Mesoporeuze silicananodeeltjes leveren NQO1-remmer en 5-fluorouracil samen, verbeteren antitumoractiviteit bij hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom

Samenvatting

Hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen (HNSCC) zijn een van de dodelijkste vormen van kanker, en 90% van de oorsprong is van plaveiselcellen. NAD(P)H:chinon oxidoreductase 1 (NQO1), een enzym dat overexprimeerd is in plaveiselcelcarcinoom, speelt een belangrijke rol in proliferatie en chemoresistente. De hoofddoelen waren het bestuderen van het inhibitieve effect van ß-lapachoon (ARQ761 in klinische vorm) in HNSCC en het bestuderen van het combinatie-effect van 5-FU en ß-lap in het verbeteren van de therapeutische effectiviteit in HNSCC. Lipide dubbellaag-geassembleerde mesoporeuze silicananodeeltjes geladen met 5-FU/ß-lap werden bereid en bestudeerd voor hun fysicochemische en biologische eigenschappen. ß-lap toonde een concentratie-afhankelijke inhibitie van NQO1-enzymactiviteit in Cal33-cellen. Opvallend was dat een significant inhibitief effect werd waargenomen bij een dosis van 20-50 μg/ml ß-lap. Combinatie van 5-FU+ß-lap resulteerde in lagere cellevensvatbaarheid; meest opvallend, 5-FU/ß-lap-geladen mesoporeuze silicananodeeltjes (FNQ-MSN) vertoonden aanzienlijk lagere cellevensvatbaarheid in vergelijking met die van elk van de individuele geneesmiddelen of fysieke combinaties. ß-lap resulteerde in een afname van het NQO1-eiwitband in vergelijking met controle; echter, de meest opvallende afname in het NQO1-niveau werd waargenomen in de FNQ-MSN-behandelde celdgroep. FNQ-MSN resulteerde in meer dan 60% celdood (vroege en late apoptose) en een overwegende kernfragmentatie van kankercellen, wat de superieure antikankereffect van een drager-gebaseerd combinatieregime aangeeft. Een opvallende afname in tumorvolume werd waargenomen met de fysieke mengsel van 5-FU+ß-lap; echter, gecombineerde behandeling van drager-gebaseerde 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) vertraagde de tumorgroei significant en verlengde de overleving van tumor-dragende xeno-transplantatie muizen. Deze bevindingen suggereren het potentieel van NQO1-remmer in het verbeteren van het chemotherapeutische potentieel van 5-FU in de behandeling van HNSCC.

Inleiding

Hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen (HNSCC) zijn een van de dodelijkste vormen van kanker en 90% van de oorsprong is van plaveiselcellen [1]. HNSCC is van nature hoog angiogenesis en de vasculatuur exprimeert diverse cytokinen waaronder fibroblaste groeifactoren (FGFs) en vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGFs) die gelinkt zijn aan hogere metastasering en slechte overleving [2]. De incidentie van HNSCC in China is zesde in kankergerelateerde sterfte met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen geregistreerd in 2015 en 77.500 gevallen van overlijden. De algehele 5-jaar overlevingsgraad van HNSCC is erg laag door factoren waaronder agressieve aard, vroege recidief, hoge metastasering en hoge sterfte door slechte prognose [3]. De hoofdbehandelingoptie in HNSCC is chirurgische procedure gevolgd door radiotherapie of chemotherapie. Om specifiek te zijn, chemotherapie als effectief gebruikt in vroege stadia of post-chirurgische stadia zou tumorgroei tegengaan [4, 5]. Effectief gebruik van chemotherapie zal de kankercellen binnen de tumorweefsels uitschakelen en de tumorrecidief remmen. Echter, langdurige chemotherapie gebaseerd op een enkel middel resulteert vaak in medicijnresistentie en verminderde therapeutische effectiviteit [6]. Daarom is het noodzakelijk om innovatieve strategieën toe te passen om de overleving en kwaliteit van leven van HNSCC-patiënten te verbeteren.

Verschillende antikankermiddelen gebruikt in de behandeling van HNSCC omvatten cisplatine, 5-fluorouracil (5-FU), paclitaxel of docetaxel. Onder al deze is 5-fluorouracil (5-FU) ingezet als eerste-lijns therapie in HNSCC en andere plaveiselcelcarcinoom behandelingen [7]. 5-FU is een pyrimidine-analogoon dat werkt door irreversibel de thymidylate synthase binnen de kankercellen te remmen en daarbij de replicatie van DNA te onderdrukken wat resulteert in celdood [8]. Zoals bij alle antikankermiddelen, is 5-FU niet zonder bijwerkingen in de systemische circulatie en veroorzaakt toxiciteit voor normale weefsels, terwijl gerapporteerd wordt dat de combinatie van 5-FU met een secundair middel potentieel de bijwerkingen kan verminderen en de algehele therapeutische effectiviteit in kankerbehandeling kan verbeteren [9].

