Gerichte doxorubiccine-afgifte met anti-EpCAM aptamer-gefunctionaliseerde liposomen: Effectiviteit in C26 darmcarcinoommodellen

Samenvatting

In deze studie hebben we PEGyleerde nanoliposomale doxorubiccine (DOX) oppervlakte-gefunctionaliseerd met een anti-EpCAM (epitheiale celadhesiemolecuul) aptamer via post-insertie van anti-EpCAM aptamer-geconjugeerd DSPE-mPEG₂₀₀₀ in Caelyx® (ED-lip). De grootte, lading, vrijgiftprofiel, cytotoxiciteit en celulair opname van de formulering werden bepaald. De karakterisatie van de ED-lip toonde een lichte toename in grootte en PDI samen met een afname in zetapotentiaal, wat op efficiënte post-insertie wijst. Stromcytometrie en fluorescente microscopie lieten zien dat ED-lip de opname in C26-cellen verhoogde ten opzichte van Caelyx®. ED-lip vertoonde ook een hogere cytotoxiciteit, wat de effectiviteit van de anti-EpCAM aptamer als targeteringsligand bevestigt. Farmacokinetische en weefselbiodistributie-onderzoeken in muizen met C26-tumoren toonden aan dat ED-lip het distributieprofiel van DOX niet beïnvloedde ten opzichte van Caelyx®. Daarnaast verbeterde ED-lip de tumoraccumulatie van DOX en verlengde de overleving van de dieren. Deze resultaten suggereren dat de functionalisatie van Caelyx® met anti-EpCAM aptamer veelbelovend is voor kankerbehandeling en verdere onderzoek rechtvaardigt.

Inleiding

Nanofarmac afleveringssystemen (NDDSs) van 100–200 nm accumuleren passief in de tumormicro-omgeving via het verhoogde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR). Dit gebeurt door de losse endotheellijsting en zwakke lymfatische drainage. Recente gegevens tonen echter aan dat minder dan 1% van het toegediende medicament de tumor bereikt. Onvermogen om de dichte extracellulaire matrix (ECM) te penetreren, terugkeer van vrijgekomen medicament naar de circulatie en tumorheterogeniteit zijn verantwoordelijk voor deze tekortkoming. Verschillende strategieën zijn gebruikt om de tumoraccumulatie van NDDSs te verbeteren met endogene en exogene stimuli. Deze systemen kunnen reageren op exogene stimuli zoals licht en kunnen gebruikt worden voor tumorimaging. Er zijn veel anorganische nanomaterialen met anticancereigenschappen, maar hun toxiciteit en milieuveiligheid vereisen aandacht.

Actieve gerichte aflevering is een belangrijke benadering die NDDSs helpt therapeutische agenten efficiënter aan tumoren af te leveren en blootstelling aan niet-doelweefsels te minimaliseren. Een ideaal targeteringsagent heeft affiniteit voor celdoppervlakte-eiwitten of receptoren die verhoogd zijn in specifieke cellen of weefselcomponenten.

Het epitheiale celadhesiemolecuul (EpCAM) is een transmembraan-glycoproteïne dat beschouwd wordt als kandidaat-ligand voor actieve targetering. Recente bevindingen tonen aan dat EpCAM een lage normale expressie heeft in gezonde epitheiale cellen, terwijl in kankercellen de expressie tot 1000-voudig verhoogd kan zijn. Tijdens kankerontwikkeling verandert het expressiepatroon van EpCAM van basaal en basolateraal in normaal epitheelen naar apicaal in tumorepitheele cellen. Differentiele expressie maakt EpCAM een interessante ligand voor medicijnafgifte die de therapeutische index kan verbeteren.

EpCAM wordt aangetoond als kankerstamcel (CSC) of tumorinitiërcel (TIC) marker, waarvan overexpressie in kanker gecorreleerd is met slechte prognose. CSC's of TIC's hebben zelfvernieuwing en produceren meer cellen van hetzelfde type, met sleutelrollen in tumorontwikkeling en metastasering. Overexpressie van EpCAM is gerapporteerd in CSC's van diverse soliede tumoren. Recentelijk hebben aptamers veel aandacht getrokken als potentieel krachtige moleculen voor gebruik als targeteringsliganden in NDDSs. Aptamers zijn DNA- of RNA-gebaseerde oligonucleotidesequenties met secundaire en tertiaire structuren die affiniteit hebben voor doelen zoals celdoppervlakte-receptoren. Ze hebben voordelen over antilichamen: ze zijn niet-immunogeen, hebben laag molecuulgewicht (8–25 kDa) met chemische en thermische stabiliteit, en hun synthese en chemische modificaties zijn goedkoop en schaalbaar. Selectieve targeting via anti-EpCAM-specifieke aptamers kan een effectieve optie zijn om chemotherapeutica in de tumormicro-omgeving af te leveren. Verschillende studies tonen aan dat anti-EpCAM aptamer-gefunctionaliseerde nanodragers de aflevering van anticancermedicijnen aan tumorcellen effectief verbeteren.

