Redox-responsieve gelatine/silica nanogels gefunctionaliseerd met AS1411 aptamer voor gerichte siRNA-afgifte

Samenvatting

RNA-interferentie (RNAi) biedt ongekende specificiteit voor gen-demping, doch siRNA-stabiliteit en precieze weefselafgifte blijven beperkende factoren. We ontwierpen een dubbel-responsief systeem door gelatine-gebaseerde nanogels (GS) te conjugeren met de nucleoline-gerichte AS1411 aptamer en desoxynucleotide-gesubstitueerde siRNA door een disulfide-linker. Dit ontwerp staat tijdelijke docking van siRNA toe en activeert de afgifte in een glutatioon-rijke tumor-micro-omgeving. In nucleoline-positieve A549-cellen demontteren de Apt-GS/siRNA nanogels bij intracellulaire GSH-blootstelling, wat siRNA efficiënt naar het cytosool levert en krachtige luciferasedemping bereikt. Cytotoxiciteitsassays bevestigden bio-compatibiliteit bij therapeutisch relevante concentraties. Deze redox-responsieve, tumor-gerichte nanogels vertegenwoordigen een veelbelovend platform voor siRNA-gebaseerde kankertherapie.

Inleiding

RNAi benut sequentie-specifieke gen-demping, wat het positioneert als een toonaangevende kandidaat voor het behandelen van genetische aandoeningen, kanker, en infectieuze ziekten door zijn precisie en lage toxiciteit. Vergeleken met antisens-oligonucleotiden, vertonen kleine interfererende RNA's (siRNA's) verhoogde nuclease-weerstand. Chemische modificaties - zoals het substitueren van ribonucleotiden door desoxynucleotiden - hebben getoond siRNA-stabiliteit te versterken terwijl ~40% van RNAi-activiteit behouden blijft. Ondanks deze vooruitgang, blijft efficiënte, weefsel-specifieke afgifte een formidable uitdaging.

Nanodeeltjesdragers kunnen siRNA beschermen tegen degradatie en gerichte afgifte faciliteren. Nucleoline, overgeëxprimeerd op het oppervlak van veel prolifererende kankercellen, is een aantrekkelijk doelwit voor tumor-specifieke opname. De G-quadruplex DNA-aptamer AS1411 (AGRO100) bindt nucleoline met hoge affiniteit en heeft fase II klinische studies als antikankermiddel binnengetreden. Eerdere studies hebben AS1411 succesvol geconjugeerd aan diverse nanomaterialen, wat selectieve tumorcel-internalisatie bereikte. Gelatine, een biologisch afbreekbaar eiwit, is gebruikt voor siRNA-encapsulatie vanwege zijn uitstekende bio-compatibiliteit en gelvormende eigenschappen. Onze groep heeft eerder siloxaan-gecroslinkte gelatine nanogels (GS NGs) ontwikkeld met gecontroleerde grootte en oppervlaktelading, die efficiënte transfektie in vitro en in vivo demonstreerden.

Het overwinnen van intracellulaire barrières - met name endosomale ontsnapping en siRNA-vrijmaking - is cruciaal. Stimuli-responsieve koppelingen, zoals disulfide-bindingen die knappen in de hoge-glutatioon (GSH) omgeving van tumorcellen, hebben significante belangstelling getrokken. Disulfide-gecroslinkte dragers kunnen een burst-vrijmaking van therapeutische lading specifiek binnen maligne cellen triggeren.

Hier presenteren we een hybride nanogel-systeem dat GS NGs, AS1411 aptamer-targeting, en een disulfide-linker voor redox-getriggerde siRNA-vrijmaking combineert. We evalueren de capaciteit om cellulaire opname te verbeteren, tumor-specifieke gen-demping te bereiken, en lage cytotoxiciteit te handhaven.

Methoden

Materialen

Gelatine (Bloom 240-270, pH 4.5-5.5) werd bezorgd van BBI Company Inc. (VS). SPDP, GPSM, en APTMS werden gekocht van Sigma-Aldrich (VS). MTT, DMEM, FBS, penicilline, en streptomycine werden verkregen van Hyclone (VS). AS1411, 5'-FAM-AS1411, en de negatieve controle TDO werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech (China). Desoxynucleotide-gesubstitueerde Luc-siRNA (sense-strang: 5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'; antisense-strang: 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'; FAM-gelabelde antisense) was HPLC-gezuiverd door Gene Pharma (China). Lipofectamine 2000, het luciferase-plasmide pGL3, en het luciferase-assaysysteem waren van Promega (VS). A549 longadenocarcinom-cellen en NIH 3T3 fibroblasten werden verschaft door het Biomedisch Technisch Centrum van Xiamen Universiteit (China). Alle reagenten waren analytische graas; glaswerk was grondig gereinigd en gespoeld met gedioniseerd water.