NAD(P)H:chinon oxidoreductase 1 (NQO1) is een flavoproteïne die verhoogd is in tumorweefsels in het bereik van 100-200-voudig in vergelijking met normale weefsels [10]. De twee-elektron oxidoreductase is een induceerbare fase II ontgiftsingsenzym capabel van chinonen te ontgiften door het vormen van stabiele hydrochinonen [11]. NQO1 blijkt te exprimeren in een laag basaal niveau in normale menselijke weefsels waar het de cellen beschermt tegen redox-cycli en oxidatieve stress en het p53-suppressor stabiel houdt. NQO1 is constitutief overexprimeerd in verschillende kankersoorten waaronder borst, pancreas en plaveiselcelcarcinomen [12]. De overexpressie van NQO1 bevordert de progressie van de kankerlast en maakt de kankercellen meer resistent tegen chemotherapeutische middelen zoals 5-FU of cisplatine (oxidatieve stress inducers) wat NQO1 een potentiële oncotarget maakt om de therapeutische effectiviteit te verbeteren [13]. Het is gerapporteerd dat de knockdown van NQO1 door siRNA het cytotoxische effect van meerdere middelen zoals gemcitabine of doxorubicine versterkte [14]. Behalve dat, zijn diverse synthetische en natuurlijke NQO1-remmers gerapporteerd zoals coumarines of curcumines of ES936 [15, 16, 17]. In deze studie hebben we ß-lapachoon (ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naftho[1,2-b]pyran-5,6-dion) ingezet als NQO1-remmer [18]. ß-lap werkt via een NQO1-afhankelijk mechanisme en creëert een significant aantal reactieve zuurstofsoorten (ROS) wat leidt tot schade aan DNA-strengen en kankerceldood veroorzaakt [19].

Het gebruik van nanodeeltjes voor de systemische afgifte van kleine moleculen wordt een veelbelovende aanpak in kankerbehandeling [20]. Medicijn-geladen nanodeeltjes vereisen minder doseringsschema's en blijken de antikankereffectiviteit te verbeteren en relatief de bijwerkingen te verminderen. Onder alle dragers bezit mesoporeuze silicananodeeltjes (MSN) significant potentieel om de lading effectief naar de tumorweefsels te leveren [21, 22]. De micrometer-grote poriën staan stabiele lading van de geneesmiddelen toe en voorkomen de afgifte in de systemische circulatie en staan preferentiële accumulatie in de lekkende kankerweefsels toe door het verhoogde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR-effect) [23].

Over het algemeen was het hoofddoel van de huidige studie om de therapeutische voordelen van 5-FU en NQO1-remmer te combineren om het antikankereffect in HNSCC te verbeteren. De in vitro antikankereffect werd geanalyseerd met behulp van diverse technieken zoals cellevensvatbaarheid, western blot analyse, flow cytometrie/Hoechst-gebaseerde apoptose-assay en live/dead assay. In vivo studies werden uitgevoerd op het Cal33 tumorcel dragende xeno-transplantatie model.

Conclusie

Samenvattend, we hebben met succes een 5-FU+ß-lap-geladen lipide dubbellaag-gecoate mesoporeuze silicananodeeltjes geformuleerd. We hebben getoond dat (i) antitumor effect van ß-lap op een concentratie-afhankelijke manier in HNSCC tumorcellen, (ii) combinatie van 5-FU+ß-lap resulteert in significante inhibitie van NQO1-eiwit en Bcl-2-eiwit, (iii) combinatie-gebaseerde FNQ-MSN toonde een significante reductie in de tumorlast in HNSCC xeno-transplantatie. Deze gegevens wijzen onmiskenbaar op het feit dat subletale dosis van NQO1-remmer (ß-lap) potentiëel de therapeutische effectiviteit van 5-FU in HNSCC tumoren kan verbeteren en potentiëel uitgebreid kan worden naar de klinische behandeling van andere maligniteiten.

Materialen en Methodes

Bereiding van 5-FU/ß-lap-Geladen Lipide Dubbellaag-Mesoporeuze Silicananodeeltjes

De medicijn-geladen MSN werd bereid door cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) (210 mg) op te lossen in 180 ml water en te koken tot 80 °C, waarna 5-FU en ß-lap werden toegevoegd 20% w/w van de totale nanodeeltjes en vervolgens ammoniumfluoride (NH4F) (30 mg) werd toegevoegd en goed geroerd gedurende 60 min. Vervolgens werd 1,6 ml tetraethylorthosilicaat (TEOS) druppelgewijs toegevoegd gedurende 30 min en continu geroerd gedurende 3 uur. Semi-transparante witte colloïden werden gevormd die na centrifugeren (15 min) bij 10000 toeren/min bij 24 ± 1 °C werden verzameld. De MSN werden heropgelost in ultrapure water, en de centrifugatiecyclus werd 2 keer herhaald. Apart werd een dunne film membraan bereid met DSPE-PEG2000 (2% van het totale MSN-gewicht) en gehydrateerd met water opgeschort met medicijn-geladen MSN. Het mengsel werd onmiddellijk met een ultrasound-probe 5 min gesonicateerd bij 50 W bij kamertemperatuur (25 °C). De PEG-geylde lipide dubbellaag ondersteunde MSN werd ten slotte twee keer gewassen en heropgelost in ultrapure water.

