansturen door specifiek te binden aan GPC3 op het oppervlak van HCC-cellen, Wnt-geïnduceerde signaaltransductie remmen, en HCC-cellen in G0/1 remmen door cycline D1 expressie te down-reguleren, wat HCC-celmigratie attenueert door epitheel-mesenchymale transitie te remmen. hGC33-SFB-NP remde de migratie, cyclusvoortgang en proliferatie van HCC-cellen door het Ras/Raf/MAPK pathway en het Wnt pathway in tandem met GPC3 moleculen respectievelijk te remmen. hGC33-SFB-NP remde de groei van leverkanker in vivo en verbeterde de overlevingscijfer van tumor-dragende muizen. We concluderen dat hGC33 de targetering van SFB-NP naar HCC-cellen verhoogt. hGC33-SFB-NP remt synergistisch de progressie van HCC door het Wnt pathway en het Ras/Raf/MAPK pathway te blokkeren.

Inleiding

Glypicaan3 (GPC3) is een heparansulfaatproteoglycaan dat op celoppervlakken tot uitdrukking komt via een mechanisme met glycerofosfatidylinositol ankers. Hoewel GPC3 tot expressie komt in diverse weefsels tijdens de ontwikkeling, is de expressie ten minste deels onderdrukt in de meeste volwassen weefsels door DNA-methylatie in de promoterregio. Echter, GPC3-eiwit is overexprimeerd in ongeveer 70% van de hepatocellulaire carcinoom (HCC) patiënten en stimuleert klassieke Wnt-signaaltransductie door interactie met Wnt-ligand, wat Wnt/frizzled binding bevordert om HCC-groei te stimuleren. Activering van de klassieke Wnt-signaalweg is een van de meest frequente gebeurtenissen geassocieerd met maligne transformatie van HCC. Gebaseerd op GPC3's vermogen om Wnt-signaling te verhogen, veronderstelden we dat overexpressie van GPC3 HCC-groei bevordert door de klassieke Wnt-weg te stimuleren.

Therapeutische monoclonale antistof die een epitoop in het C-terminale deel van GPC3 (524–563) herkent (hGC33), die het C-terminale epitoop van GPC3 (524–563) herkent, remt tumorgroei in subcutane xenografts van HepG2 en Huh-7 in muizen. hGC33 is gehumaniseerd door complementaire beslissingsregio-transplantatie, en het antikankereffect is even effectief als hGC33 voor HepG2 xenotransplantatie, en hGC33 is gebruikt in klinische studies. Deze resultaten suggereren dat hGC33 belangrijke antitumoractiviteit heeft, en anti-GPC3 behandeling zal direct de proliferatie en/of overleving van HCC-cellen remmen door Wnt en/of andere signaleringspaden te blokkeren.

Echter, door de complexe pathogenese van HCC, is de effectiviteit van het blokkeren van GPC3 alleen beperkt. Daarom kan het verkennen van het gedetailleerde mechanisme van HCC-pathogenese en het identificeren van veelbelovende biomarkers voor diagnose en prognose van HCC helpen effectieve therapeutische doelen te bieden en de prognose van patiënten te verbeteren. Anti-GPC3 antilichamen zijn voorgesteld om de gevoeligheid van HCC voor chemotherapeutica te verhogen. De antitumoractiviteit van hGC33 in combinatie met standaard chemotherapeutica is recent geëvalueerd. Sorafenib is een nieuw, oraal gerichte HCC-medicament dat direct de proliferatie van tumorcellen kan remmen door de celsignaalweg gemedieerd door RAF/MEK/ERK te blokkeren om tumorgroei te bezien. Echter, de niet-gerichte distributie van sorafenib in vivo en abnormaal geactiveerde Wnt-signalen in HCC beperken de effectiviteit van het medicament en verhogen de bijwerkingen. Wnt bindt aan receptoren in de Frizzled-familie om intracellulaire signaaltransductie te activeren die celproliferatie, apoptose en celmigratie regelt, en medicamentenresistentie veroorzaakt in veel tumoren, zoals HCC.

In HepG2 xenotransplantatiemodellen is de combinatie van hGC33 en sorafenib effectiever in het remmen van tumorgroei dan sorafenib alleen, en medicamentenaflevering met polymere nanodragers heeft veel aandacht gekregen in kankerbehandeling. Anticancer-medicament-geladen nanodragers kunnen niet-specifieke distributie en niet-specifieke afbraak in vivo voorkomen, de farmaceutische beschikbaarheid en antitumor-targetering verbeteren, en de evaluatie van farmacokinetiek en behandeling vereenvoudigen. In een verscheidenheid aan polymere nanodeeltjes, worden poly(lactide-co-glycolzuur) (PLGA)-gebaseerde formuleringen beschouwd als ideale en veilige medicamentendragers. In dit opzicht zijn poly(etheen glycool)-b-poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PEG-b-PLGA) gebaseerd op polyetheenglycol en PLGA-copolymere, die veilig en niet-toxisch zijn na hydrolyse, en goedgekeurd door de US Food and Drug Administration. Daarom is intraveneuze injectie met nanodrager van PEG-b-PLGA copolymere een veelbelovende strategie om gerichte aflevering te bereiken en de effectiviteit te verbeteren. Verder kan de toepassing van specifieke antistof hGC33 tegen GPC3 moleculen op HCC-celmembraan niet alleen de aflevering van nanomedicijn targetering in vitro en in vivo verbeteren, maar ook Wnt en/of andere signaalpaden verbonden met GPC3 blokkeren, de proliferatie en/of overleving van kankercellen remmen, en synergistische antitumoractiviteit bereiken.