DNA-sequenties gebruikt:

• AS1411 aptamer: 5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
• Controle TDO: 5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Bereiding en karakterisatie van Apt-GS/siRNA-complexen

GS nanogels werden gesynthetiseerd via een sol-gel-proces: GPSM (0.2 g) werd toegevoegd aan 20 mL van 0.75% gelatine in HCl (pH 3) bij 60 °C gedurende 30 min, gevolgd door APTMS (0.08 g) en een 24-uurs incubatie. De resulterende GS NGs werden gezuiverd door centrifugatie (14 000 rpm, 25 °C, 12 min) drie keer. Vervolgens werden GS NGs (0.5 mL, 5 g L⁻¹ PBS) gereageerd met SPDP (25 µL, 20 mM DMSO) gedurende 60 min bij kamertemperatuur, daarna geïncubeerd met thiol-gelabelde AS1411 (1 mg mL⁻¹) gedurende 12 uur. De Apt-GS nanogels werden hersteld door centrifugatie en driemaal gewassen met gedioniseerd water. De SPDP-geactiveerde Apt-GS NG-suspensie (80 mL, 5 mg mL⁻¹) werd gemengd met de siRNA sense-strang overnacht bij 4 °C. Na zuivering werd de antisense-strang geanneald door op te warmen tot 94 °C gedurende 5 min en af te koelen tot 47 °C gedurende 20 min, wat Apt-GS/siRNA-complexen vormde.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi S-4300) onthulde sferische deeltjes. Dynamische lichtverstrooiing (Malvern Zetasizer) meet hydrodynamische diameters en zeta-potentialen. Conjugatie-efficiëntie werd gekwantificeerd door fluorescentie van FAM-gelabeld DNA en ninhydrine-assay voor oppervlakte-amino-groepen (≈0.642 mmol g⁻¹).

Gelectroforese-analyse

Elektroforese werd uitgevoerd bij 100 V gedurende 20-30 min op 2% agarose in TBE-buffer. Beelden werden vastgelegd met een gelectroforese-documentatiesysteem. Voor vrijmakingsstudies werden GS/siRNA en Apt-GS/siRNA-complexen geïncubeerd met 10 mM GSH (PBS) gedurende 2 uur voor het laden.

In vitro cytotoxiciteit

MTT-assays werden uitgevoerd op A549-cellen (1 × 10⁴ cellen / put) in 96-putplaten. Na 24 uur om 70% confluentie te bereiken, werden cellen behandeld met nanogels (100-600 µg mL⁻¹) in serumvrij DMEM gedurende 24 uur, gevolgd door 4 uur incubatie met MTT (5 mg mL⁻¹). DMSO werd toegevoegd, en absorbantie werd gelezen bij 490 nm. Experimenten getripliceerd; levensvatbaarheid (%) werd berekend ten opzichte van onbehandelde controles.

Cellulaire internalisatie

A549 en 3T3-cellen werden geïncubeerd met 25 µL FAM-gelabelde Apt-GS of TDO-GS (2 mg mL⁻¹) gedurende 10 uur in serumvrij medium bij 37 °C. Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gebeeld door confocale laserscannende microscopie (CLSM). Voor stroomcytometrie werden cellen behandeld met FAM-gelabelde nanogels (2 mg mL⁻¹) gedurende 0.5-16 uur, daarna gewassen, heropgelost in ijs-koud PBS, en geanalyseerd op een EPICS XL stroomcytometer. Opname-inhibitie werd beoordeeld door cellen voor te incuberen met vrije AS1411 (0.5, 5, 50 µM) gedurende 8 uur voordat nanogels toegevoegd werden.

