Redox-Sensitive Gelatine/Silica-Aptamer Nanogels voor gerichte siRNA-afgifte

Resultaten en discussies

Synthese en karakterisering van GS-AS1411/siRNA-complexen

Om de kankergerichte siRNA-drager te construeren, werd gelatine/silica-AS1411 (Apt-GS) nanogel ontworpen (schema 1) met behulp van een sol-gel-methode [19, 20]. Typisch TEM-beeld (Fig. 1) onthulde dat blanco GS en Apt-GS verspreide bolvormige structuren waren met gemiddelde diameters van 170-200 nm. FAM-gelabeld DNA werd gebruikt voor de synthese om de koppeling van AS1411 en siRNA aan GS NG's te bevestigen. De hoeveelheid geconjugeerd aptameer op GS was ongeveer 0,65 mol/g, zoals gekwantificeerd met behulp van fluorescentiespectra. Ondertussen kan intens groene fluorescentie gemakkelijk worden waargenomen in de fluorescentiebeelden, wat de integratie van aptamer AS1411 en siRNA suggereert. Zoals weergegeven in Fig. 2, nam de hydrodynamische grootte van kale GS-, Apt-GS- en Apt-GS/siRNA-NG's (respectievelijk 162.3 nm, 216.5 nm en 234,9 nm) geleidelijk toe samen met de functionaliseringsprocedure als gevolg van een toename in de functionele oppervlaktelaag. Aan de andere kant was het zeta-potentieel van Apt-GS minder positief (33,9 ± 0,5 mV) dan dat van kale GS NG's (40,1 ± 0,5 mV) vanwege het maskerende effect van negatieve DNA-aptameren op het oppervlak. Na een verdere conjugatie met siRNA op het oppervlak, verschuift het zeta-potentieel van Apt-GS/siRNA NG's nog steeds negatief naar 24,9 mV vanwege de overmaat-vrije negatieve fosfaatgroepen van siRNA. Dit resultaat suggereerde een verminderde biologische toxiciteit omdat de sterke positieve ladingen negatief geladen eiwitten in het bloed zouden kunnen verstoren en het celmembraan zouden kunnen verstoren [24].

Afbeeldingen van Apt-GS (a , c ) en Apt-GS/siRNA nanogels (b , d ). een , b TEM-afbeeldingen. Schaalbalken vertegenwoordigen 0,5 m. c , d Fluorescerende beelden. Schaalbalken vertegenwoordigen 5 μm

Hydrodynamische grootte en zeta-potentialen van GS-, Apt-GS- en Apt-GS/siRNA-nanogels

siRNA laden en vrijgeven

Een succesvol RNAi kan alleen optreden wanneer siRNA snel wordt afgeleverd en vrijkomt van zijn drager in het cytoplasma [25]. Tumorcellen hebben een 7-10 maal hogere GSH-concentratie dan die in normale cellen [26, 27]. In deze studie werd siRNA geconjugeerd aan actieve Apt-GS NG's via de disulfide-verknopingsreactie. De gelelektroforese (GE) werd uitgevoerd om het siRNA-laad- en afgiftevermogen van Apt-GS/siRNA-complexen te evalueren. Zoals verwacht, terwijl vrij pDNA (Fig. 3, lanen 1-5) naar zijn gebruikelijke positie bewoog, vertoonden Apt-GS / siRNA-complexen de verminderde mobiliteit in een elektromobiliteitsverschuivingsassay (Fig. 3, lanen 10-11) die de goede laden van siRNA. Om de intracellulaire toestand na te bootsen, werd 10 mM GSH gedurende 2 uur behandeld met complexen om de Apt-GS / siRNA NG's te verminderen. Zoals getoond in Fig. 3, baan 6-7, werden siRNA-moleculen waargenomen in de polyacrylamidegel na de behandeling van GSH, wat aangeeft dat Apt-GS / siRNA NG's omkeerbaar functionele siRNA-moleculen zouden kunnen vrijgeven door disulfidesplitsing in de aanwezigheid van glutathion. Bovendien werd de hoeveelheid siRNA op de nanodeeltjes geanalyseerd door de totale hoeveelheid siRNA en controle-siRNA te vergelijken in 2% polyacrylamidegelelektroforese. De Apt-GS kapselde siRNA-moleculen in een verhouding van 3:1∼2:1 pmol per microgram in. Er wordt ook opgemerkt dat het mengsel van siRNA en Apt-GS een zwakkere retentie vertoonde als gevolg van fysieke insluiting van negatief siRNA (Fig. 3, baan 8).