Deeltjesgrootte, Zetapotentiaal Analyse en Morfologie Analyse

De deeltjesdiameter, polydispersiteitsindex (PDI) en zetapotentiaal werden geëvalueerd met behulp van Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). De deeltjes werden geanalyseerd met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) mechanisme en deeltjesdispersies werden goed verdund vóór het experiment. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd bij kamertemperatuur. De morfologie van nanodeeltjes werd bepaald door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) met behulp van CM 200 UT, Philips, MA, VS) bediend bij 100 kV. Kortweg, deeltjesdispersies werden verdund, een druppel werd geplaatst in een 300-mesh TEM-rooster en toegestaan om 10 min te zakken. De deeltjes werden tegengekleurd met 2% fosfo-wolfraamzuur (PTA) als negatieve kleuring, gedroogd aan de lucht en waargenomen onder een TEM-microscoop.

Medicijnlading

Twee manieren medicijnladinganalyse werd uitgevoerd door het berekenen van de niet-geladen of ongebonden medicijn in het supernatans en het medicijn geladen in het nanodeeltje. De medicijnladingsefficiëntie werd uitgevoerd met HPLC-methode. De HPLC was uitgerust met Shimadzu LC-20 AD PLC-pomp en SPD-M20A PDA-detector en analysesoftware Shimadzu LC met omgekeerde fase C18-kolom (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 μm). De mobile fase voor 5-FU bestaat uit een mengsel van acetonitrile en water (10:90, v/v) en gepompt met een snelheid van 1 ml/min. De detectiegolflengte ingesteld op 265 nm voor 5-FU. De mobile fase voor ß-lap bestaande uit acetonitrile/water (31:69, v/v) en detectiegolflengte ingesteld op 254 nm bij 35 °C. De ladingscapaciteit (LC) en ladingsefficiëntie (LE) van 5-FU/ß-lap werden berekend met de respectieve formule.

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)={W}_{t\mathrm{otal}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}-{W}_{\mathrm{free}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}/{W}_{\mathrm{total}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}\times 100 $$

$$ \mathrm{LC}\ \left(\%\right)={W}_{\mathrm{total}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}-{W}_{\mathrm{free}\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}/{W}_{\mathrm{total}\ \mathrm{NP}\ \mathrm{massa}}\times 100 $$

Medicijnvrijkwaringsstudie

De vrijkwarings van 5-FU en ß-lap werd geëvalueerd in PBS (pH 7,4) en ABS (pH 5,0) bij 37 °C met behulp van de dialysemethode. Kortweg, 1 mg equivalent van elk medicijn-geladen nanodeeltje werd geladen in een dialysemembraan in 1 ml van respectieve buffer en de uiteinden zijn verzegeld. Het verzegelde dialysemembraan werd geplaatst in 25 ml van respectieve ABS en PBS buffer en geplaatst in een schuddend waterbad bij 37 °C. Monsters werden verzameld op vooraf vastgelegde tijdsintervallen en vervangen door een gelijk volume van vers buffer. De hoeveelheid medicijn vrijgekomen in de respectieve buffer werd geëvalueerd door de HPLC-methode zoals beschreven in de eerdere sectie.

Celkweek en NAD(P)H:Chinon Oxidoreductase 1 (NQO1) Activiteitsassay

De Cal33 HNSCC-cel werd gekweekt in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% FKS en 1% antibioticamengsel. De cellen werden gehandhaafd in omgevingsomstandigheden in een incubator. Voor NQO1-activiteitsassay werden Cal33-cellen gezaaid in een 96-putplaat met een zaaidichtheid van 8 × 10³ cellen per put en overnacht geïncubeerd. De cellen werden behandeld met verschillende concentraties van ß-lap en 24 uur geïncubeerd. 0,8% digitonine (50 μl van 2 nM EDTA) werd gebruikt om de cellen te lyseren en de assay werd uitgevoerd met menadiol en MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) als een substraat koppelingsreactie en activiteit gemeten bij 620 nm. De assay werd in drievoud uitgevoerd.

In Vitro Cellevensvatbaarheidsassay

Cellevensvatbaarheidsassay van ß-lap in toenemende concentratie en cellevensvatbaarheidsassay van individueel en combinatie-regime werden getest door een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Kortweg, Cal33-cellen werden gezaaid in een 96-putplaat met een zaaidichtheid van 1 × 10⁴ cellen per put en overnacht geïncubeerd. De volgende dag werden cellen behandeld met een toenemende concentratie van ß-lap, apart; cellen werden behandeld met individueel en combinatie-regime van 5-FU en ß-lap bij een basale concentratie van 5, 10 en 20 μg/ml en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden tweemaal gewassen en behandeld met MTS-oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant. De cellevensvatbaarheid werd berekend ten opzichte van onbehandelde cellen, en een microplaatlezer werd gebruikt voor absorbantie bij 460 nm.

