Mesoporeuze op nanodeeltjes gebaseerde combinatie van NQO1-remmer en 5-fluoruracil voor krachtig antitumoreffect tegen plaveiselcelcarcinoom van hoofd en nek (HNSCC)

Resultaat en discussie

Voorbereiding van 5-FU/ß-lap-geladen lipide dubbellaags ondersteunde mesoporeuze silica nanodeeltjes

In deze studie hebben we een mesoporeus silica-nanodeeltje aangepast dat is gestabiliseerd door gePEGyleerde lipidedubbellaag. Het met 5-FU/ß-lap geladen MSN werd bereid door middel van de emulsie-sonicatiemethode en vervolgens werd met geneesmiddel geladen MSN geïntroduceerd in de kolf die een dunne lipidefilm bevat bestaande uit DSPE-PEG2000. Het mengsel werd gesoniceerd en het met lipide beklede MSN dat 5-FU / ß-lap bevatte, werd verkregen (FNQ-MSN) (Fig. la). De laadefficiëntie (LE) van 5-FU en ß-lap was respectievelijk 91,5 ± 1,65% en 92,9 ± 1,24%. De FNQ-MSN vertoonde een 8,1 ± 1,12 wt% 5-FU en 7,6 ± 0,95 wt% ß-lap, wat wijst op de hoge laadcapaciteit (LC) van de MSN-drager. De aanwezigheid van een lipide dubbellaag zal de ongewenste afgifte ervan in de systemische circulatie voorkomen en daardoor de toxiciteit voorkomen. De gemiddelde deeltjesgrootte van met geneesmiddel geladen MSN was 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089), terwijl de assemblage van een lipide dubbellaag op het MSN-oppervlak (FNQ-MSN) de gemiddelde deeltjesgrootte verhoogde tot 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115), wat wijst op een vaste aanwezigheid van lipidematerialen op het oppervlak van MSN (figuur 1b). De zeta-potentiaal veranderde van − 18,2 ± 1,22 in − 26,4 ± mV. De kleine deeltjesgrootte van FNQ-MSN zal de preferentiële accumulatie van met geneesmiddel beladen drager in de lekkende tumorweefsels mogelijk maken dankzij het EPR-effect. Bovendien zal aan het oppervlak gePEGyleerd de uitstekende stabiliteit en verlengde bloedcirculatietijd verlenen die de kans op FNQ-MSN in de tumorweefsels verder zal vergroten. TEM-afbeelding vertoonde een morfologische gelijkenis met die van liposoom en presenteerde een perfecte bolvormige uniforme verspreiding op het raster. TEM-afbeelding toonde duidelijk een grijsachtige buitenste later en donkerdere kern die de aanwezigheid van lipide-assemblage op het MSN-oppervlak aangeeft (figuur 1c). De grootte die werd waargenomen met TEM komt overeen met de DLS-deeltjesgrootte van een zetasizer. MSN beschikt over goed geordende kanalen voor de homogene verdeling van medicijnmoleculen. De oppervlakte-eigenschap van poriën is een van de belangrijke factoren bij de stabiele belading van de kleine moleculen. De verschillende fysieke krachten die betrokken zijn bij de interactie tussen gastheer en gast omvatten voornamelijk de hydrofobe krachten en van der Waals-interactiekrachten. Hoe hoger het laadvermogen van het geneesmiddel, hoe hoger de intracellulaire concentratie en hoe hoger de efficiëntie van het doden op de tumorplaatsen. De FNQ-MSN vertoonde een uitstekende stabiliteit in het PBS-medium en de deeltjesgrootte bleef gedurende de onderzoeksperiode onveranderd tot 30 dagen. Een dergelijke verbeterde stabiliteit van het dragersysteem en een hoge laadcapaciteit van het dragersysteem zullen de biodistributie en efficiëntie bij de tumorbehandeling verbeteren.