AGE-analyse van omkeerbare siRNA-binding aan Apt-GS-nanogels. Lanen 1-5:vrij siRNA met een hoeveelheid van 50, 40, 30, 20 en 10 pmol. Lanen 6 en 7:GS / siRNA en Apt-GS / siRNA met 10 m GSH bij 2 h. Baan 8:het mengsel van vrij siRNA en Apt-GS NG's. Lanen 10 en 11:GS/siRNA- en Apt-GS/siRNA-complexen zonder 10 mM GSH als controles

Cytotoxiciteit en nucleolinetargeting

In vitro cytotoxiciteitsevaluatie werd onderzocht met MTT-assay in A549-cellen. MTT-assay wordt gebruikt om de cytotoxiciteit van bereide nanogels te beoordelen. Niet-toxisch luciferase-siRNA werd geselecteerd als een reporter, die geen dodend effect heeft op tumorcellen [28, 29]. Vandaar dat de levensvatbaarheid van de cellen de biocompatibiliteit van de drager vertegenwoordigde. Zoals getoond in Fig. 4, werd de celproliferatie niet opmerkelijk beïnvloed door GS, Apt-Apt en Apt-Apt/siRNA bij de concentraties van 100-600  μg/ml groepen (levensvatbaarheid van de cellen>  80%) en de cytotoxiciteit verscheen dosis -afhankelijk. Vergeleken met kale GS NG's hadden AS1411-gemodificeerde nanogels een lichte afname van de levensvatbaarheid van de cellen als gevolg van de remming van NF-KB-signalering [27, 30] en vernietiging van organelmembranen [16]. De goedaardige biocompatibiliteit van Apt-GS nanogels maakt ze geschikt als siRNA-dragers in vivo.

Cellevensvatbaarheid van A549-cellen met GS-, Apt-GS- en Apt-GS/siRNA-nanogels van verschillende concentraties bepaald door MTT-assay

Om de targeting van Apt-GS in tumorcellen in vitro te beoordelen, hebben we A549-cellen en 3T3-fibroblasten geïncubeerd met dezelfde hoeveelheden FAM-gelabeld Apt-GS of controle TDO-GS (GS versierd met een controle-oligonucleotide). Lage fluorescentieniveaus konden worden waargenomen in 3T3-cellen of wanneer cellen werden behandeld met controle TDO-GS (Fig. 5b, c). Daarentegen was groene fluorescentie uitgezonden door aptamer AS1411 aanzienlijk verbeterd in A549-kankercellen (Fig. 5a), wat suggereert dat Apt-GS specifiek werd geaccumuleerd in tumorcellen als gevolg van de introductie van de op nucleoline gerichte AS1411-aptameren. In de kwantitatieve analyse door flowcytometrie (Fig. 6), vertoonden Apt-GS NG's tijdsafhankelijke fluorescentie-intensiteiten in beide celtypen. Van 0,5 tot 16 h verbeterde de fluorescentie-intensiteit van internalisatie van Apt-GS in A549-cellen en 3T3-cellen respectievelijk 13 en 2 keer. Wat betreft de celverhouding die NG's bevat, nam deze snel toe in de eerste 30 minuten en blijkbaar was de maximale verzadiging na 8 uur in A549.96% van de A549-cellen binnen 16 uur bevestigd of waren de nanogels ingenomen, terwijl slechts 52% van de 3T3-cellen werd waargenomen. Om de rol van nucleoline bij de cellulaire opname van nanogels te evalueren, werd het mengsel van de bereide Apt-GS NG's en vrije AS1411-aptameren met verschillende concentraties (0,5, 5 en 50 M) gedurende 8 uur geïncubeerd met A549-cellen. De fluorescentie-intensiteit en percentages van cellen die nanogels bevatten, daalden met respectievelijk 50% en 30% bij gebruik van het vrije AS1411-aptameer om te concurreren met de Apt-GS NG's voor nucleoline dat tot expressie wordt gebracht op het celmembraan, wat suggereert door nucleoline geïnduceerde receptor-gemedieerde endocytose ( Afb. 6c). Deze gegevens toonden aan dat Apt-GS NG's een hogere accumulatie vertoonden in A549-kankercellen via door nucleoline gemedieerde internalisatie.