Western Blot Analyse

De gezaaide cellen in een 6-putplaat werden behandeld met toenemende concentratie van ß-lap, apart; cellen werden behandeld met individueel (5-FU of ß-lap) en combinatie-regime van 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden geoogst, gelyseerd (M-per buffer), gecentrifugeerd, en het supernatans met eiwit werd verzameld. De eiwitconcentratie in de cell lysaat werd geëvalueerd met de bicinchoninezuur (BCA) methode. 10% Bis-Tris polyacrylamidgeel werd gebruikt om de eiwitten te scheiden en onmiddellijk overgebracht naar een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan. Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk bereid in n Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer met Tween 20 (TBST, pH 7,2). Primaire antilichamen van konijn polyclonaal NQO1 (1:1000), muis monoclonaal Bcl-2 (1:1000) en muis monoclonaal GAPDH (1:1000) werden overnacht bij 4 °C op het membraan geïncubeerd. Het membraan werd gewassen met TBST en vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen (anti-muis of anti-konijn IgG) bij een verdunning van 1:10000. Het membraan werd opnieuw gewassen met TBST en blots werden blootgesteld aan ECL substraatoplossing en densiteiten van de eiwitbanden werden geëvalueerd met fotontwikkelaar.

Apoptose en Hoechst Assay

Cal33-cellen werden gezaaid in een 6-putplaat met een zaaidichtheid van 2 × 10⁵ cellen per put en overnacht geïncubeerd. De cellen werden vervolgens behandeld met individueel (5-FU of ß-lap) en combinatie-regime van 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden geoogst, gewassen, gecentrifugeerd, en gepelleteerd. De cellen werden behandeld met 2,5 μl annexine V en 2,5 μl PI en 15 min geïncubeerd in donkere omstandigheden. De cellen werden vervolgens op 1 ml gebracht en geëvalueerd met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS, BD, FACSverse). In totaal werden 10.000 cellen geanalyseerd. Vergelijkbare procedure voor celzaaiing en medicijnbehandeling werd gevolgd en vervolgens gekleurd met Hoechst 33342 kleurstof (10 μg/ml) en 10 min geïncubeerd. De cellen werden gewassen en vastgelegd met 4% paraformaldehyde (PFA) en opnieuw gewassen. De celmorfologie werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop (Nikon A1, Japan).

Antitumor Effectiviteit van FNQ-MSN IN HNSCC Xeno-transplantatie Tumor Model

Achttien- tot tweeëntwintig-gram mannelijke BALB/c muizen gemiddeld 4-5 weken oud werden verkregen van het In-House Dierenfaciliteitscentrum van Zhengzhou Universiteit van Lichte Industrie, Henan. De dieren werden gehandhaafd in een geconditioneerde kamer met een 12 uur donker-licht cyclus en gegeven vrije toegang tot voedsel en water. Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door de Ethiekcommissie van Zhengzhou Universiteit van Lichte Industrie, Henan. Om een xeno-transplantatie model te vestigen, werden 1 × 10⁷ Cal33 cellen in 150 μl kweekmedium in de rechter heup van de muis subcutane geïnjecteerd. Toen de gemiddelde tumoromvang 80-100 mm3 bereikte, werden de muizen willekeurig verdeeld in 5 groepen voor controle, 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap en FNQ-MSN, respectievelijk met 8 muizen in elke groep. De 5-FU werd toegediend bij een vaste dosis van 5 mg/kg en ß-lap bij een vaste dosis van 25 mg/kg en 3 keer toegediend met een interval van 3 dagen voor elke staartvieninjectie. Muisgewicht en tumorvolume werden regelmatig gemonitord gedurende 18 dagen. Het tumorvolume werd berekend met de formule:

$$ V\ \left({\mathrm{mm}}^3\right)={\mathrm{Breedte}}^2\ \left({\mathrm{mm}}^2\right)\times \mathrm{Lengte}\ \left(\mathrm{mm}\right)/2 $$

De huidige studie observeerde geen muisdood door tumorcelbelading en alle dieren werden gedood met CO₂ en vervolgens geofferd door cervicale dislocatie aan het einde van de studie.

Statistische Analyse

Meerdere groepen werden vergeleken met behulp van tweeweg variantieanalyse (ANOVA). Significantieniveau van p < 0,05 werd als significant beschouwd en alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie tenzij anders specifiek vermeld in de respectieve experimenten.