In deze studie onderzochten we of hGC33 antistof-gemodificeerde copolymere PEG-b-PLGA nanodeeltjes de aflevering van sorafenib (hGC33-SFB-NP) aan HCC in vivo en in vitro kunnen faciliteren, en de efficiëntie van HCC-behandeling kunnen verbeteren door HCC-actieve targetering om de farmacokinetiek van het medicament te veranderen. Volgens de deeltjesgrootte, zeta-potentiaal, deeltjesmorfologie, medicament inkapselings-efficiëntie, medicament lading capaciteit, en in vitro medicamentafgifte, werd de gerichte NP uitgebreid gekarakteriseerd. In vitro targeterend vermogen wordt gekarakteriseerd door celopname van HepG2 hepatoma cellen. De biodistributie en de synergistische therapeutische effect van hGC33-SFB-NP op HCC werden geëvalueerd door te vergelijken met sorafenib en SFB-NP. Onze resultaten toonden aan dat hGC33-SFB-NP GPC3+ HCC kan targeten. Het kan celcyclusvoortgang, celproliferatie en tumorinvasie remmen door Wnt en Ras/Raf/MAPK signaalpaden te remmen en synergistisch de progressie van leverkanker te remmen.

Materialen en Methodes

Materialen

De hGC33 antistof, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), 4′,6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride (DAPI), 5,5′,6,6′-tetrachloor-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1), en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen van Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride en N-hydroxysuccinimide werden verkregen van Qiyun Biotech (Guangzhou, China). De bicinchoninezuur (BCA) eiwitkwantificeringskit, coumarine-6, en de Annexin V-FITC/PI apoptose detectiekit werden gekocht van Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). PEG-b-PLGA-maleimide diblokcopolymere (mal-PEG-b-PLGA; 25.000–30.000 Da, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13–15%) werd gekocht van Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). PI3K antistofkit (9655#), p-Akt antistofkit (9916#), mTOR antistofkit (9964#), Bcl-2 familie antistofkit (9942#), apoptose antistofkit (9915#), en secundaire geit anti-konijn en anti-muis antilichamen werden gekocht van Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA); cycline B1 en cycline-afhanklijke kinase werden gekocht van Abcam Biological Technology (VS). Antilichamen tegen gefosforyleerd Rb, cycline D1, checkpoint kinase 1 (CHK1), P53, gefosforyleerd borstkankergevoeligheidsgen 1 (p-BRCA1), RAD51, cytochroom C, en matrixmetalloproteinase (MMP2 en MMP9) werden gekocht van Abcam (VS). Alle andere analytische graad chemicaliën, reagentia en oplosmiddelen zijn verkregen van standaard leveranciers en werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Cellen en Dieren

HCC-celijn HepG2 (verkregen van de Amerikaanse typecultuurverzameling (Manassas, VA, VS) werd gekweekt in DMEM-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) aangevuld met 10% FBS (HyClone, Logan, UT, VS) en 80 U/ml penicilline en 80 μg/ml streptomycine in een vervoegde atmosfeer van 5% CO₂ bij 37 °C. BALB/C naakte muizen, gewicht 20–22 g (5–6 weken) werden geleverd door Nanjing Junke Biotechnologie Co., Ltd. (China). BALB/C naakte muizen werden gevoed in een SPF-kamer. Alle dierzorg en behandeling werden uitgevoerd volgens de dierzorgvereisten van Anhui Universiteit van Wetenschap en Technologie. Alle experimentele protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de dierproevenethische commissie van Anhui Universiteit van Wetenschap en Technologie (Goedkeuringsnr.: 2019dw013).

Bereiding van NPs

Om NPs te bereiden, werden mal-PEG-b-PLGA en SFB of coumarine-6 afgewogen en opgelost in de organische fase (3:2 v/v dichloormethaan/aceton). De oplossing werd druppel voor druppel toegevoegd aan een polyvinylalcohol (PVA) oplossing (5% w/v) met continue vortexen. Het mengsel werd intervalgewijs gesonicered met een proofsonicator (uitgangsvermogen 550 W, 8 keer) op ijs om een olie-water-emulsie te creëren. De emulsie werd toegevoegd aan een PVA (1% w/v) oplossing met magnetisch roeren. SFB en coumarine-6 NPs werden verzameld door centrifugatie bij 8000 toer/min gedurende 30 min en driemaal gewassen in Milli-Q water.

Om hGC33-NP te genereren door thioetherbindingen gevormd door de reactie van maleimide met vrije sulfhydrylresten in antistof hGC33, werd hGC33 antistof gemengd met maleimide-gefunctionaliseerde NPs bij een molaire verhouding van 5:1 (hGC33: mal-PEG-b-PLGA) en geïnculeerd bij 4 °C gedurende 16 uur met continue roeren. hGC33 geconjugeerd aan de NPs door de reactie van sulfhydrylgroepen op de antistof hGC33 met de maleimidegroepen van de PEG-ketens. Ongeconjugeerde antilichamen werden verwijderd door doorlaat door Sepharose CL-4B kolommen. Efficiënte eiwitconjugatie werd bevestigd met een BCA-kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS).

