Betaalbare groen-fluorescerende koolstofkwantumdeeltjes: verbeterde bio-imaging en gerichte medicijnafgifte

Samenvatting

Doxorubicine-bevattende koolstofkwantumdeeltjes (DOX-CDs) zijn ontwikkeld voor bio-imaging en verbeterde intracellulaire medicijnafgifte. De CDs werden gesynthetiseerd via de hydrothermale methode met citraat en ureum bij 200 °C gedurende 1 uur. Vervolgens werd DOX succesvol geconjugeerd aan de CDs via fysicochemische interacties. De DOX-CDs vertoonden een goede kristalstructure, opmerkelijke waterstabiliteit, uitstekende fotoluminescentie-eigenschappen en een hoge kwantumopbrengst van 93%. Fluorescerende afbeelding toonde aan dat de DOX-CDs gemakkelijk door kankercellen worden opgenomen voor cellabeling. Bovendien werd een endo-lysosomaal pH-ondersteunde DOX-vrijgifte waargenomen, en de cytotoxiciteit van DOX-CDs werd bevestigd via de MTS-test tegen HO-8910 eierstokkankercellen. In dierproeven lieten de CDs een helder fluorescerend signaal zien en vertoonden ze lage toxiciteit na 7 en 21 dagen. De bereide CDs zijn veelbelovend als imaging-probe voor biomedische toepassingen en intracellulaire medicijnafgifte.

Inleiding

Doxorubicine (DOX) is een anthracyclene chemotherapeuticum dat breed wordt gebruikt bij diverse kankersoorten, waaronder borst-, long-, maag-, eierstok-, schildklierkanker, multipeel myeloom, sarcoom en kinderkanker. Het werkingsmechanisme berust op het belemmeren van DNA-synthese en -reparatie, waarvoor DOX de celkern moet bereiken. Vrij DOX kan de celkern moeilijk benaderen en veroorzaakt ernstige cardiotoxiciteit, wat de klinische toepassing beperkt.

Multifunctionele nanodragers zoals liposomen, micellen en koolstofkwantumdeeltjes (CDs) hebben grote aandacht gekregen voor kankermedicijnafgifte. CDs, ontdekt in 2004, zijn populair vanwege hun kleine afmetingen (<10 nm), hoge fotostabiliteit, brede excitatiespectra, instelbare emissie, goede biokompatibiliteit, lage toxiciteit en uitstekende fluorescentie. Eerdere synthetisemethoden (top-down en bottom-up) hadden nadelen als complexe processen, dure materialen en het gebruik van toxische organische oplosmiddelen. Bovendien emitteerden de meeste CDs blauwe fluorescentie onder UV-licht, wat hun toepassing in biomedische imaging hindert door sterke weefsel-autofluorescentie.

In deze studie werden groen-fluorescerende CDs gesynthetiseerd via een groene, efficiënte éénstaps thermische pyrolyse van natriumcitraatdihydraat en ureum. DOX werd niet-covalent geconjugeerd via hydrophobe interacties, elektrostatische interacties en π-π stackingsinteracties. Morfologie, structuur, optische eigenschappen, medicijnvrijgifte, cellulair opname, anticancereffect, in vivo imaging en lange-termijn toxiciteit werden uitgebreid onderzocht.

Materialen en methoden

Materialen

Alle chemicaliën waren van analytische graad. HO-8910 eierstokkankercellen en EA.hy926 endotheelecellen werden verkregen via de Chinese Academy of Sciences. DOX·HCl afkomstig van Sigma-Aldrich.

Synthese van CDs en DOX-CDs

Natriumcitraatdihydraat (0,2 mmol) en ureum (5 mmol) werden opgelost in 1 ml DI-water, gecarboniseerd bij 200 °C gedurende 1 uur, en gezuiverd door centrifugatie met water/aceton. DOX·HCl (0,5 mg) werd 48 uur in het donker gerold met CDs (5 mg/ml), gevolgd door dialyse (MWCO 1000 Da) gedurende 24 uur. Het product werd vriesgedroogd en bewaard bij 4 °C.

Karakterisering

TEM, UV-vis, fotoluminescentie (PL), FTIR, XPS en zetapotentiaalmetingen werden uitgevoerd. Kwantumopbrengst bepaald met kinine sulfaat als referentie.