Resultaten en Discussie

Bereiding van 5-FU/ß-lap-Geladen Lipide Dubbellaag Ondersteunde Mesoporeuze Silicananodeeltjes

In deze studie hebben we een mesoporeuze silicananodeeltje aangepast dat gestabiliseerd wordt door een PEG-geylde lipide dubbellaag. De 5-FU/ß-lap-geladen MSN werd bereid door de emulsie-sonicatiemethode, en vervolgens werd medicijn-geladen MSN geïntroduceerd in de fles met een lipide dunne film bestaande uit DSPE-PEG2000. Het mengsel werd gesonicateerd en het lipide-gecoate MSN met 5-FU/ß-lap werd verkregen (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Ladingsefficiënties (LE) van 5-FU en ß-lap waren respectievelijk 91,5 ± 1,65% en 92,9 ± 1,24%. De FNQ-MSN vertoonde een 8,1 ± 1,12 wt% van 5-FU en 7,6 ± 0,95 wt% van ß-lap, wat de hoge ladingscapaciteit (LC) van de MSN-drager aangeeft. De aanwezigheid van de lipide dubbellaag zal de ongewilde afgifte in de systemische circulatie voorkomen en daarbij de toxiciteit voorkomen. De gemiddelde deeltjesgrootte van medicijn-geladen MSN was 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) terwijl de assemblage van de lipide dubbellaag op het MSN-oppervlak (FNQ-MSN) de gemiddelde deeltjesgrootte verhoogde tot 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115), wat een solide aanwezigheid van lipide materialen op het oppervlak van MSN aangeeft (Fig. 1b). Het zetapotentiaal veranderde van −18,2 ± 1,22 tot −26,4 ± mV. De kleine deeltjesgrootte van FNQ-MSN zal de preferentiële accumulatie van medicijn-geladen drager in de lekkende tumorweefsels toestaan op basis van het EPR-effect. Daarnaast zal de oppervlakte PEG-ylatie de uitstekende stabiliteit en verlengde bloedsomlooptijd verlenen die de kansen van FNQ-MSN in de tumorweefsels verder zal verhogen. TEM-beeld toonde een morfologische gelijkenis met dat van liposoom en presenteerde een perfecte sferische vorm uniform verdeeld op het rooster. TEM-beeld toonde duidelijk een grijsachtige buitenlaag en donkere kern aan wat de aanwezigheid van lipide-assemblage op het MSN-oppervlak aangeeft (Fig. 1c). De grootte waargenomen uit TEM bevestigt de DLS deeltjesgrootte van een zetasizer. MSN bezitten goed-geordende kanalen voor de homogene distributie van medicijnmoleculen. De oppervlakte-eigenschap van poriën is een van de belangrijke factoren in de stabiele lading van kleine moleculen. De verschillende fysieke krachten betrokken bij de gast-heer interactie omvatten voornamelijk hydrofobe krachten en van der Waals interactiekrachten. De hogere medicijnladingscapaciteit zal de hogere intracellulaire concentratie en hogere dodefficiëntie in de tumorlocaties bieden. De FNQ-MSN vertoonde uitstekende stabiliteit in het PBS-medium en de deeltjesgrootte bleef onveranderd gedurende de studieperiode tot 30 dagen. Zo'n verbeterde stabiliteit van het dragersysteem en hoge ladingscapaciteit van het dragersysteem zal de biodistributie en efficiëntie in de tumorbehandeling verbeteren.

Figuur 1. a Schematische presentatie van de constructie van 5-FU en ß-lap-geladen lipide dubbellaag-gecoate mesoporeuze silicananodeeltjes. Twee geneesmiddelen zijn geladen in de poriën van de MSN die verder gestabiliseerd werden door de PEG-geylde lipide dubbellaag assemblages op het buitenoppervlak van MSN. b Deeltjesgrootteverdeling van FNQ-MSN. c TEM-beeld van FNQ-MSN met een inset van hogere vergroting

In Vitro Medicijnvrijkwarings

De in vitro medicijnvrijkwarings van 5-FU en ß-lap uit FNQ-MSN werd bestudeerd in PBS en ABS (Fig. 2). Zoals getoond, werden twee verschillende vrijkwarings-trends waargenomen in pH 7,4 en pH 5,0. Bijvoorbeeld, 25% van 5-FU vrijgekomen in 24 uur in pH 7,4 in vergelijking met ~40% medicijnvrijkwarings in pH 5,0 in 24 uur. Op dezelfde manier werden 20% en 30% van ß-lap vrijgekomen in pH 7,4 en pH 5,0, respectievelijk. De vrijkwaringskinetiek was identiek gedurende de studieperiode met 50% van 5-FU vrijgekomen in alkalische buffer en 80% medicijnvrijkwarings bij pH 5,0 na 72 uur studieperiode. Een pH-responsieve vrijkwarings van medicijn in zuure omstandigheden is voordelig voor de kankerbehandeling. Geen burst-vrijkwaringsfenomeen werd waargenomen in beide pH-omstandigheden, hoofdzakelijk toegeschreven aan de aanwezigheid van de DSPE-PEG-laag die de vrijkwarings van het medicijn uit de FNQ-MSN gedurende de studieperiode controleerde. Significante verschil in medicijnvrijkwarings werd waargenomen tussen pH 7,4 en pH 5,0 omstandigheden. Bij pH 7,4 omstandigheden, vertoont PEG-b-DSPE een hoge stealth-laageigenschap waardoor de vrijkwarings van de geencapsuleerde stof wordt voorkomen. Het huidige resultaat toonde aan dat de medicijnvrijkwarings versnelde bij pH 5,0, wat de demontage van de beschermende schil rondom het MSN-oppervlak aangeeft. De pH-gevoelige medicijnvrijkwaringsnelheid, die maximale medicijnvrijkwarings binnen de kankercellen garandeert, kan de antitumor effectiviteit verbeteren en ongewilde toxiciteit voor normale weefsels verminderen. Het is mogelijk dat in de aanwezigheid van een pH-responsief element, FNQ-MSN kan resulteren in het afstoten van de lipide dubbellaag op de MSN wat resulteert in verhoogde vrijkwarings in de lagere pH-omstandigheden.