Karakterisering van Nanodeeltjes (NPs)

Morfologie, Deeltjesgrootte, Insluitingsefficiëntie (EE), en Stabiliteit van NPs

De morfologie van NPs werd geëvalueerd met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan). Medicijn-vrije hGC33-NPs en medicijn-vrije NPs werden geregistreerd door FTIR-spectrofotometer (Thermo Nicolet, Madison, WI, VS) met kaliumbromide. De gemiddelde deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van NPs werden gekarakteriseerd met een Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) bij 20 °C. De medicament inpakkingsefficiëntie (EE) en medicament ladinginhoud (LC) efficiëntie werden beoordeeld door ultrafiltratie. Monsters werden geladen in een ultrafiltratieapparaat (100 kMWCO; Sartorius, Göttingen, Duitsland) en gecentrifugeerd bij 8000 toer/min gedurende 25 min bij 4 °C om vrij medicament te verwijderen. Hetzelfde volume van elk monster werd opgelost in acetonitrile om het totale hoeveelheid medicament te bevestigen. De concentratie werd gemeten door hoge-prestatie vloeistofchromatografie. De absorptiegolflengte was 266 nm. De volgende formule werd gebruikt om de medicament EE (%) van de NPs te berekenen: (gewicht van ingesloten medicament/totaal gewicht van medicament) × 100%. LC (%) werd berekend als (gewicht van geïnkapculeerd medicament/gewicht van NPs) × 100%. Om de stabiliteit van NPs bij kamertemperatuur te begrijpen, werd de verandering in NP-grootte geëvalueerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS) op vooraf bepaalde tijdstippen (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 uur, 16 uur, 20 uur en 24 uur) bij 25 °C.

In Vitro Medicamentafgifte en Celulair Opname Assay

Het medicament uit NPs werd onderzocht met dialysebuisjes met een moleculair gewicht afsnijpunt van 10 kDa. Kortom, 1 mL van NPs werd geladen in een dialysebuisje (MWCO 8.000–10.000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, VS). De dialysebuisjes werden ondergedompeld in PBS en geroerd met een magnetische roermotor bij 25 °C. De medicamentafgifteprofielen van NPs werden gemeten in 100 mL van 0,2 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH = 7,4) gedurende 7 dagen. De concentratie van medicament in de monsters werd gemeten met hoge-prestatie vloeistofchromatografie. In daaropvolgende studies werd hGC33-coumarine 6-NP met dezelfde deeltjesgrootte als hGC33-SFB-NP gebruikt om de targetering van hGC33-SFB-NP te evalueren. HepG2 (GPC3+), en Li-7 (GPC3−) werden geïnculeerd met hGC33-coumarine 6-NP gedurende 0,5, 2 of 4 uur bij 37 °C in 5% CO₂ respectievelijk. De geco-cultureerde cellen werden gewassen en vastgezet met 4% formaldehyde gedurende 10 min; de celkernen werden gekleurd met 5 μg/mL Hoechst 33.342 gedurende 15 min om intracellulaire NPs te lokaliseren. Confocale microscopie om intracellulaire nanodeeltjesafbeeldingen te analyseren werd geanalyseerd met confocale microscopie (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

In Vitro Cellulaire Effect

De cytotoxiciteit van vrij hGC33(Ab), vrij SFB, hGC33-null-NP, of hGC33-SFB-NP werd bepaald met een MTT-assay. HepG2(GPC3+) cellen en Li-7 (GPC3−) cellen in logaritmische fase werden gezaaid in een 96-putten plaat bij een dichtheid van 4000 cellen per put gevolgd door incubatie gedurende 48 uur bij 37 °C in 5% CO₂. De cellen werden behandeld met hGC33, vrij SFB, hGC33-null-NP, of hGC33-SFB-NP gedurende 48 uur bij 37 °C in 5% CO₂. Na co-cultivatie voor een bepaalde tijd, werd anti-celproliferatieactiviteit bepaald door MTT-assay zoals beschreven. De absorbantie van elk putje werd gemeten bij 490 nm en de helft van de maximale inhibitieconcentratie waarde (IC 50) berekend met SPSS 17.0.

Meting van Celinvasie Vermogen

Cellen in logaritmische groeifase werden gezaaid op 6-putten platen bij een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/put, gekrabbeld met een zuigkop, en vervangen door serumvrij kweekmedium. Wondheling werd vastgelegd bij 0 uur, 24 uur en 48 uur in de controle- en experimentele groep. Tegelijkertijd werd hetzelfde aantal cellen geïnculeerd in Transwell-kamers en behandeld met vrij hGC33, vrij SFB, hGC33-null-NP, of hGC33-SFB-NP. Vijfhonderd microliter 10% FBS medium werd toegevoegd aan de onderste kamer. Na incubatie gedurende 24 uur, werd de Transwell-kamer verwijderd, en cellen vastgezet met 4% paraformaldehyde, en gekleurd met 0,1% kristalvioleet. De grootte van wondheling en het aantal gemigreerde cellen werden berekend om het migratievermogen te evalueren.

Celcyclus Bepaling

Na overnachting incubatie in 6-putten platen, werden de cellen behandeld met vrij hGC33 (Ab), vrij SFB, hGC33-null-NP, of hGC33-SFB-NP gedurende 24 uur, daarna verzameld en vastgezet met ethanol. Na kleuring met propidiumiodide, werd flow cytometrie uitgevoerd, en de celcyclus geanalyseerd met modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).