Het doel van deze studie is de ontwikkeling van een anti-EpCAM DNA-aptamer (SYL3C)-PEGyleerde nanoliposomen geladen met doxorubiccine (DOX) (ED-lip) als model van NDDS. Deze functionalisatie werd uitgevoerd via EDC/NHS-koppelingschemie tussen de aminegroep van de aptamer en de carboxylgroep van DSPE-mPEG₂₀₀₀, welke post-geïnsereerd werd in de liposoom. De ED-lip werd gekarakteriseerd voor grootte, zetapotentiaal, percentage DOX-encapsulatie, vrijgiftprofiel en cytotoxiciteit. Vervolgens evalueerden we of deze ED-lip de celopname in vitro kon verbeteren en DOX via targeting aan de tumor kon afleveren in muizen met C26 darmcarcinoomtumorren.

Resultaten en Discussie

Conjugatie van DSPE-mPEG₂₀₀₀ aan Aptamer

In deze studie werd EDC/NHS-koppelingschemie gebruikt voor conjugatie van amine-gefunctionaliseerde anti-EpCAM aptamers aan de geactiveerde carboxylgroep van DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH. Het voordeel van deze koppelingsreactie is de stabiliteit van de gevormde amidebinding en het verminderen van aspecifieke interacties tussen aptamers. Aptamers kunnen gemodificeerd worden met primaire amine- of thiolgroepen en covalen gebonden worden aan geactiveerde carboxyl- of pyrrolegroepen van maleimide. Thiol-gemodificeerde aptamers werden geconjugeerd aan de maleimide-functionele groep van DSPE-PEG₂₀₀₀ en vervolgens post-geïnsereerd in de liposoomstructur om de buitenste oppervlakte te decoreren. Een belangrijke beperking van maleimide-thiolchemie is dat tijdens opslag de thiolgroep van aptamers door oxidatie kan worden beïnvloed, leidend tot disulfidebindingen (S-S) tussen twee thiol-gemodificeerde aptamers. Deze dimere aptamers kunnen niet deelnemen aan de conjugatiereactie. Daarom verhogen EDC/NHS-reacties de productopbrengst en verbeteren de post-insertiemethode.

Aptamers hebben voordelen ten opzichte van antilichamen, waaronder gemakkelijke synthese en opschaling, lage systemische toxiciteit en afwezigheid van immunogeniciteit. Hier werd na aptamerconjugatie aan het lipide de post-insertiemethode toegepast om anti-EpCAM aptamer-gedecoreerde Caelyx® (ED-lip) te maken. De post-insertietechniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het hechten van aptamers aan het oppervlak van liposomen en biedt een hogere incorporatiesnelheid van aptamers in liposomen.

We gebruikten een gel elektroforese mobiliteitsshift-assay voor evaluatie van post-insertie van anti-EpCAM aptamer op liposoom. Negatief geladen aptamers migreerden in het gel en hun banden waren zichtbaar, terwijl er geen tegenhangerband was voor de ED-lip formulering, omdat ED-lip in de put vastzat en niet door het gel kon bewegen. Deze resultaten bevestigden dat aptamer-geconjugeerde micellen met succes post-geïnsereerd waren in het oppervlak van liposomen.

