De kosteneffectieve bereiding van groene fluorescerende koolstofstippen voor bio-imaging en verbeterde intracellulaire toediening van geneesmiddelen

Resultaten en discussie

Karakterisering van cd's en DOX-cd's

CD's werden bereid door middel van een eenstapsstrategie met behulp van natriumcitraatdehydraat en ureum (natriumcitraatdehydraat / ureum =1/25) bij 200 ° C gedurende 1 uur. DOX werd covalent geconjugeerd op het oppervlak van bereide CD's voor medicijnafgifte (schema 1). Zoals getoond in de TEM-afbeelding (Fig. 1a), vertoonden de CD's een uniforme bolvormige morfologie met een gemiddelde diameter van 2, 75 nm en een relatief smalle grootteverdeling. Bovendien kon de kristalstructuur van cd's worden waargenomen door het TEM-beeld met hoge resolutie (inzet van figuur 1a), wat wijst op goed kristallijn met merkbare roosterranden.

Schematische voorbereiding van cd's (a ) en DOX-CD's (b )

Kenmerken van cd's. een TEM-afbeeldingen van cd's (inzet TEM-afbeeldingen met hoge resolutie). b Grootteverdeling van cd's. c UV-vis absorptie van DOX, CD's en DOX-CD's en inzetfoto's tonen de CD's onder natuurlijk licht en UV-licht. d FTIR-spectra van cd's en e De PL-emissie van cd's met excitatiegolflengten van 340 nm tot 440 nm in stappen van 20 nm. v XPS-spectrum van cd's

De chemische structuur van cd's werd gekarakteriseerd door FTIR-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 1d, zijn de scherpe pieken bij 3499 cm ⁻¹ en 1729 cm ⁻¹ toegewezen aan respectievelijk –OH en –COOH, terwijl die op 780 cm ⁻¹ en 1372 cm ⁻¹ kan worden toegeschreven aan N-H. Er kan worden geconcludeerd dat zowel carboxyl- als aminogroepen op het oppervlak van de koolstofstippen voorkomen als functionele groepen en biologische macromoleculen met specifieke functies modificeren, wat een mogelijkheid biedt voor verder toepassingsonderzoek van de koolstofstippen.

Verder werden de optische eigenschappen van cd's onderzocht met behulp van UV-vis-absorptie en PL-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 1c vertoonden de CD's een absorptiepiek bij 410 nm en DOX onthulde een absorptiepiek bij 500 nm. Terwijl de DOX-CD's de absorptiepieken van CD's en DOX handhaafden op respectievelijk 410 nm en 500 nm, wat wijst op de succesvolle conjugatie van DOX op CD's. Bovendien, zoals getoond in de inzet van figuur 1c, onthulde de waterige oplossing van DOX-CD's lichtgeel en transparant onder natuurlijk licht en werd de noot heldergroen onder UV-excitatie. Bovendien werd de fluorescentiekwantumopbrengst berekend op 93% met kininesulfaat als referentie (QY =54%). Omdat CD's werden geëxciteerd bij golflengten van 340 tot 440 nm, vertoonde de PL-piek bijna geen verschuiving, wat wijst op de excitatie-onafhankelijke emissie-eigenschappen van CD's. De maximale excitatiegolflengte en PL-piek van de cd's zijn respectievelijk 400 en 525 nm. Het excitatie-onafhankelijke PL-gedrag kan het gevolg zijn van de uniforme oppervlaktetoestanden van CD's [33].

Bovendien werd de elementaire samenstelling van cd's bepaald door XPS. Zoals wordt aangetoond in figuur 1f, heeft het XPS-spectrum bepaald dat de cd's voornamelijk uit koolstof (C ), stikstof (N ), en zuurstof (O ) en waarvan de overeenkomstige atoomverhouding afzonderlijk 78,39%, 7,52% en 14,1% was. Drie typische pieken van C _1S , N _1S , en O _1S kan worden waargenomen bij respectievelijk 284,8, 399,5 en 532,6 eV. Om specifiek te zijn, C _1S spectrum vertoonde 3 pieken bij 284,8, 286,7 en 288,3 eV, die het bestaan ​​van C–C, C–N, C–O of C=O binding vertegenwoordigen, afzonderlijk (Figuur S1A). Het spectrum met hoge resolutie voor N _1S onthulde een piek bij 399,5 eV, die werden toegewezen aan C-N. Bovendien is de O _1s spectrum bevestigde ook de aanwezigheid van C =O- en C-O-binding bij respectievelijk 531,9 en 532,6 eV (Figuur S1B).

De fluorescentie-intensiteit van cd's behield een prachtige stabiliteit, zowel bij 4 ° C als bij kamertemperatuur (Figuur S2A). De afname van de fluorescentie-intensiteit bij 4°C in 2 weken voor minder dan 10% kan worden verwaarloosd. Daarom wordt verwacht dat de koolstofstippen een langdurige stabiliteit bezaten om te worden gebruikt als biomedisch beeldvormend middel.