Western Blotting

Om de activatiestatus van signaalweg en de expressie van doelmoleculen te evalueren, werden de cellen overnachting geïnculeerd in 6-putten platen, en vrij hGC33, vrij SFB, hGC33-null-NP, of hGC33-SFB-NP toegepast gedurende 24 uur. De cellen van elke behandelingsgroep werden verzameld, en eiwit geëxtraheerd en gemeten. De eiwitconcentratie werd gemeten en gekalibreerd met BCA-eiwitkit (Biosharp, Hefei, China). Eiwit van de monsters werd gescheiden door twaalf alkylsulfaat polyacrylamidgelektroforese, overgebracht op een PVDF-membraan, en afgedicht met vetvrije melk. Het eerste antilichaam (gedilueerd 1:1000) werd overnachting geïnculeerd bij 4 °C, en de tweede antilichamen (1:2000) werden 1 uur geïnculeerd bij kamertemperatuur. De banden werden gevisualiseerd met ECL-substraten (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, VS), en de beelden werden weergegeven door gel-beeldanalysesysteem, en β-actine werd gebruikt als controle.

In Vivo Anti-Tumor Activiteit

De remming van vrij hGC33, vrij SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, en hGC33-SFB-NP op de groei van HCC in vivo werd bepaald. Volgens voorschriften en richtlijnen over diergezondheid van de ethische commissie van Anhui Universiteit van Technologie, werden alle experimenten uitgevoerd in BALB/c muizen in kooien in een temperatuurgecontroleerde kamer (23 ± 2 °C) met 12 uur/12 uur licht/donker cyclus. Een 50-μl suspensie met 5 × 10⁶ levende HepG2 cellen werd subcutaneus geïnjecteerd in de rechter buik van 5-weken oude vrouwtjes BALB/c muizen (20–22 g). Toen het tumort volume ongeveer 50 mm³ bereikte, werden de muizen willekeurig verdeeld in 6 groepen (10 muizen in elke groep). Normale zoutoplossing controle NS (200 mg/kg null NP in 200 μL PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP in 200 μL PBS, equivalent aan hgc33 = 100 μg/kg/keer), vrij hGC33 (hGC33 in 200 μL PBS, 100 μg/kg/keer), vrij SFB (SFB dosis: 8 mg/kg/keer), SFB-NP (SFB dosis: 8 mg/kg/keer), en hGC33-SFB-NP (equivalent aan SFB = 8 mg/kg/keer, hGC33 = 100 μg/kg/keer) werden via staartvijn geïnjecteerd elke 2 dagen voor 10 keer. Het gewicht en de tumoromvang van de muizen werden elke vier dagen gemeten. De berekeningsformule van het tumort volume was volume = 0,5 × L × W², waar L en W de lengte en breedte van de tumor respectievelijk voorstellen. Vier weken na administratie werden de dieren verdoofd met diethylether, en de tumoromvang en gewicht gemeten. Daarnaast werden tumor, hart, lever, nieren, longen en milt verwijderd, vastgezet met 4% paraformaldehyde oplossing, in paraffin inbed, gesneden, en gekleurd met hematoxyline en eosin om de histologische veranderingen te evalueren door digitale microscopie.

Statistische Analyse

Data worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en geëvalueerd door variantieanalyse met SPSS 18.0. Paargewijze statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met een tweezijdige Student's t-toets. Verschillen werden beschouwd als statistisch significant voor P < 0,05.

Resultaten

Karakterisering van NPs en Medicamentafgifte In Vitro

Omdat de diameter en oppervlakte-eigenschappen van NP de celopname, medicamentafgifte en NP-distributie in vivo beïnvloeden, karakteriseerden we de bereide NP met corresponderende parameters. De morfologie, deeltjesgrootte en deeltjesgrootteverdeling van SFB-NP, hGC33-null-NP, en hGC33-SFB-NP polymeren zijn samengevat in Fig. 1. De morfologie van hGC33-SFB-NP waargenomen door transmissie-elektronenmicroscoop (Fig. 1a) toont starre kernen met vervaagde randen, wat aangeeft dat hGC33 aanwezig is op het oppervlak van NPs. De deeltjesgroottes van SFB NP, hGC33-null-NP, en hGC33-SFB-NP varieerden van 100 tot 150 nm en hadden typische unimodale deeltjesgrootteverdeling. De gemiddelde diameter van hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) was iets groter dan die van hGC33-null-NP, SFB-NP, en null NP (Fig. 1a, Tabel 1). Dunne spherische onduidelijke films met een enkel oppervlak waren aanwezig op het oppervlak van hGC33-SFB-NP en hGC33-null-NP, wat aangeeft dat antistof hGC33 aanwezig was op het oppervlak van NPs. De verhoogde grootte voor hGC33-SFB-NP en hGC33-null-NP bevestigde het bestaan van hGC33-film. De synthese van hGC33-SFB-NP werd bevestigd met ¹H-NMR (Fig. 1b) vóór NP-bereiding. De pieken bij 5,2 ppm en 1,58 ppm werden toegewezen aan -CH₃ protonen van melkzuur; de piek bij 4,8 ppm werd toegewezen aan -OCH₂- van glycolzuur; en de piek bij 3,6–3,8 ppm werd toegewezen aan de -CH₂CH₂O- protonen van PEG herhaaldeenheden. Oppervlaktechemie van PEG-b-PLGA en Ab-PEG-b-PLGA NPs werd ook bestudeerd door FTIR-spectroscopie (Fig. 2c). In het spectrum van PEG-b-PLGA polymere, een sterke band bij ongeveer 1750 cm⁻¹ afkomstig van de strekking van de carbonylgroepen (C=O) in de PLGA-keten. Een band bij 2880 cm⁻¹ was te wijten aan strekking van een –CH groep in de PEG-keten. Tegelijkertijd verscheen een piek bij 2520 cm⁻¹ die we toeschreven aan de -SH strekkingspiek van de hGC33 antistof. De ¹H NMR en FTIR resultaten gaven aan dat antistof gegraft was op de ruggengraat van de PEG-b-PLGA polymeren.