een –c Celopname van FAM-siRNA geleverd door Apt-GS en TDO-GS nanogels. Beelden zijn gemaakt met CLSM. Groen signaal:FAM. Schaalbalk is 10 μm

Flowcytometrie-analyse (FCMS) van celopname van FAM-gelabelde Apt-GS en TDO-GS nanogels in verschillende celtypen. Invoegen:FACS-profielen, a , b kromme rood, groen, blauw, paars, aqua en geel geven de incubatietijd aan van 0,5 tot 16 h; c curve rood, groen, blauw en paars betekenen de concentratie van AS1411 van 0 tot 16 μM

RNA-interferentie

Het is gemeld dat het opnemen van deoxynucleotiden in siRNA de stabiliteit van de sense-streng kan verhogen en de werkzaamheid van RNAi ∼ 40% kan behouden [2, 3]. Om de knockdown-efficiëntie van test-siRNA-dragers te evalueren, hebben we in beide cellen een door ribonucleotide vervangen luciferase-reportergensysteem gebruikt. De efficiëntie van gen-knockdown (KD) van siRNA werd na 48 uur beoordeeld door luciferase-activiteit. Zoals getoond in Fig. 7a, verbetert het Apt-GS / siRNA de 4,6-voudige gen-knockdown-efficiëntie van A549-cellen vergeleken met 6% van normale 3T3-cellen, wat een goede celselectiviteit laat zien. Dit suggereerde dat de aptamer AS1411-modificatie de transfectie-efficiëntie verbeterde door een targeting-effect te genereren. Het is bewezen dat kationische liposomen helpen bij het afleveren van vracht en het ontsnappen uit lysosomen [31]. Bovendien hielp de daaropvolgende toevoeging van liposoom (A/si-GS →Lip-groep) niet om de door siRNA gemedieerde genuitschakelingsactiviteit (30,4%) te verbeteren, ondanks de verstoring van het endosoom, wat leidde tot siRNA-afgifte in de intracellulaire omgeving van glutathion (GSH) door disulfidesplitsing . Bovendien verbeterde co-transfectie van liposomen en Apt-GS/siRNA (A/si-GS + Lip-groep) de efficiëntie van de luciferase-expressie (41,6%) in A549 enigszins, hoewel liposoomhulp lysosoom ontsnapt, in overeenstemming met eerdere rapporten [27] , 30]. A549-cellen hadden echter 2,7-voudige en 1,4-voudige genuitschakelingsactiviteiten voor respectievelijk de A/si-GS→Lip-groep en voor A/si-GS+Lip, vergeleken met 3T3-cellen, wat een afname van de celselectiviteit impliceert.

In vitro silencing effect van anti-luciferase siRNA geformuleerd in Apt-GS nanogels met verschillende behandelingen (a ) en concentratie van Apt-GS/siRNA-complexen (A-GS/si) op ​​gene silencing (b )

Vervolgens onderzochten we het concentratie-effect van nanogels op de RNAi. Zoals getoond in Fig. 7b, bereikte de geninterferentie-efficiëntie het maximum bij de complexe concentratie van 80 g/ml. De verminderde KD-efficiëntie bij een concentratie van 120 g/ml kan het gevolg zijn van een verhoogde cytotoxiciteit van aptamer. Er wordt ook opgemerkt dat toevoeging van een liposoom van een endosoom-ontsnappingsmiddel de RNA-interferentie-efficiëntie kan verhogen bij lage concentraties Apt-GS/siRNA-nanogels (40 g/ml en 80  μg/ml), maar niet leidde tot een verlaging bij hoge concentraties (120 g/ml en 80  μg/ml). g/ml). Er wordt dus aangenomen dat Apt-GS met succes siRNA aan de tumorcellen kan leveren en vervolgens kan resulteren in specifiek RNAi.