Fysicochemische Karakterisatie van ED-lip

De fysicochemische karakterisatie van Caelyx® en ED-lip is weergegeven in Tabel 1. De grootte en lading van de bereide formuleringen toonden aan dat modificatie van Caelyx® met anti-EpCAM aptamer geen significant effect had op de deeltjesgrootte (p > 0,05). De liposoomgrootte voor insertie van aptamer (Caelyx®) was ongeveer 96 nm met PDI van 0,11; na post-insertie (ED-lip) nam de grootte deels toe tot 117 nm met PDI van 0,14, een gewenste grootte voor tumorafgifte. Eerdere studies toonden ook aan dat incorporatie van targeteringsliganden leidt tot toename in grootte en PDI van liposomen. Het zetapotentiaal van ED-lip (−19,25) werd negatiever dan Caelyx® (−12). RNA-aptamerconjugatie in liposoom resulteerde in afname van zetapotentiaal. De toename in grootte en negatieve zetapotentiaal van ED-lip zijn bewijs voor succesvolle post-insertie van geconjugeerde aptamers op het liposoomoppervlak. Deze resultaten zijn consistent met eerdere studies die lichte toename in deeltjesgrootte en negatiever zetapotentiaal in aptamer-gefunctionaliseerde Caelyx® lieten zien. De efficiëntie van post-insertie zou getest moeten worden qua incubatietijd en temperatuur voor efficiëntere post-geïnsereerde liposomen met betere grootte en PDI. De encapsulatie-efficiëntie van Caelyx® en ED-lip was 100%.

Het aantal aptamers post-geïnsereerd aan het liposoomoppervlak werd bepaald. De totale fosfolipideinhoud was 14 mM. Gezien het gemiddelde aantal lipidemoleculen in een liposoom van 100 nm is 8×10⁴, is het aantal liposomen per milliliter bijna 10¹⁴. Het molecuulgewicht van de aptamer was g/mol. Het aantal DSPE-mPEG₂₀₀₀-aptamer werd bepaald via fosfaatassay. Op basis van deze gegevens is het aantal aptamermoleculen per ml aliqout oplossing 10¹⁵.

DOX Vrijgiftprofiel

De insertie van aptamer-geconjugeerde micellen aan het buitenoppervlak van Caelyx® kan het vrijgiftprofiel van DOX beïnvloeden. Daarom evalueerden we de vrijgifte van DOX uit ED-lip vergeleken met Caelyx® in 5% dextrose met 50% FBS, wat het vrijgedrag in plasma nabootst. Er was geen significant verschil in DOX-vrijgifte van Caelyx® en ED-lip formuleringen gedurende 24 uur en slechts verwaarloosbare hoeveelheden DOX werden vrijgegeven. Dit is consistent met eerdere studies die aantoonden dat insertie van aptamer aan het liposoomoppervlak de membraanstabiliteit en vrijgiftprofiel van DOX niet beïnvloedt. Dit is voornamelijk te danken aan de stabiliteit van de Caelyx®-formulering die geformuleerd werd met een pH-gradiënt-gedreven remote loading methode.

Celinteractie en Celopname door Fluorescente Microscopie

De celinteractie en celopname van liposomale formuleringen werden geëvalueerd bij 4 °C en 37 °C. De evaluatie van de targeteringseffectiviteit van ED-lip toonde aan dat er geen verschillen waren in de gemiddelde fluorescente intensiteiten (MFI's) van CHO-K1-cellen behandeld met Caelyx® en ED-lip bij 4 °C en 37 °C. De data lieten echter zien dat gerichte ED-lip aanzienlijk hogere opname had door C26-cellen vergeleken met Caelyx® bij 4 °C en 37 °C, wat statistisch significant was bij 37 °C (p < 0,0001). ED-lip had significant hogere opname in vergelijking met Caelyx® (p < 0,001). Deze resultaten wijzen erop dat ED-lip de targetspecificiteit verbetert omdat anti-EpCAM aptamer meer affiniteit heeft voor C26-cellen in vergelijking met CHO-K1-cellen. Vrije DOX passeert vrijelijk de lipide dubbellaag en treedt de cel binnen, dus heeft de hoogste celopname en cytotoxiciteit. Bij Caelyx® beperkt PEGylatie de endocytosesnelheid en resulteert in verminderde cytotoxiciteit. De aanwezigheid van anti-EpCAM aptamer op het liposoomoppervlak (ED-lip) verhoogt de internalisatiesnelheid van de formulering in de cellen en verhoogt de cytotoxiciteit ten opzichte van Caelyx®. Fluorescente microscopiedata toonden aan dat het verschil in celulaire opname van ED-lip en vrije DOX in C26-cellen bij 37 °C niet significant was. Schaling op basis van geïternaliseerde DOX-intensiteit toonde echter aan dat zowel ED-lip als DOX statistisch significant verschillen vertoonden met Caelyx® in C26-celopname (p < 0,001). Hoewel C26-cellen een laag niveau van EpCAM op hun oppervlak expresseren, suggereerden de gegevens dat de aanwezigheid van anti-EpCAM aptamer de internalisatiesnelheid van liposomen kan verbeteren.