Interessant genoeg, hGC33-SFB-NP en SFB-NP nanodeeltjes in DMEM-medium met 10% FBS (pH = 7,4) hadden snelle medicamentafgifte tot ongeveer 4 dagen, daarna relatief langzame en stabiele medicamentafgifte; de cumulatieve SFB-afgifte van hGC33-SFB-NP en SFB-NP over 20 dagen was respectievelijk ongeveer 77% en 65% (Fig. 1d). Het verschil kan te wijten zijn aan het hydrofiele molecuul op het oppervlak van de PEG-b-PLGA matrix, wat de afbraak van de nanodeeltjes kan versnellen door de hydratatie te verhogen en daarbij hydrolyse te bevorderen. Om de stabiliteit van de bereide NPs te bepalen, werden hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP, en SFB-NP geplaatst in DMEM-medium met 10% FBS (pH = 7,4) en in PBS (pH = 7,4). De groottes van de verschillende NPs bleven stabiel gedurende meer dan 2 weken. SFB werd vrijgemaakt uit hGC33-SFB-NP op een continue en stabiele manier gedurende 14 dagen, maar er was een bescheiden verandering in de grootte van de deeltjes in DMEM-medium vergeleken met die in 10% FBS (Fig. 1e, f). Stabiliteit van hGC33-SFB-NP zou passend zijn voor SFB met een duurzame biologische rol.

Grote zeta-potentiaal kan sterke electrostatische afstotende interactie tussen NP veroorzaken en de stabiliteit van het NP-dispersiesysteem handhaven. Zoals getoond in Tabel 1, zijn de zeta-potentialen van hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, en SFB-NP respectievelijk −18,2 ± 2,2 mV, −18,5 ± 1,8 mV, en −15,9 ± 2,1 mV, wat kan worden veroorzaakt door de negatieve lading gegenereerd door de aldehydegroep, carboxylgroep, en fosfaatgroep in de hGC33 antistof glycoproteïne. De negatief geladen NPs kunnen leiden tot hoge stabiliteit van NP-suspensie. Bovendien, omdat het oppervlak van cellen negatief geladen is in normale fysiologische omstandigheden, stoten de bereide NPs cellen met lage lading af en zijn minder giftig voor weefsels en cellen. Daarnaast was de grootteverdeling van null-NP en SFB-NP (polyverspreidingsindex [PDI] 0,18 en 0,19 respectievelijk) licht maar niet significant kleiner dan die van hGC33-null-NP (PDI = 0,21) en hGC33-SFB-NP (PDI = 0,23). Dus de grootte van de nanodeeltjes heeft goede uniformiteit. De deeltjesgrootte, deeltjesgrootteverdeling, en zeta-potentiaal van NP worden weergegeven in Tabel 1 volgens de resultaten van SFB inkapselings-efficiëntie en ladinginhoud. De ongeconjugeerde GPC3 antistof hGC33 werd verwijderd door ultracentrifugatie, en de bindingsefficiëntie van hGC33 antistof aan NPs werd geëvalueerd. BCA-eiwitanalyse toonde aan dat de bindingsefficiëntie van hGC33 antistof aan NPs 79,5% ± 2,9% was.

hGC33-Coumarine 6-NP Target Effectief GPC3+ HCC Celijnen HepG2

Om te ontdekken of de hGC33 antistof van nanodeeltjes nog steeds de capaciteit heeft om specifiek GPC3 te targeten, gebruikten we GPC3+ HepG2 en GPC3− Li-7 cellen als doelcellen en hGC33-coumarine 6-NP als tracer nanodeeltjes, en incuberden de verschillende cellen gedurende 2 uur, 4 uur en 8 uur. De cellen werden 3 keer met PBS gewassen en gereageerd met DAPI om de kern te kleuren. De cellen werden vastgezet en gefotografeerd met Leica fluorescentiemicroscoop (DMi8, Duitsland). Het werd gevonden dat de groene fluorescentie in HepG2 cellen significant hoger was dan die in Li-7 cellen bij dezelfde incubatietijd (Fig. 2), wat aangeeft dat de hoeveelheid hGC33-coumarine 6-NP die binnenkwam in HepG2 cellen significant hoger was dan in Li-7 cellen. De resultaten gedocumenteerden dat de hGC33 antistof op hGC33-Coumarine6-NP nog steeds de capaciteit had om GPC3 te targeten en de internalisatie van nanodeeltjes te mediëren. De expressie van GPC3 in HepG2 cellen en Li-7 cellen werd onderzocht met indirecte fluorescentie en cytochemische kleuring. De resultaten toonden aan dat HepG2 cellen GPC3 overexprimeerden, terwijl Li-7 cellen GPC3 niet exprimeerden (Fig. 2).