Gen-demping

A549 (2 × 10⁵ cellen / put) en NIH 3T3 (4 × 10⁵ cellen / put) cellen werden getransfecteerd met Apt-GS/siRNA-complexen (80 µg mL⁻¹) gedurende 8 uur. Drie behandelingsregimes werden geëvalueerd: (a) Apt-GS/siRNA alleen; (b) Apt-GS/siRNA gevolgd door liposoom (A-GS/si→Lip); (c) gelijktijdige Apt-GS/siRNA en liposoom (A-GS/si+Lip). Na een additionele 40 uur werd luciferase-activiteit gemeten met een luciferase-assaysysteem. Data werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (getripliceerd).

Resultaten en Discussies

Synthese en karakterisatie van GS-AS1411/siRNA-complexen

TEM-beelden (Fig. 1) bevestigden dat zowel lege GS als Apt-GS nanogels uniforme sferische deeltjes vormden met diameters van 170-200 nm. Fluorescentiebeeldvorming demonstreerde succesvolle conjugatie van AS1411 en siRNA. Kwantificering onthulde ~0.65 µmol g⁻¹ aptamer op GS. Hydrodynamische groottes namen toe van 162.3 nm (GS) naar 216.5 nm (Apt-GS) en 234.9 nm (Apt-GS/siRNA), wat oppervlaktefunctionalizatie weerspiegelt. Zeta-potentialen verschoven van +40.1 mV (GS) naar +33.9 mV (Apt-GS) en -24.9 mV (Apt-GS/siRNA), wat een reductie in oppervlaktelading aangeeft die verwacht wordt om niet-specifieke eiwitbinding en cytotoxiciteit te verlagen.

siRNA-lading en vrijmaking

Gelectroforese toonde efficiënte siRNA-lading op Apt-GS/siRNA-complexen, zoals bewijs door verminderde mobiliteit (lanes 10-11). Bij incubatie met 10 mM GSH werd siRNA vrijgemaakt binnen 2 uur (lanes 6-7), wat redox-getriggerde demontage bevestigt. Laadcapaciteit werd geschat op 3:1 tot 2:1 pmol siRNA per µg nanogel. Fysieke insluitseling (mengen van vrije siRNA met GS) vertoonde zwakkere retentie, wat het voordeel van covalente hechting benadrukt.

Cytotoxiciteit en nucleoline-targeting

MTT-assays (Fig. 4) onthulden >80% levensvatbaarheid voor GS, Apt-GS, en Apt-GS/siRNA over 100-600 µg mL⁻¹, wat uitstekende bio-compatibiliteit demonstreert. Iets verminderde levensvatbaarheid met Apt-GS werd toegeschreven aan AS1411-geïnduceerde NF-κB-remming en organel-disruptie. Fluorescentiemicroscopie en stroomcytometrie (Fig. 5 & 6) bevestigden selectieve opname: Apt-GS toonde 95% internalisatie in A549-cellen versus 52% in 3T3-fibroblasten. Competitie met vrije AS1411 verlaagde opname met 50% (fluorescentie) en 30% (percentage positieve cellen), wat nucleoline-gemedieerde endocytose bevestigt.

RNA-interferentie

Luciferasedempingsassays (Fig. 7a) toonden een 4.6-voudige reductie in A549-cellen met Apt-GS/siRNA, vergeleken met slechts 6% in NIH 3T3-cellen, wat tumor-specificiteit benadrukt. Toevoeging van liposomen (A-GS/si→Lip) verbeterde demping niet significant (30.4%) ten opzichte van Apt-GS/siRNA alleen, terwijl gelijktijdige liposoombehandeling (A-GS/si+Lip) de demping verhoogde tot 41.6%. De hoogste demping (≈ 2.7-voudig over 3T3) werd bereikt bij 80 µg mL⁻¹, met verminderde efficiëntie bij 120 µg mL⁻¹ waarschijnlijk door verhoogde cytotoxiciteit.

Conclusies

We hebben een redox-responsief, nucleoline-gericht nanogel-platform ontworpen dat desoxynucleotide-gemodificeerde siRNA beschermt en specifiek vrijmaakt binnen de GSH-rijke tumor-cytosol. De ~200 nm, positief geladen Apt-GS/siRNA nanogels bereiken krachtige, tumor-selectieve gen-demping (~5-voudige verbetering in A549-cellen) terwijl lage cytotoxiciteit gehandhaafd wordt. Deze bevindingen valideren de strategie van het combineren van disulfide-linkerchemie met aptamer-targeting voor efficiënte siRNA-afgifte en vertegenwoordigen een veelbelovende stap naar klinische RNAi-therapieën.