In vitro medicijnvrijgifte

Dialysemethode in PBS (pH 7,4 en 5,0) bij 37 °C. Vrijgegeven DOX gemeten via fluorescentie bij 590 nm.

Cytotoxiciteit en cellulaire opname

MTS-test op HO-8910 en EA.hy926 cellen. Fluorescentiemicroscopie na 4-uurs incubatie met DOX-CDs.

In vivo imaging en toxiciteit

Balb/c naakte muizen voor subcutane en intraveneuze injectie. Fluorescentie-imaging met Tanon-5200 systeem. Kunming muizen voor histologische analyse na 7 en 21 dagen (H&E-kleuring).

Resultaten en discussie

Karakterisering van CDs en DOX-CDs

TEM toonde uniforme, sferische CDs met gemiddelde diameter van 2,75 nm en duidelijke kristallijne roosterfranjes. FTIR bevestigde –OH, –COOH en N–H groepen op het oppervlak. UV-vis toepico's bij 410 nm (CDs) en 500 nm (DOX); DOX-CDs toonden beide pieken, bevestigend conjugatie. Onder UV-licht vertoonden DOX-CDs helder groene fluorescentie. Kwantumopbrengst was 93% (referentie kinine sulfaat 54%). PL-emissie was excitatie-onafhankelijk (piek bij 525 nm bij excitatie 400 nm). XPS toonde C, N, O (atoomverhouding 78,39%, 7,52%, 14,1%) met bindingenergieën consistent met C–C, C–N, C–O/C=O. CDs bleken stabiel bij 4 °C en kamertemperatuur (<10% intensiteitsverlies in 2 weken), in pH 3–10, en vertoonden uitstekende fotobleaching-resistentie ten opzichte van CdTe-kwantumdeeltjes en DAPI. Zetapotentiaal: CDs −31,1 mV, DOX-CDs −9,7 mV, bevestigend complexvorming. Encapsulatie-efficiëntie maximaal 50,82% (lading 6,82% bij 0,1 mg/ml DOX).

In vitro medicijnvrijgifte

DOX-vrijgifte was pH-afhankelijk: bij pH 7,4 slechts 13% in 8 uur; bij pH 6,0 >35%; bij pH 5,0 >65%. Dit wijst op protonering van –NH₂ groepen op DOX in zuur milieu, wat prematuur lekkage in bloedbaan voorkomt en intracellulaire vrijgifte bevordert.

Cytotoxiciteit

CDs toonden uitstekende biokompatibiliteit: >85% celviabiliteit tot 5 mg/ml op beide celtypen. DOX-CDs vertoonden concentratie-afhankelijke cytotoxiciteit op HO-8910 cellen, significant effectiever dan vrije CDs boven 0,05 mg/ml DOX.

Cellulaire opname en labeling

Fluorescentiemicroscopie toonde groene fluorescentie (CDs) in cytoplasma en rode fluorescentie (DOX) in celkernen, wat endo-lysosomaal pH-gestuurde DOX-vrijgifte en nucleaire targeting bevestigt.

In vivo imaging

Subcutane injectie leverde helder groen fluorescerend signaal op injectieplaats, wat doordringing door hud en weefsel aantoont. Intraveneuze injectie toonde sterke fluorescentie in nieren en blaas, met piek in nieren na 0,5 uur en toename in blaas na 1 uur, wat nierlijke excretie bevestigt.

Lange-termijn toxiciteit

Histologische analyse (H&E) van hart, long, nier, lever en milt na 7 en 21 dagen toonde geen orgaanschade of inflammatoire letsels, wat de veiligheid voor klinische toepassing ondersteunt.

Conclusie

Een kosteneffectieve methode leverde groen-fluorescerende CDs met 93% kwantumopbrengst voor bio-imaging en gerichte medicijnafgifte. DOX-CDs vertonen goede kristalstructuur, waterstabiliteit, fotoluminescentie, pH-gevoelige medicijnvrijgifte, effectieve celremming, uitstekende cellabeling, in vivo fluorescentie en lage toxiciteit. De CDs zijn veelbelovend voor biomedische imaging en intracellulaire medicijnafgifte.