Figuur 2. In vitro vrijkwarings van 5-FU en ß-lap uit FNQ-MSN in pH 7,4 en pH 5,0 bufferomstandigheden. De vrijkwaringsstudie werd voortgezet tot 72 uur, en medicijnvrijkwarings werd gekwantificeerd met HPLC-methode. **p < 0,01

Gevoeligheid van NQO1 voor ß-lap

Omdat de upregulatie van NQO1 in veel kankercellen inclusief HNSCC geassocieerd is met slechte prognose en slechte therapeutische uitkomst, kunnen middelen die NQO1 targeten een potentiële strategie zijn voor kankerbehandeling [24]. NQO1 is overexprimeerd in het niveau variërend van 100- tot 200-voudig in plaveiselcelcarcinoom in vergelijking met dat geassocieerd met normale weefsels. Daarom werd ß-lap invloed op de NQO1-enzymactiviteit bestudeerd in Cal33-cellen. Zoals getoond, toonde ß-lap een concentratie-afhankelijke inhibitie van NQO1-enzymactiviteit in Cal33-cellen (Fig. 3a). Opvallend was dat een significant inhibitief effect werd waargenomen bij een dosis van 20-50 μg/ml ß-lap. Verder werd het inhibitieve potentieel van ß-lap op NQO1-eiwit verder bestudeerd door western blot analyse (Fig. 3b). Resultaten onthulden duidelijk de significante afname in het NQO1-eiwit in de kankercellen met een toename in de concentratie van ß-lap. Ongeveer 80% NQO1-inhibitie werd waargenomen bij 100 μg/ml ß-lap. NQO1-bioactiveerbare medicijnen zoals ß-lap worden gemetaboliseerd door NQO1 en vormen een onstabiele hydrochinon-stof die onmiddellijk terugkeert naar het oorspronkelijke component, achterlatend 2 een-elektron oxidaties en 2 O²⁻ consumerend. Dit zal een futiele redox-cyclus creëren waarin 1 molecuul ß-lap 130 mol superoxide zal genereren ten koste van het consumeren van 60-70 mol NAD(P)H6. De zo-gevormde superoxide (O2.−) radicalen zullen geconverteerd worden tot waterstofperoxide (H2O2−) en zullen celdood en apoptose veroorzaken [25].

Figuur 3. a Effect van concentratie-afhankelijke activiteit van ß-lap op de NQO1-activiteit van Cal33 kankercellen door de enzymatische methode. b Effect van concentratie-afhankelijke activiteit van ß-lap op de NQO1-eiwitniveaus door western blot analyse met GAPDH als huishoudend eiwit

In Vitro Antikankereffect van FNQ-MSN in HNSCC Cellen

De in vitro antikankereffect van ß-lap in Cal33-cel werd bestudeerd door MTT-assay. Resultaten onthulden dat ß-lap een typische concentratie-afhankelijke afname in cellevensvatbaarheid vertoonde (Fig. 4a). Opvallend was dat een significante afname in cellevensvatbaarheid werd waargenomen bij een concentratie van 50 μg/ml. Voor verdere experimenten werd 20 μg/ml geselecteerd (onder de IC50-waarde van ß-lap). Vervolgens werd het potentiële effect van ß-lap op 5-FU bestudeerd bij 3 verschillende concentraties (5, 10 en 20 μg/ml). Zoals getoond, resulteerde combinatie van 5-FU+ß-lap in lagere cellevensvatbaarheid; meest opvallend, FNQ-MSN vertoonde aanzienlijk lagere cellevensvatbaarheid in vergelijking met die van elk van de individuele geneesmiddelen of fysieke combinaties (Fig. 4b). Bijvoorbeeld, 5-FU en ß-lap toonden een cellevensvatbaarheid van 35,7% en 70,2% terwijl 5-FU+ß-lap 26,5% toonde en FNQ-MSN 13,1%, respectievelijk. Resultaten toonden duidelijk aan dat het cytotoxische effect van 5-FU significant verhoogd werd wanneer gecombineerd met ß-lap. Het is de moeite waard om op te merken dat FNQ-MSN effectiever was in vergelijking met 5-FU+ß-lap, toegeschreven aan de betere internalisatie en gecontroleerde vrijkwarings van geladen therapeutica uit het dragersysteem. Resultaten onthullen duidelijk het inhibitieve effect van ß-lap op NQO1-enzymactiviteit en eiwitniveaus en versterkten het antikankereffect van 5-FU en resulteerden in verbeterde therapeutische uitkomst in de behandeling van HNSCC.