Cytotoxiciteitsstudie

De cytotoxiciteitseffecten van vrije DOX, Caelyx® en ED-lip formuleringen zijn weergegeven in Fig. 6. Verschillende concentraties formuleringen werden gebruikt om cellen 1, 3 en 6 uur te behandelen en daarna 72 uur te incuberen. Data toonden aan dat alle formuleringen effecten op cellen hadden op tijd- en dosisafhankelijke wijze. De levensvatbaarheid van C26-cellen behandeld met ED-lip daalde vergeleken met Caelyx®-behandelde cellen. Omdat CHO-K1-cellen, als EpCAM-negatieve cellen, lagere reactie op ED-lip vertoonden ten opzichte van C26-cellen, lijkt het erop dat anti-EpCAM aptamer de specifieke aflevering van Caelyx® aan doelcellen verhoogt. Deze resultaten bevestigen de specifieke celopname van ED-lip door C26-cellen. Deze resultaten benadrukken het belang van gerichte medicijnafgifte met specifieke targeteringsagenten voor selectieve aflevering aan doelcellen met vermindering van bijwerkingen door off-target effecten te voorkomen. Eerder werd gerapporteerd dat actieve targeting van Caelyx® met specifieke targeteringsliganden zoals aptamers en antilichamen leidt tot verhoogde actieve tumortargetering en specifieke medicijnafgifte aan doelcellen, wat de therapeutische effectiviteit van DOX verbetert.

Biodistributie en Farmacokinetiek

Om te evalueren hoe anti-EpCAM aptamer de biodistributie van DOX beïnvloedt, injecteerden we een dosis van 10 mg/kg ED-lip en Caelyx® in muizen met subcutane C26 darmkankertumorren. De DOX-concentratie in plasma op 3, 12, 24, 48 en 72 uur na injectie met Caelyx® en ED-lip is weergegeven in Fig. 7. De resultaten tonen aan dat het gedrag van plasma-DOX-concentraties in beide groepen vergelijkbaar was en geen significant verschil bestond. De conjugatie van anti-EpCAM aptamer aan het liposomale oppervlak verlaagde de circulatiehalveringstijd lichte van 39,3 uur tot 34,2 uur en MRT van 47,6 tot 42,9 uur. Farmacokinetische parameters gaven aan dat conjugatie van anti-EpCAM aptamer op het liposoom de t_½ en MRT licht verlaagde, consistent met eerdere rapporten die aantoonden dat conjugatie van aptamer op liposomale oppervlak de clearance van liposomen versnelt. Eiwitaadsorptie en consequentie verwijdering door het mononucleaire fagocytair systeem (MPS) kan de reden zijn voor de versnelde bloedclearance van ligand-geconjugeerde nanopartikelen.

De concentraties van DOX in belangrijke georganeerde organen in groepen die Caelyx® en ED-lip ontvingen werden vergeleken. Het belangrijkste bijwerkingsprofiel van vrije DOX is cardiotoxiciteit, wat Caelyx® significant vermindert. De biodistributie van ED-lip in lever, long en milt was significant hoger dan Caelyx® op tijdstip 3 uur. De aanwezigheid van lekkende bloedvaten en toename in grootte en PDI van ED-lip na post-insertie kunnen de redenen zijn voor meer accumulatie van ED-lip in deze weefsels op vroegere tijdstippen. Het is aangetoond dat toename in grootte van nanopartikelen tot 150 nm de accumulatie in lever, long en milt vergroot. De resultaten van de biodistributiestudie tonen duidelijk het EPR-mechanisme in de accumulatie van nanopartikelen in de tumor. Zowel ED-lip als Caelyx® accumuleren geleidelijk in de tumor en bereiken een maximum rond 12 uur, blijven een plateau tot 24 uur en nemen daarna af bij 48 en 72 uur. Interessant is dat op alle tijdstippen (3, 12, 24, 48, 72 uur) de accumulatie van ED-lip in de tumor significant hoger is dan Caelyx®, wat kan worden toegeschreven aan de effectiviteit van actieve targeting met anti-EpCAM aptamer. Deze resultaten wijzen erop dat hechten van aptamer aan liposoomoppervlak de DOX-distributie in de nieren niet beïnvloedt. Het lijkt erop dat anti-EpCAM aptamers effectief tumor-specifieke penetratie van liposomen bevorderen, wat ook kan liggen aan overexpressie van EpCAM-moleculen in tumorvasculaire endotheelecellen. Eerder werd aangegeven dat anti-EpCAM aptamers tumorpenetratie in xenografttumorren kunnen verbeteren. CSC's of TIC's zijn ook doelwitten van anti-EpCAM-therapie. Toediening van anti-EpCAM aptamers als targeteringsligand om EpCAM te targeten toonde veelbelovende effecten in targeting van CSC's. Hier kan worden gesuggereerd dat een deel van het efficiënte antitumor-effect van ED-lip kan worden toegeschreven aan succesvolle targeting van CSC's.