hGC33-Null-NP Remt Prolifering van HepG2 Cellen

Om te bepalen of hGC33-gemodificeerde NP (hGC33-null-NP) de groei van HCC kon remmen, maatten we de celgroei-inhibitie van GPC3-positieve HCC-celijn HepG2 en GPC3-negatieve cellijn Li-7. We vonden dat zowel hGC33-null-NP als hGC33 de groei van de GPC3-positieve HCC-celijn HepG2 na 24 uur behandeling remden, maar hGC33 had een significantere inhibitieve effect op HepG2 cellen dan hGC33-null-NP (Fig. 3a); in tegenstelling, hGC33-null-NP en hGC33 beïnvloedden de groei van de GPC3-negatieve Li-7 cellijn niet (Fig. 3b). De representatieve tijdsloop van hGC33-null-NP (equivalent aan 0,1 μM hgc33) en hGC33 (0,1 μM) op HepG2 celproliferatie is geïllustreerd in Fig. 3c. Omdat hGC33 een C-terminaal peptide is dat GPC3 herkent, is hGC33 superieur aan hGC33-null-NP in het remmen van HepG2. De resultaten suggereren dat het hGC33 molecuul in hGC33-null-NP een ruimtelijke blokkade-effect kan hebben, wat de bindingscapaciteit van hGC33 aan epitopen kan beïnvloeden.

hGC33-Null-NP Remt Celcyclus van HepG2 Cellen

Om het mechanisme van de moleculaire activiteit van hGC33 antistof gemodificeerd op hGC33-null-NP nanodeeltjes te begrijpen, bestudeerden we de celcyclusvoortgang van HepG2 behandeld met hGC33-null-NP. In de HepG2-celijn verhoogden hGC33-null-NP en hGC33 significant de fractie cellen in G1 (Fig. 4a, b), wat aangeeft dat zowel hGC33-null-NP als hGC33 celcyclusarrest in G1-fase konden induceren. Bovendien konden hGC33-null-NP en hGC33 cycline D1 expressie in HepG2 cellen significant down-reguleren (Fig. 4c, d).

Wnt Activering in HepG2, Huh-7 en Li-7 Cellen

Om de activatie van de klassieke Wnt/β-Catenine signaal in HCC-cellen te begrijpen, detecteerden we eerst de expressie van Wnt-ligand en receptor krulproteïne (frizzled, FZD of Frz) in diverse HCC-cellijnen: HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC+), en Li-7 (GPC3−). De resultaten toonden aan dat Wnt3a en FZD-receptor van de β-Catenine-weg geëxprimeerd waren in alle cellijnen, met name in HepG2 en Huh-7 cellen (Fig. 5).

hGC33-Null-NP Remt Wnt Signaaltransductie-afhankelijke Celproliferatie Geïnduceerd door Wnt3a

Sommige studies hebben getoond dat het extracellulaire deel van GPC3 een co-receptor van Wnt kan zijn, wat Wnt/β-Catenine signaalactivering en -transductie bevordert. Daarom, toen HepG2 (GPC3+), Huh-7 (GPC3+), en Li-7 (GPC3−) cellen geco-incubeerd werden met hGC33 en hGC33-null-NP, werd de activatie van Wnt/β-catenine signaal geblokkeerd door hGC33 en hGC33-null-NP, en proliferatie van HepG2 en Huh-7, maar niet Li-7, in Wnt3a-geconditioneerd medium geremd. Dat proliferatie van Li-7 cellen waarschijnlijk te wijten is aan de afwezigheid van GPC3 op het oppervlak van Li-7 cellen (Fig. 6). Onze resultaten geven aan dat hGC33 en hGC33-null-NP nanodeeltjes specifiek binden aan GPC3 moleculen op celmembraan. hGC33 en hGC33-null-NP neutraliseren de mitogene activiteit van Wnt3a deels en remmen de Wnt/β-catenine signaleringsweg. Echter, de inhibitie van proliferatie door hGC33-null-NP nanodeeltjes was minder dan die van hGC33. Misschien de ruimtelijke structuur van de nanodeeltjes interfereren met hGC33-null-NP en beperken de functie van het hGC33 molecuul op de nanodeeltjes zodat ze de interactie tussen GPC3 en Wnt3a niet volledig kunnen blokkeren.

hGC33-Null-NP Remt Wnt3a-geïnduceerde Signaaltransductie in HepG2 en Huh-7 Cellen

Om het effect van hGC33-null-NP op Wnt/β-catenine signalering in HCC-cellen te begrijpen, extraheerden we de eiwitten van HepG2 en Huh-7 cellen behandeld met hGC33 of hGC33-null-NP. De resultaten van western blot toonden aan dat na hGC33-null-NP behandeling, de niveaus van pYAP en pβ-catenine verhoogd waren, maar de niveaus van YAP en β-catenine verminderd waren. Verder waren de niveaus van cycline D1, CD44, VEGF, en c-MYC in de hGC33-null-NP groep lager dan die in de controle groep, maar het niveau was minder dan met hGC33 behandeling. Vergelijkbare effecten werden waargenomen in HepG2 en Huh-7 cellen, zoals getoond in Fig. 7.

hGC33-SFB-NP of hGC33 Atenueert HCC Celmigratie door Remming van Epitheel-Mesenchymale Transitie (EMT)