Figuur 4. a Effect van concentratie-afhankelijke activiteit van ß-lap op de cellevensvatbaarheid van Cal33-cellen. b Cytotoxisch effect van individueel en combinatie met tweede chemotherapeutisch middel, 5-FU bij 3 verschillende concentraties van 5-20 μg/ml, respectievelijk. De cellevensvatbaarheid werd geëvalueerd door MTT-assay na 24 uur incubatie. c Western blot analyse van NQO1 en Bcl-2 eiwitexpressie na behandeling met individueel en combinatie van 5-FU en ß-lap

FNQ-MSN Rol in de Signaalroutes: Western Blot Analyse

Het mechanisme van het ß-lap-gemedieerde cytotoxische effect werd verder verkend door western blot analyse. Zoals getoond, resulteerde ß-lap in een afname in het NQO1-eiwitband in vergelijking met controle; echter, de meest opvallende afname in het NQO1-niveau werd waargenomen in de FNQ-MSN-behandelde celdgroep (Fig. 4c). De ß-lap-geïnduceerde versterking van de chemosensititeit van Cal33 door het verbeteren van de celdood werd geëvalueerd door het Bcl-2-eiwitniveau. De Bcl-2-familie speelt een belangrijke rol in de regulatie van de celhomeostase en controleert de proliferatie en dood van kankercellen. Het proces van afname van Bcl-2 en toename van Bax resulteert in het vrijmaken van cytochroom C in het cytoplasma dat de hele caspase-cascades initieert wat resulteert in celdood [26]. Resultaten benadrukten duidelijk dat de combinatie van 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) de Bcl-2 significant downreguleerde wat de versterkte antikankereffect in de Cal33-kankercellen aangeeft.

Apoptose Analyse van HNSCC

Volgend de cellevensvatbaarheidsanalyse, werd het apoptose-effect van individueel en gecombineerd medicijn op Cal33-cellen geëvalueerd door flow cytometrie na annexine V/PI-kleuring (Fig. 5). Het apoptose-effect van individueel 5-FU (10 μg/ml) of ß-lap (30 μg/ml) resulteerde niet in enige apreciabele apoptose van kankercellen; echter, 5-FU+ß-lap resulteerde in een dramatische toename in de apoptose-fractie van kankercellen. Belangrijk, FNQ-MSN resulteerde in meer dan 60% celdood (vroege en late apoptose) wat de superieure therapeutische effect van drager-gebaseerd combinatieregime aanduidt. Apoptose-effect werd verder bevestigd door Hoechst 33342-kleuring. Zoals getoond, resulteerden cellen behandeld met FNQ-MSN in een hogere hoeveelheid cellen die apoptose ondergingen, kerncondensatie en fragmentatiekenmerken in vergelijking met die van zowel 5-FU als ß-lap alleen (Fig. 6). Tijdens het apoptose-proces krimpen cellen zonder beschadigd te worden in de buitenste celmembraan en resulteren in chromatine-condensatie met verhoogde apoptotische lichaamsvorming.

Figuur 5. Flow cytometrie analyse van Cal33-cellen met dubbele kleuring van annexine V en PI na behandeling met individueel en combinatie van 5-FU en ß-lap. 10.000 evenementen werden geregistreerd in de flow cytometer

Figuur 6. Kernmorfologie analyse van Cal33-cellen na kleuring met Hoechst 33342; cellen behandeld met individueel en combinatie van 5-FU en ß-lap. 10.000 evenementen werden geregistreerd in de flow cytometer

Live/Dead Assay

Het antikankereffect van individueel en gecombineerd medicijn werd verder geëvalueerd door de Live/Dead assay. De behandelde cellen werden onderworpen aan Calcein AM en ethidiumbromide-kleuring als respectieve marker van levende en dode cellen (Fig. 7). Zoals getoond, onbehandelde cellen zijn gekleurd met 100% groene fluorescentie. De individuele geneesmiddelen, 5-FU (10 μg/ml) of ß-lap (30 μg/ml) toonden wel licht rode fluorescentie gekleurde cellen; echter, de overgrote meerderheid van cellen vertoonde groene fluorescentie wat beperkte celdood aangeeft. Opvallende celdood werd waargenomen in FNQ-MSN-behandelde kankercellen zoals getoond door overwegende rode fluorescentie en minder groene fluorescentie gekleurde cellen. Het hogere antikankereffect van FNQ-MSN werd toegeschreven aan de synergistische activiteit van 5-FU en ß-lap in de kankercellen en de capaciteit van ß-lap om de chemosensititeit van 5-FU te verhogen.