In Vivo Antitumor Activiteit

Therapeutische effectiviteit van ED-lip werd geëvalueerd in C26 darmcarcinoom tumormodel. Tumorgrootte, lichaamsgewicht en overleving werden gedurende bijna 2 maanden gemonitord en de resultaten zijn samengevat in Fig. 9 en Tabel 4. Data wijzen erop dat ED-lip geen duidelijke invloed heeft op het lichaamsgewicht van muizen, net als Caelyx®. Na intraveneuze injectie van Caelyx® en ED-lip wordt de tumorgroeisnelheid efficiënt geremd tot dag 30 post-injectie, zonder significant verschil tussen de liposomale groepen. Na 30 dagen post-injectie versnelt de tumorgroeisnelheid, maar de groeisnelheid in medicijnontvangende groepen was nog steeds langzamer dan de PBS-groep. Het verschil tussen Caelyx®-groep en ED-lip was niet significant gedurende 30 dagen post-injectie. De overlevingsresultaten worden weergegeven in een Kaplan-Meier plot. Fig. 9c toont dat ED-lip de overlevingscurve verbetert ten opzichte van PBS of Caelyx®. De belangrijkste indicatoren van de overlevingsstudie zijn samengevat in Tabel 4. De tumoren in drie muizen van de ED-lip-groep genezen volledig, zodat de MST voor deze groep ongedefinieerd is. Behandeling met ED-lip verhoogde TTE van 41,1 tot 49,7 dagen en resulteerde in effectieve antitumoractiviteit met 90,27% TGD met ongedefinieerde MST door volledige verwijdering van tumor in drie muizen.

Tumorgrootte-data toonden aan dat ED-lip de tumorgroei dramatisch kan remmen. De overlevingsanalyseresultaten lieten zien dat behandeling met ED-lip MST en TTE verhoogde. De groep die ED-lip ontving had een hogere TGD% en was effectiever vergeleken met Caelyx®. Onze bevindingen zijn consistent met het hoge niveau van DOX-concentratie in tumorweefsel van de ED-lip-behandelde groep. Daarom verbetert aptamer-geconjugeerde liposomale DOX hun penetratie en verhoogt de medicijnaccumulatie in de tumorplaats, wat leidt tot toename van de effectiviteit van Caelyx® en hogere TGD% in overlevingsdata. Samen genomen wijzen deze bevindingen erop dat anti-EpCAM aptamers kunnen dienen als belangrijke targeteringsagenten voor medicijnafgifte.

Conclusie

Hier hebben we Caelyx® oppervlakte-gefunctionaliseerd met anti-EpCAM (SYLC3) aptamer via post-insertie (ED-lip). Stromcytometrie en fluorescente microscopie lieten een hoog niveau van DOX-opname in C26-cellen zien, wat aangeeft dat de aptamer de internalisatiesnelheid van ED-lip kan verbeteren. Farmacokinetische data toonden aan dat post-insertie van DSPE-mPEG-EpCAM de farmacokinetiek van DOX niet veranderde ten opzichte van Caelyx®. Echter, weefselbiodistributie toonde meer tumoraccumulatie van ED-lip in vergelijking met Caelyx®, zelfs na 72 uur post-injectie. We lieten zien dat ED-lip verbeterde therapeutische effecten had in muizen met C26-tumorren. De verbeterde overlevingsparameters in muizen behandeld met ED-lip suggereren dat de EpCAM-gerichte DOX-liposoom een veelbelovende medicijnafgiftedrager is voor de behandeling van kanker en verdere onderzoek rechtvaardigt.