Figuur S2B illustreerde dat de PL-intensiteiten van CD's afnamen in waterige oplossingen met een hoge (> 10) of lage (<3) pH. Desalniettemin was de PL-intensiteit stabiel in een waterige oplossing van pH -3-10. De zoals voorbereide cd's die worden toegepast bij biomarking en biobeeldvorming, moeten samen met cellen worden geïncubeerd, waar de pH-conditie rond neutraal is (pH =6-8), wat de PL-stabiliteit garandeert. Theoretisch gaf het aan dat de geprepareerde cd's fluorescentie kunnen uitzenden met een hoge stabiliteit in cellen voor biomarking en bioimaging.

Om de fluorescentiestabiliteit van CD's te verduidelijken, werd de fluorescentie-anti-fotoblekentest uitgevoerd. Zoals weergegeven in figuur S2C, vergeleken met de kwantumstippen (CdTe) en de traditionele fluorescerende kleurstoffen (DAPI), vertoonden de koolstofstippen niet alleen een hogere fluorescentie-intensiteit, maar ook een uitstekende weerstand tegen fotobleken. Bovendien waren de CD's ook goed gedispergeerd in verschillende oplossingen zoals DI-water, PBS, FBS-medium, DMEM-medium en CM1-1-medium, waarbij een uitstekende stabiliteit in het bloedsysteem werd verwacht (Figuur S3).

De cd's vertoonden een zeta-potentiaalwaarde van − 31,1 mV (Figuur S4), wat kan worden toegeschreven aan het bestaan ​​​​van zuurstof- en carboxyl-functionele groepen op het oppervlak van deze deeltjes. De potentieel positief geladen DOX kan fysiek op het oppervlak van cd's worden bevestigd via elektrostatische interactie met de carboxylgroep en hydrofobe interactie. DOX-CD's vertonen een zeta-potentiaalwaarde van − 9,7 mV, wat de fabricage van de DOX-CD-complexen bevestigt. Verder bevatten de cd's een sp ² -koolstofnetwerk dat aromatische structuur van DOX kan laden via sterke π -π interacties. De optimale inkapselingsefficiëntie en de efficiëntie van het laden van geneesmiddelen werden onderzocht met verschillende concentraties DOX. Zoals aangetoond in figuur S5, werd de maximale inkapselingsefficiëntie berekend als 50,82% met de overeenkomstige laadefficiëntie van 6,82% bij 0,1 mg / ml DOX.

In vitro geneesmiddelafgifte van DOX-CD's

Het in vitro DOX-afgiftegedrag van DOX-CD's werd uitgevoerd in PBS om de pH-gevoelige DOX-afgifte te onderzoeken. Om dit aan te tonen, werden de DOX-CD's geïncubeerd bij verschillende pH-waarden (pH 7,4, 6,0 en 5,0) en werd de afgifte van DOX gevolgd. Zoals getoond in Fig. 2, gaven de DOX-CD's aanhoudende afgifteprofielen aan in pH -7,4, 6,0 en 5,0 tijdens de rustperiode. De resultaten gaven aan dat de DOX-afgifte pH-afhankelijk was. Slechts 13% van de DOX werd binnen 8 h vrijgegeven toen de DOX-CD's werden geïncubeerd bij pH -7,4. Toen de pH-waarde echter werd verlaagd tot 6,0 of 5,0, kwam er respectievelijk meer dan 35% of 65% van DOX vrij uit de DOX-CD's, wat suggereert dat DOX-CD's gevoelig zijn voor de lage pH. Het toonde aan dat de hoeveelheid vrijgekomen DOX toenam bij een lagere pH, wat werd toegeschreven aan verhoogde protonering van –NH₂ groepen op DOX in een zure omgeving. Daarom kunnen de DOX-CD's de voortijdige lekkage van DOX tijdens de bloedcirculatie voorkomen en de intracellulaire geneesmiddelafgifte verbeteren. Het is van groot nut voor de effectieve behandeling van kanker.

In vitro DOX-afgifteprofiel van DOX-CD's bij pH  5,0, 6,0 en 7,4

In vitro cytotoxiciteitstest

Het biocompatibiliteitsprobleem is van cruciaal belang voor de cd's voor de toepassing in biomedische beeldvorming en medicijnafgifte. De cytotoxiciteit van CD's bij verschillende concentraties werd uitgevoerd tegen HO-8910 eierstokkankercellen en EA.hy926 endotheelcellen van de navelstrengader. Zoals weergegeven in Fig. 3a, behielden zowel de HO-8910- als de EA.hy926-cellen een hoge levensvatbaarheid van meer dan 85%, zelfs bij een hoge concentratie van 5  mg / ml, wat wijst op de uitstekende biocompatibiliteit en lage cytotoxiciteit van cd's.