Figuur 7. Live/dead analyse van Cal33-cellen met dubbele kleuring van Calcein AM en ethidiumbromide na behandeling met individueel en combinatie van 5-FU en ß-lap

In Vivo Antitumor Effectiviteit van FNQ-MSN Tegen HNSCC Xeno-transplantatie Model

Om de effectiviteit van het combinatieregime in een diermodel verder te evalueren, werd HNSCC xeno-transplantatie bereid en toegediend met 5 mg/kg van 5-FU en 10 mg/kg van ß-lap, respectievelijk. De farmaceutische graad van ß-lap is ARQ761 wat momenteel in fase I klinische proef is voor de behandeling van metastaserende maligniteiten. ß-lap heeft de limiet gesteld voor de maximaal draagbare dosis in mensen volgens de preklinische studies [27]. Hiermee in gedachten, hebben we optimaal een dosis van 10 mg/kg ß-lap geselecteerd voor de in vivo studies. Zoals getoond, werd geen significante afname in tumorvolume waargenomen met individueel toegediende 5-FU en ß-lap in vergelijking met niet-behandelde controle (Fig. 8a). Een opvallende afname in tumorvolume werd waargenomen met een fysieke mengsel van 5-FU+ß-lap; echter, gecombineerde behandeling van drager-gebaseerde 5-FU en ß-lap (FNQ-MSN) vertraagde de tumorgroei significant en verlengde de overleving van tumor-dragende xeno-transplantatie muizen. Het tumorvolume grafiek van FNQ-MSN kon in twee delen worden verdeeld; onbetekenende groei in tumorvolume werd waargenomen tot dag 9 terwijl de tumor significant toenem na dag 9 tot dag 18, niettemin, was het algehele tumorvolume manifold kleiner in vergelijking met controle of andere groepen. De toxiciteitszorgen van het individueel en combinatieregime werd geëvalueerd in termen van lichaamsgewicht (Fig. 8b). Zoals getoond, resulteerde fysieke mengsel van 5-FU+ß-lap in ernstige toxiciteit vertegenwoordigd door meer dan 10% verlies in lichaamsgewicht terwijl 5-FU resulteerde in 5% lichaamsgewichtsverlies. Zoals verwacht, resulteerde FNQ-MSN niet in enig verlies van lichaamsgewicht wat het unieke voordeel van het lipide-MSN-gebaseerde dragersysteem aangeeft. De versterkte antitumor effect van FNQ-MSN werd toegeschreven aan het inhibitieve effect van ß-lap tegenover het NQO1-enzym en eiwit wat op zijn beurt de chemosensititeit van 5-FU verhoogde en resulteerde in synergistische antikankereffect in de Cal33 humane tumoren, tweede, lipide dubbellaag-gecoate MSN beschermde het medicijn tijdens de systemische circulatie en kan op een gecontroleerde manier vrijkomen in het tumorweefsel, derde, PEG-ylatie van nanodrager kan de bloedsomlooptijd verlengen wat toelaat voor preferentiële accumulatie in de tumorweefsels dankzij EPR-effect [28, 29]. PEG-geylde MSN werden hoofdzakelijk vastgehouden in RES van de lever, milt en long, wat meer dan 80% van de toegediende dosis uitmaakte. PEG-modificatie van MSN verminderde de clearance-snelheid van MSN in organen duidelijk, wat aantoont dat de PEG-geylde NP's moeilijker te verwijderen waren uit de RES-organen ongeacht de deeltjesvorm [30, 31]. Over het algemeen biedt de in vivo studie op HNSCC-model een "bewijs van concept" dat effectieve combinatie van 5-FU+ß-lap in stabiele nanodrager de therapeutische effectiviteit in tumor kan verbeteren terwijl de geassocieerde toxische effecten worden verlicht.

Figuur 8. a In vivo antitumor effectiviteit van FNQ-MSN in HNSCC xeno-transplantatie model. De muizen met HNSCC tumoren werden behandeld met 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap en FNQ-MSN bij een vaste dosis van 5 mg/kg van 5-FU en 10 mg/kg van ß-lap intraveneus voor 3 keer. Tumorvolume werd genoteerd als onderdeel van effectiviteitsanalyse en vergeleken met niet-behandelde controle. b Lichaamsgewicht analyse corresponderend met tumorvolume data. *p < 0,05 en ***p < 0,001

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

Alle gegevens gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en de bijbehorende supplementaire informatiebestanden.

Afkortingen

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect (verhoogde permeabiliteit en retentie-effect)

FNQ-MSN:

5-FU/ß-lap-geladen mesoporeuze silicananodeeltjes

HNSCC:

Hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen

MSN:

Mesoporeuze silicananodeeltjes

NQO1:

NAD(P)H:chinon oxidoreductase 1

ß-lap:

ß-lapachoon