een Schematische weergave van de constructie van 5-FU en ß-lap-geladen lipide dubbellaag-gecoate mesoporeuze silica nanodeeltjes. Twee geneesmiddelen zijn geladen in de poriën van het MSN die verder werden gestabiliseerd door de gePEGyleerde lipide dubbellaagse assemblage op het buitenoppervlak van MSN. b Deeltjesgrootteverdeling van FNQ-MSN. c TEM-afbeelding van FNQ-MSN met een inzet van hogere vergrotingen

In vitro geneesmiddelafgifte

De in vitro geneesmiddelafgifte van 5-FU en ß-lap van FNQ-MSN werd bestudeerd in PBS en ABS (Fig. 2). Zoals getoond, werden twee verschillende afgiftetrends waargenomen in pH 7.4 en pH  5.0. Bijvoorbeeld, 25% van 5-FU komt vrij in 24 u in pH 7,4 vergeleken met ~ 40% van geneesmiddelafgifte in pH   5,0 in 24 u. Evenzo werd 20% en 30% van ß-lap vrijgegeven in respectievelijk pH 7.4 en pH  5.0. De afgiftekinetiek was identiek gedurende de onderzoeksperiode met 50% 5-FU afgegeven in alkalische buffer en 80% geneesmiddelafgifte bij pH   5,0 na 72 uur onderzoeksperiode. Een pH-responsieve afgifte van geneesmiddel in de zure omstandigheden is voordelig voor de kankerbehandeling. Er werd geen fenomeen van burst-afgifte waargenomen in beide pH-omstandigheden, voornamelijk toegeschreven aan de aanwezigheid van de DSPE-PEG-laag die de afgifte van het medicijn uit de FNQ-MSN gedurende de onderzoeksperiode controleerde. Aanzienlijk verschil in geneesmiddelafgifte werd waargenomen tussen pH 7.4 en pH  5.0 omstandigheden. Bij pH 7.4-omstandigheden, PEG-b -DSPE vertoont een hoge stealth-laageigenschap waardoor de afgifte van de ingekapselde verbinding wordt voorkomen. Het huidige resultaat toonde aan dat de medicijnafgifte versnelde bij pH   5,0, wat wijst op de demontage van de beschermende schaal rond het MSN-oppervlak. De pH-gevoelige geneesmiddelafgiftesnelheid, die zorgt voor maximale geneesmiddelafgifte in de kankercellen, kan de antitumorwerking verbeteren en ongewenste toxiciteit voor normale weefsels verminderen. Het is mogelijk dat in de aanwezigheid van een pH-responsief element, FNQ-MSN kan resulteren in het afstoten van een lipidedubbellaag op het MSN, wat resulteert in een verhoogde afgifte bij lagere pH-omstandigheden.

In vitro afgifte van 5-FU en ß-lap van FNQ-MSN in bufferomstandigheden met pH 7.4 en pH 5.0. De afgiftestudie werd voortgezet tot 72 h en de geneesmiddelafgifte werd gekwantificeerd met behulp van de HPLC-methode. **p <0,01

Gevoeligheid van NQO1 tot ß-lap

Aangezien de opregulatie van NQO1 in veel kankercellen, waaronder HNSCC, gepaard gaat met een slechte prognose en een slecht therapeutisch resultaat, kunnen geneesmiddelen die gericht zijn op NQO1 een potentiële strategie zijn voor de behandeling van kanker [24]. NQO1 wordt tot overexpressie gebracht in het niveau variërend van 100- tot 200-voudig in plaveiselcelcarcinoom vergeleken met die geassocieerd met normale weefsels. Daarom werd de invloed van ß-lap op de NQO1-enzymactiviteit bestudeerd in Cal33-cellen. Zoals getoond, vertoonde ß-lap een concentratieafhankelijke remming van NQO1-enzymactiviteit in Cal33-cellen (Fig. 3a). Er werd met name een significant remmend effect waargenomen bij een dosis van 20-50 g/ml ß-lap. Verder werd het remmende potentieel van ß-lap op NQO1-eiwit verder bestudeerd door Western-blot-analyse (Figuur 3b). De resultaten lieten duidelijk de significante afname van het NQO1-eiwit in de kankercellen zien met een toename van de concentratie van ß-lap. Ongeveer 80% NQO1-remming waargenomen bij 100 g/ml ß-lap. NQO1-biologisch activeerbaar medicijn zoals ß-lap wordt gemetaboliseerd door NQO1 en vormt een onstabiele hydrochinonverbinding die onmiddellijk weer wordt omgezet in de oorspronkelijke component, waarbij 2 oxidaties van één elektron achterblijven en 2 O ²⁻ wordt verbruikt . Dit zal een zinloze redoxcyclus creëren waarin 1 molecuul ß-lap 130 mol superoxide zal genereren ten koste van 60-70 mol NAD(P)H6. De zo gevormde superoxide (O2.−) radicalen worden omgezet in waterstofperoxide (H2O2−) en veroorzaken celapoptose en celdood [25].