HCC is een van de dodelijkste kankers ter wereld, en de incidentie neemt stapsgewijs toe. Sorafenib is de enige goedgekeurde standaardbehandeling voor patiënten met gevorderd HCC, omdat het is aangetoond dat het de overlevingscijfer van deze patiënten verbetert. Echter, klinische en preklinische observaties suggereren dat sorafenib-therapie beperkte effectiviteit heeft door de snelle ontwikkeling van medicamentenresistentie. Daarom is het verduidelijken van het mechanisme van ontsnapping aan sorafenib-resistentie een belangrijke nadruk in HCC-onderzoek. In de laatste jaren is steeds meer aandacht gegaan naar de rol van epitheel-mesenchymale transitie (EMT) in de progressie van HCC en de ontwikkeling van medicamentenresistentie. EMT verwijst naar de transformatie van epithele naar mesenchymale cellen, wat cellen de capaciteit geeft om te metastaseren en te invaderen, inclusief verwerving van stamcelkenmerken, vermindering van apoptose en veroudering, bevordering van immuunonderdrukking, en deelname aan het ontstaan en de ontwikkeling van kanker. Het verlies van E-caderine expressie wordt beschouwd als een cruciale stap in de carcinogenese en EMT. EMT is een ontwikkelings- meervoudig moleculaire en cellulaire herprogrammeringsproces dat kankercellen gebruiken om agressie te bereiken. Dit is voornamelijk door down-regulatie van de expressie van E-caderine, keratine, mucine, ZO-1 (tight junction proteïne); up-regulatie van de expressie van vimentine, alpha-smooth muscle actine (α-SMA), FN fibronectine, MMPs (afbraakmatrix), N-caderine, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collageen, en type II collageen om de invasie, metastase en anti-apoptose van EMT-karakteristieke tumoren te bereiken. De veranderingen van deze proteïnexpressies betrekken voornamelijk de activatie van Wnt/β-catenine en Ras/Raf/MAPK signaleringspaden.

Onze experimenten hebben getoond dat hGC33 antistof op het oppervlak van NP-vector Wnt3a-geïnduceerde β-catenine signaaltransductie kan remmen, en daarna de expressie van β-catenine, CD44, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), cycline D1, en c-MYC down-reguleren. Verder remt hGC33-SFB-NP de activatie van Ras/Raf/MAPK signaalweg en remt proliferatie en apoptose van HCC-cellen. hGC33 en SFB hebben een synergistisch effect, EMT remmend en de migratie van HCC-cellen verminderend (Fig. 8).

hGC33-SFB-NP Remt de Groei van Hepatocellulaire Carcinoma In Vivo en Verbeterd de Overleving van Tumor-dragende Muizen

Om de antitumoractiviteit van hGC33-SFB-NP in vivo te evalueren, werden HepG2 en Huh-7 cellen subcutaneus geïnculeerd in de rechter buik en dorsale zijde van vrouwtjes BALB/c naakte muizen respectievelijk. Toen de xenograft-tumor groei ongeveer 30 mm³ bereikte, werden de muizen willekeurig verdeeld in groepen om de inhibitie van elke groep (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, vrij hGC33, vrij SFB, en controle groep) HCC-effect te evalueren (n = 5 per groep). Uit Fig. 9a, b is te zien dat hGC33-SFB-NP de tumorgroei in muizen significant vertraagde vergeleken met de PBS-controle en andere behandelingen. Vergeleken met de PBS-controle, hadden hGC33-null-NP, SFB-NP, vrij hGC33, en vrij SFB ook enige inhibitie van HCC, wat komt doordat vrij hGC33 en vrij SFB direct Wnt-signaal en Ras/Raf/MAPK respectievelijk remmen. Dergelijke paden kunnen de proliferatie van HCC-cellen tot op zekere hoogte remmen. Hoewel de nanodeeltje-gemodificeerde hGC33 (hGC33-null-NP) verbonden is met het nano-oppervlak door chemische bindingen, beïnvloedde dit niet hGC33's targetering van GPC3 moleculen en inhibitie van Wnt-activiteit. Nanodeeltje-geladen SFB (SFB-NP), na endocytose door cellen, werd afgebroken om SFB vrij te maken van de copolymere om de groei van HCC te remmen. In alles was het inhibitieve effect van hGC33-SFB-NP op HepG2-cel-xenografts, zoals verwacht, meer dan op Huh-7-cel-xenografts, waarschijnlijk omdat HepG2 GPC3 moleculen exprimeert.

Het lichaamsgewicht van naakte muizen in elke behandelingsgroep werd ook gemeten, zoals getoond in Fig. 9c, d. Het lichaamsgewicht van de controlegroep nam geleidelijk af. Het gewicht van muizen in vrij hGC33, vrij SFB, SFB-NP, en hGC33-null-NP behandelingsgroepen nam ook progressief af en niet significant minder dan in de controlegroep. Echter, het gewicht van naakte muizen met HepG2 en Huh-7 behandeld met hGC33-SFB-NP nam slechts licht af, en het gewicht bleef relatief stabiel gedurende de behandelingscyclus. Deze resultaten ondersteunen dat de nieuwe hGC33-SFB-NP nanomedicijn geen significante toxiciteit heeft in naakte muizen, en het SFB geladen op de nanodrager en de oppervlakte-gemodificeerde hGC33 kunnen additieve of zelfs synergistische antitumor-effecten produceren.

Discussie

Om de geschiktheid van hGC33-SFB-NP voor gerichte HCC-therapie te onderzoeken, testten we de modelconjugaten op hun vermogen om te binden aan humaan glypicaan-3 op HCC-cellen in vitro; om glypicaan-3-positieve HCC-celproliferatie, migratie, en Wnt/β-catenine signaaltransductie te remmen; en HCC die glypicaan-3 overexprimeert in vivo te remmen.