In vitro celcytotoxiciteit. een Biocompatibiliteit van CD's tegen HO-8910- en EA.hy926-cellen. b Celcytotoxiciteit van DOX-CD's en CD's tegen HO-8910-tumorcellen. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, (n =3)

In combinatie met DOX vertoonden de DOX-CD's DOX-concentratie-afhankelijke cellevensvatbaarheid tegen de HO-8910 eierstokkankercellen. Zoals getoond in Fig. 3b, was de levensvatbaarheid van de cellen van de DOX-CD's significant lager dan die van DOX-vrije CD's, vooral wanneer de concentratie van DOX hoger was dan 0,05  mg / ml, wat aangeeft dat DOX-CD's een uitstekend antikankereffect hebben.

In vitro onderzoek naar opname en etikettering van cellen

Om het intracellulaire opnamevermogen van DOX-CD's te evalueren, werd de cellulaire beeldvorming onderzocht op de HO-8910-cellen. Zoals geïllustreerd in Fig. 4, werd levendige groene en rode fluorescentie waargenomen in de kankercellen die werden toegeschreven aan respectievelijk de aanwezigheid van CD's en DOX. Vooral het intensieve groene fluorescentiesignaal was voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma, wat de intracellulaire distributie van de CD's aangeeft. Omgekeerd was het rode signaal significant sterker in de celkernen vergeleken met cytoplasma, wat suggereert dat de DOX kan verbreken met de CD's en direct naar de celkernen kan worden verplaatst, toegeschreven aan zijn hoge affiniteit met het DNA. Het zou kunnen worden verklaard dat de lage pH-waarde (5,0) in het endosoom en lysosoom de DOX-afgifte van de DOX-CD's zou kunnen ondersteunen. Daarom zouden de DOX-CD's een veelbelovend middel kunnen zijn voor cellabeling en intracellulaire medicijnafgifte.

In vitro cellulaire opname van DOX-CD's door HO-8910-cellen. Schaalbalk =50 μm

In vivo dierbeeldvormingsonderzoek

Een naakte muis werd subcutaan toegediend met CD's waterige oplossing (50 L, 6  mg / ml). De muis werd vervolgens verdoofd door intrapertoneale injectie van 1% pentobarbital en afgebeeld met een Tanon-5200Multi Gel-beeldvormingssysteem onder 488 nm excitatielicht en een 535 nm emissiefilter. Zoals getoond in Fig. 5a, werd sterke groene fluorescentie waargenomen op de toegediende plek, wat impliceert dat de fluorescentie van de CD's effectief de huid en het weefsel van muizen kon binnendringen. Bovendien bleef de muis gezond na injecties, wat aangeeft dat de CD's een uitstekende biocompatibiliteit en lage toxiciteit voor dieren hadden. Gezien alle resultaten waren de cd's in staat als uitstekende luminescentiesonde voor biobeeldvorming in vitro en in vivo.

In vivo dierproef. een Dierlijke fluorescerende beeldvorming met cd's. b Ex vivo beeldvorming van de muizen na intraveneuze injectie van cd's op verschillende tijdstippen

Verder werden de biodistributie- en excretieroute van de CD's uitgevoerd door de nanoprobe via de staartader te injecteren. Op verschillende tijdstippen (0, 0,5, 1, 3 h) werden verschillende organen ontleed voor de fluorescentiebeeldvorming. Zoals getoond in Fig. 5b, vertoonden de nier en blaas een veel sterker fluorescentiesignaal in vergelijking met andere organen, waaronder hart, milt en lever na injectie. Bovendien nam het fluorescentiesignaal in de nier significant toe binnen 0,5 h na injectie en nam het geleidelijk af na 1 h. Vervolgens nam het fluorescentiesignaal in de blaas geleidelijk toe van 0,5 h tot 1 h, wat aangeeft dat de cd's vanuit de nier aan de blaas werden afgeleverd. Het resultaat gaf aan dat de cd's konden worden uitgescheiden en geklaard door het nier- en blaassysteem.

In vivo toxiciteitstest op lange termijn

Bovendien werd er ook een in vivo langetermijntoxiciteitsonderzoek uitgevoerd om het potentieel van het gebruik van CD's in klinisch onderzoek volledig te onderzoeken. De Kunming-muizen werden via de staartader geïnjecteerd met PBS en CD's, en de belangrijkste organen (hart, long, nier, lever, milt) werden na 7 en 21 dagen verzameld voor histologische analyse. Vervolgens werden figuren van histologische weefsels afgebeeld door een microscoop om pathologische verschillen tussen de experimentele groepen en de controlegroep te evalueren. Zoals getoond in Fig. 6, werden geen opmerkelijke orgaanschade en inflammatoire laesie waargenomen in de belangrijkste organen van met CD's toegediende dieren, wat suggereert dat de zoals bereide CD's veilig waren voor klinisch gebruik en in vivo onderzoek. Daarom waren de gesynthetiseerde groene cd's biocompatibel als biomarker en bioimaging-sonde.

Histologische analyse van de belangrijkste organen na 7 en 21 dagen toediening van cd's. Schaalbalk =100 μm