een Effect van concentratieafhankelijke activiteit van ß-lap op de NQO1-activiteit van Cal33-kankercellen door de enzymatische methode. b Effect van concentratieafhankelijke activiteit van ß-lap op de NQO1-eiwitniveaus door Western-blot-analyse met GAPDH als huishoudeiwit

In vitro antikankereffect van FNQ-MSN in HNSCC-cellen

Het in vitro antikankereffect van ß-lap in Cal33-cel werd bestudeerd met MTT-assay. De resultaten onthulden dat ß-lap een typische concentratieafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van de cellen vertoonde (figuur 4a). Met name werd een significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen waargenomen bij een concentratie van 50 g/ml. Voor verdere experimenten werd 20 μg/ml geselecteerd (onder de IC50-waarde van ß-lap). Vervolgens werd het versterkende effect van ß-lap op 5-FU bestudeerd bij 3 verschillende concentraties (5, 10 en 20 g/ml). Zoals getoond, resulteerde de combinatie van 5-FU+ß-lap in een lagere levensvatbaarheid van de cellen; met name vertoonde FNQ-MSN een significant lagere levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met die van een van de individuele geneesmiddelen of fysieke combinaties (figuur 4b). 5-FU en ß-lap vertoonden bijvoorbeeld een cellevensvatbaarheid van 35,7% en 70,2%, terwijl 5-FU+ß-lap respectievelijk 26,5% en FNQ-MSN 13,1% liet zien. De resultaten toonden duidelijk aan dat het cytotoxische effect van 5-FU significant was verhoogd in combinatie met ß-lap. Het is vermeldenswaard dat FNQ-MSN effectiever was in vergelijking met die van 5-FU+ß-lap, toegeschreven aan de betere internalisatie en gecontroleerde afgifte van geladen therapieën uit het dragersysteem. Resultaten tonen duidelijk het remmende effect van ß-lap op NQO1-enzymatische activiteit en eiwitniveaus en versterkten het antikankereffect van 5-FU en resulteren in verbeterde therapeutische resultaten bij de behandeling van HNSCC.

een Effect van concentratieafhankelijke activiteit van ß-lap op de cellevensvatbaarheid van Cal33-cellen. b Cytotoxisch effect van individueel en combinatie met tweede chemotherapeutisch middel, 5-FU bij 3 verschillende concentraties van respectievelijk 5-20 μg/ml. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd door MTT-assay na 24 uur incubatie. c Western-blot-analyse van NQO1- en Bcl-2-eiwitexpressie na behandeling met individuele en combinatie van 5-FU en ß-lap