Om GPC3-specifieke antistof hGC33 covalente te binden aan mal-PEG-b-PLGA nanodeeltjes, kruisten we de vrije sulfhydrylgroep in het Fc-segment van hGC33 met maleimide-gefunctionaliseerde PEG-b-PLGA (mal-PEG-b-PLGA) door stabiele thioetherbindingen te vormen. Conjugatie is een voorwaarde voor targetering van GPC3-positieve HCC. Een reeks experimenten, inclusief de veranderingen van nanodeeltjesdiameter en zeta-potentiaal gedetecteerd door lens en de intracellulaire opname van hGC33-SFB-NP, verifieerden de targetering van hGC33-SFB-NP naar HepG2 (GPC3+) cellen. Deze resultaten gaven aan dat de bindingsactiviteit van antistof hGC33 niet gewijzigd was door de conjugatie.

We detecteerden direct de fagocytose-effect van GPC3+ HepG2 en GPC3− Li-7 cellen op PEG-b-PLGA NP oppervlakte-gemodificeerde hGC33 door confocale microscopie. Na co-cultuur van HepG2 en Li-7 cellen met hGC33-coumarine 6-NP, was de groene signaalintensiteit in HepG2 cellen significant hoger dan in Li-7 cellen, wat aangeeft dat er meer nanodeeltjes in de HepG2 cellen waren. Deze bevinding is consistent met de hGC33 antistof gemodificeerd op het oppervlak van PEG-b-PLGA NP specifiek bindend aan glypicaan-3 op het oppervlak van HCC-cellen en geïternaliseerd. De efficiëntie van hGC33-gemodificeerde NP internalisatie hangt af van het expressieniveau van GPC3-antigeen op het celoppervlak.

We gebruikten de standaard MTT-assay om de efficiëntie van het remmen van de proliferatie van hepatomacellen te meten. Zowel hGC33-null-NP als hGC33 remden de groei van de GPC3-positieve HCC-celijn HepG2, maar hGC33-null-NP en hGC33 beïnvloedden de proliferatie van GPC3-negatieve Li-7 cellen niet (Fig. 3b). Op dierniveau remden hGC33-null-NP of hGC33 alleen de groei van Huh-7 en HepG2-xenografts tot op zekere hoogte, terwijl hGC33-SFB-NP groeistilstand van Huh-7 en HepG2-hepatoma-xenografts in muizen veroorzaakte. De bevinding dat hGC33-null-NP significant GPC3-positieve hepatomacellen remde, toonde aan dat het inhibitieve effect van PEG-b-PLGA NP oppervlakte-gemodificeerde hGC33 op HCC-celproliferatie afhangt van de expressie van GPC3-antigeen op het celoppervlak.

GPC3 reguleert veel paden in HCC-pathogenese, inclusief Wnt en YAP signalering. GPC3 interageert met Wnt-ligand en kan een co-receptor voor Wnt zijn en Wnt/Frizzled binding voor HCC-groei faciliteren. We onderzochten verder het effect van nanomedicijn oppervlakte-gemodificeerde hGC33 op Wnt-signaleringsweg in hepatomacellen. Net als vrij hGC33, remde nanomedicijn oppervlakte-gemodificeerde hGC33 de proliferatie van hepatomacellen niet alleen door Wnt-geïnduceerde signaaltransductie in HepG2 en Huh-7 cellen die GPC3 exprimeren te blokkeren, maar ook door Wnt3a-geïnduceerde β-catenine en YAP signaaltransductie te remmen. Eerdere studies hebben getoond dat YAP-expressie gereguleerd wordt door β-catenine op transcriptieniveau van HCC. In deze studie remden vrij hGC33 en nanomedicijn oppervlakte-gemodificeerde hGC33 Wnt3a-geïnduceerde YAP-activiteit, wat aangeeft dat Yap/TAZ vrijgemaakt van β-catenine-complex ook klassieke Wnt-signaaltransductie kan initieren. Deze resultaten geven aan dat typische Wnt en YAP crosstalk via diverse mechanismen. Vergeleken met hGC33-null-NP en hGC33, had hGC33-SFB-NP sterkere anti-proliferatie en anti-migratie capaciteit in vitro en in vivo. Dus hGC33 bepaalt niet alleen de specificiteit van HCC-cellen, maar verhoogt ook het inhibitieve effect van SFB op de proliferatie en migratie van HCC-cellen door sleutelsignalen gerelateerd aan tumorgroei te blokkeren, zoals Wnt/β-catenine en Wnt/YAP signaleringsweg.

Conclusie

Antistof hGC33 tegen glypicaan-3, een membraaneiwit dat overexprimeerd is op hepatocellulaire carcinoom cellen, verhoogde de binding van sorafenib-geladen polyetheenglycool-b-PLGA polymere nanodeeltjes (hGC33-SFB-NP) aan glypicaan-3 op de kankercellen. Administratie van de antistof-gemodificeerde nanodeeltjes remde synergistisch Wnt-geïnduceerde signaaltransductie en Ras/Raf/MAPK signaleringsweg; hepatocellulaire carcinoom cellen werden gearresteerd in G0/1-fase door down-regulatie van cycline D1 expressie, wat kankercelmigratie atenueerde door epitheel-mesenchymale transitie te remmen. hGC33-SFB-NP remde de groei van leverkanker in vivo en verbeterde de overlevingscijfer van tumor-dragende muizen.