FNQ-MSN-rol in de signaalroutes:Western Blot-analyse

Het mechanisme van het ß-lap-gemedieerde cytotoxische effect werd verder onderzocht door middel van western blot-analyse. Zoals getoond, resulteerde ß-lap in een afname van de eiwitband van NQO1 vergeleken met controle; de meest opvallende afname van het NQO1-niveau werd echter waargenomen in de met FNQ-MSN behandelde celgroep (figuur 4c). De ß-lap-geïnduceerde verhoging van de chemosensitiviteit van Cal33 door de celapoptose te versterken werd geëvalueerd door middel van het Bcl-2-eiwitniveau. De Bcl-2-familie speelt een belangrijke rol bij het reguleren van de celhomeostase en regelt de proliferatie en dood van kankercellen. Het proces van afname van Bcl-2 en toename van Bax resulteert in het vrijgeven van het cytochroom C in het cytosol dat de gehele caspase-cascade zal initiëren, resulterend in celdood [26]. De resultaten lieten duidelijk zien dat de combinatie van 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) de Bcl-2 significant verlaagde, wat wijst op het versterkte antikankereffect in de Cal33-kankercellen.

Apoptose-analyse van HNSCC

Na de cellevensvatbaarheidsanalyse werd het apoptose-effect van individueel en gecombineerd geneesmiddel op Cal33-cellen geëvalueerd met een flowcytometer na annexine V/PI-kleuring (Fig. 5). Het apoptose-effect van individueel 5-FU (10 g/ml) of ß-lap (30 g/ml) resulteerde niet in enige merkbare apoptose van kankercellen; 5-FU+ß-lap resulteerde echter in een dramatische toename van het apoptose-aandeel van kankercellen. Belangrijk is dat FNQ-MSN resulteerde in meer dan 60% van celapoptose (vroege en late apoptose), wat wijst op het superieure therapeutische effect van een op dragers gebaseerd combinatieregime. Het apoptose-effect werd verder bevestigd door Hoechst 33342-kleuring. Zoals getoond, resulteren cellen die zijn behandeld met FNQ-MSN in een grotere hoeveelheid cellen die apoptose, nucleaire condensatie en fragmentatie-kenmerken ondergaan in vergelijking met die van 5-FU of ß-lap alleen (Fig. 6). Tijdens het apoptoseproces krimpen cellen zonder te worden beschadigd in het buitenste celmembraan en resulteert in chromatinecondensatie met verhoogde apoptotische lichaamsvorming.

Flowcytometeranalyse van Cal33-cellen met dubbele kleuring van annexine V en PI na behandeling met individuele en combinatie van 5-FU en ß-lap. Er werden 10.000 gebeurtenissen geregistreerd in de flowcytometer

Kernmorfologieanalyse van Cal33-cellen na kleuring met Hoechst 33342; cellen werden behandeld met individuele en combinatie van 5-FU en ß-lap. Er werden 10.000 gebeurtenissen geregistreerd in de flowcytometer

Live/Dead Assay

Het antikankereffect van individuele en gecombineerde geneesmiddelen werd verder geëvalueerd met de Live/Dead-assay. De behandelde cellen werden onderworpen aan kleuring met Calcein AM en ethidiumbromide als een respectieve marker van levende en dode cellen (Fig. 7). Zoals getoond worden onbehandelde cellen gekleurd met 100% groene fluorescentie. De afzonderlijke geneesmiddelen, 5-FU (10 g/ml) of ß-lap (30 g/ml) vertoonden echter lichte rode fluorescentie gekleurde cellen; overheersende cellen vertoonden echter groene fluorescentie, wat wijst op beperkte celdood. Opmerkelijke celdood werd waargenomen in met FNQ-MSN behandelde kankercellen, zoals blijkt uit overheersende rode fluorescentie en minder groene fluorescentie gekleurde cellen. Het hogere antikankereffect van FNQ-MSN werd toegeschreven aan de synergetische activiteit van 5-FU en ß-lap in de kankercellen en het vermogen van ß-lap om de chemosensitiviteit van 5-FU te verhogen.

Levende/dood-analyse van Cal33-cellen met dubbele kleuring van Calcein AM en ethidiumbromide na behandeling met individuele en combinatie van 5-FU en ß-lap

In vivo antitumorwerking van FNQ-MSN tegen HNSCC xenograft-model

Om de werkzaamheid van een combinatieregime in een diermodel verder te evalueren, werd HNSCC-xenotransplantaat bereid en toegediend met respectievelijk 5 mg / kg 5-FU en 10 mg / kg ß-lap. De farmaceutische graad van ß-lap is ARQ761 die zich momenteel in een fase I klinische studie bevindt voor de behandeling van gemetastaseerde maligniteiten. ß-lap heeft de limiet bepaald voor de maximaal verdraagbare dosis bij mensen volgens de preklinische onderzoeken [27]. Met dit in gedachten hebben we voor de in vivo studies optimaal gekozen voor een dosis van 10 mg/kg ß-lap. Zoals getoond werd er geen significante afname van het tumorvolume waargenomen met individueel toegediende 5-FU en ß-lap vergeleken met die van niet-behandelde controle (Fig. 8a). Er werd een opmerkelijke afname van het tumorvolume waargenomen met een fysiek mengsel van 5-FU+ß-lap; gecombineerde behandeling van op een drager gebaseerde 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) vertraagde echter de tumorgroei significant en verlengde de overleving van tumordragende xenograft-muizen. De tumorvolumegrafiek van FNQ-MSN zou in twee delen kunnen worden verdeeld; een onbeduidende groei in tumorvolume werd waargenomen tot dag 9 terwijl de tumor significant toenam na dag 9 tot dag 18, niettemin was het totale tumorvolume veel kleiner vergeleken met dat van controlegroepen of andere groepen. De bezorgdheid over de toxiciteit van het individuele en combinatorische regime werd beoordeeld in termen van lichaamsgewicht (Fig. 8b). Zoals aangetoond, resulteerde een fysieke menging van 5-FU+ß-lap in ernstige toxiciteit, zoals weergegeven door meer dan 10% verlies van lichaamsgewicht, terwijl 5-FU resulteerde in 5% van het lichaamsgewicht. Zoals verwacht resulteerde FNQ-MSN niet in enig verlies van lichaamsgewicht, wat wijst op het unieke voordeel van het lipide-MSN-gebaseerde dragersysteem. Het versterkte antitumoreffect van FNQ-MSN werd toegeschreven aan het remmende effect van ß-lap op het NQO1-enzym en -eiwit, wat op zijn beurt de chemosensitiviteit van 5-FU verhoogde en resulteerde in een synergetisch antikankereffect in de menselijke Cal33-tumoren, ten tweede, lipidedubbellaag –omhulde MSN beschermde het geneesmiddel tijdens de systemische circulatie en zou op een gecontroleerde manier in het tumorweefsel kunnen vrijkomen; ten derde zou PEGylatie van nanodragers de bloedcirculatietijd kunnen verlengen, waardoor preferentiële accumulatie in de tumorweefsels mogelijk wordt als gevolg van het EPR-effect [28, 29] ]. GePEGyleerde MSN werden voornamelijk gevangen in RES van de lever, milt en long, goed voor meer dan 80% van de toegediende dosis. PEG-modificatie van MSN verminderde duidelijk de klaringssnelheid van MSN in organen, wat aantoont dat het moeilijker was om de gePEGyleerde NP's uit de RES-organen te verwijderen, ongeacht de deeltjesvorm [30, 31]. Over het algemeen biedt in vivo onderzoek naar het HNSCC-model een "proof of concept" dat een effectieve combinatie van 5-FU + ß-lap in een stabiele nanodrager de therapeutische werkzaamheid in de tumor zou kunnen verbeteren terwijl het bijbehorende toxische effect wordt verlicht.

een In vivo antitumorwerking van FNQ-MSN in HNSCC-xenotransplantaatmodel. De muizen met HNSCC-tumoren werden behandeld met 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap en FNQ-MSN in een vaste dosis van 5 mg/kg 5-FU en 10 mg/kg ß-lap intraveneus. voor 3 keer. Het tumorvolume werd genoteerd als onderdeel van de werkzaamheidsanalyse en vergeleken met de niet-behandelde controle. b Lichaamsgewichtanalyse die overeenkomt met tumorvolumegegevens. *p <0,05 en ***p <0,001