Hydrofile HBP-gemodificeerde rGO stelt dubbele pH/NIR-getriggerde DOX-afgifte in voor synergistische chemo-fotothermale tumorthERAPIE

Samenvatting

We rapporteren een eenvoudige route om hydrofile gereduceerde grafeenoxide (NrGO) te synthetiseren door grafeenoxide (GO) te reduceren met amino-getermineerde hypervertakte polymer (NHBP). NrGO vertoont uitstekende waterdispergeerbaarheid, sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie, efficiënte fotothermale conversie en chemische stabiliteit. Het laden van het chemotherapeutische middel doxorubicicine (DOX) op NrGO levert een dubbel-responsieve medicijndrager die DOX sneller vrijgeeft onder zuure tumor-achtige omstandigheden of bij NIR-laserbestraaling. In vitro studies bevestigen dat NrGO biokompatibel is, en DOX@NrGO bereikt superieure tumorcelremming vergeleken met vrije DOX, wat effectieve chemo-fotothermale synergie demonstreert. Deze bevindingen benadrukken DOX@NrGO als een veelbelovend platform voor gecombineerde kankertherapie en andere biomedische toepassingen.

Inleiding

Nabij-infrarood (NIR) fotothermale therapie (PTT) heeft zich ontwikkeld als een minimaal invasieve strategie voor kankerbehandeling omdat NIR-licht (700–1100 nm) weefsel penetrateert met lage absorptie, gezond weefsel spaart terwijl gelokaliseerde vertering mogelijk wordt.1–3 Voor PTT moet het therapeutische middel hoge fotothermale conversie-efficiëntie, goede biokompatibiliteit en colloïdale stabiliteit in waterige omgevingen combineren.

Grafeen-gebaseerde materialen hebben aandacht getrokken als PTT-middelen vanwege hun tweedimensionale structuur, grote oppervlakte en instelbare optische eigenschappen.4–14 Echter, conventionele gereduceerde grafeenoxide (rGO) geproduceerd via chemische of hydrothermale methoden behoudt vaak hydrofobe karakter, wat de toepasbaarheid in biologische systemen beperkt.16

We adresseren deze beperking door een water-oplosbare, reductieve amino-getermineerde hypervertakte polymer (NHBP) in te zetten om GO om te zetten in een hydrofiel, stabiel rGO (NrGO). Eerder werk demonstreerde NHBP's vermogen om metaalnano-deeltjes te functionaliseren terwijl dispergeerbaarheid bewaard blijft.17,18

Daarnaast kan het laden van cytotoxide geneesmiddelen op fotothermale dragers chemotherapie met PTT synergiseren, omdat warmte niet alleen tumorcellen ablteert maar ook medicijnafgifte versnelt.19–21 Hier beschrijven we de synthese van NHBP-gemodificeerde rGO, de fotothermale eigenschappen, DOX-belading, pH/NIR-getriggerde medicijnafgifte en de resulterende chemo-fotothermale effectiviteit tegen HeLa-cellen.

Materialen en Methoden

Materialen

Grafeenoxide (GO, 0,8–1,2 nm dik, 0,5–5 µm breed) werd verkregen van XFNANO Co., Ltd. Doxorubicicine (DOX) werd gekocht van HuaFeng United Technology Co., Ltd. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), foetale runderserum (FBS), trypsine, penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 µg/mL) werden geleverd door Thermo Fisher Scientific. MTT, DAPI en PI reagentia waren van Beyotime Biotechnology. Alle overige chemicaliën waren analytische graad van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Bereiding van Amino-getermineerde Hypervertakte Polymer (NHBP)

Het amino-getermineerde hypervertakte polymer (NHBP) werd gesynthetiseerd volgens ons eerdere protocol.16 Kortweg, tetraethylenepentamine (94 mL, 0,5 mol) werd geroerd onder stikstof in een 250-mL drie-hals ronde-bodem fles. Een methanoloplossing van methylacrylaat (43 mL, 0,5 mol) werd druppelgewijs toegevoegd, daarna werd het mengsel afwisselend verhitt en gekoeld, gevolgd door 4 uur roeren bij kamertemperatuur. Het product werd geïsoleerd door rotaire verdamping bij 150 °C, wat een geelachtige viskeuze polymer opleverde met een gewichtsgemiddeld molecuulgewicht van ~7759.

Bereiding van NHBP-Gereduceerde GO (NrGO)

GO werd gedispergeerd in gedemineraliseerd water en geultrasoniceerd met NHBP bij gewichtsverhoudingen van 1:10, 1:20 en 1:30 gedurende 10 min, daarna geroerd bij 90 °C gedurende 1 uur. De resulterende suspensies (NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) werden gecentrifugeerd en driemaal met water gewassen.

Bereiding van DOX-Geladen NrGO (DOX@NrGO)

NrGO-suspensie werd gemengd met DOX-oplossing bij een 1:1 gewichtsverhouding en 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het composiet werd verzameld door centrifugatie en gewassen om DOX@NrGO te verkrijgen.

Karakterisering en Metingen

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEOL JEM-2100) werd gebruikt om morfologie te onderzoeken. Fourier-transformatie infrarood (FTIR, Nicolet iS10) spectra werden opgenomen over 400–4000 cm⁻¹ (4 cm⁻¹ resolutie). Zeta-potentieel en hydrodynamische grootte werden gemeten met een NanoBrook 90plus Zeta analyzer. UV-vis-NIR absorptie (400–900 nm, 1 cm⁻¹ resolutie) werd opgenomen op een Thermo Fisher Evolution 300. Fotothermale prestaties werden beoordeeld met een 808-nm laser (SFOLT Co.) en een thermocouple thermometer (DT-8891E). Het monster (0,2 mL) in een 0,25 cm² vlek werd bestraald bij 1 W cm⁻² gedurende 5 min, en temperatuurveranderingen werden in real-time vastgelegd.

Medicijnafgifte Assay

DOX@NrGO werd geplaatst in een dialysezak (MWCO 8000) bevattend PBS (pH 7,4 of 4,0) en geïncubeerd bij 37 °C met 100 rpm trilling. Voor de NIR-groep werd de zak na elk bemonsteringstijdstip 5 min bestraald. Bij elk interval werd 10 mL PBS onttrokken, verversd met vers buffer, en DOX-concentratie bepaald door UV-vis-spectrofotometrie.

Cellulaire Cytotoxiciteit en Chemo-fotothermale Evaluatie

HeLa-cellen werden gezaaid bij 5 × 10³ cellen per put in 96-putplaten en geïncubeerd tot ~80 % confluentie. Cellen werden behandeld met NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹) gedurende 24 en 48 uur, waarna viabiliteit gemeten werd door MTT-assay volgens Vergelijking (1). Na 4 uur incubatie met DOX@NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹) werden HeLa-cellen bestraald met de 808-nm laser (0,5 W cm⁻²) gedurende 5 min en verder gekweekt gedurende 20 uur. Viabiliteit werd beoordeeld door MTT, en celmorfologie werd onderzocht door DAPI en PI-kleuring onder confocale microscopie.

Celviabiliteit (%) = (OD_monster / OD_controle) × 100%.

Resultaten en Discussie

Fysieke en Chemische Karakterisering

Reductie van GO met NHBP transformeerde de bruine suspensie in een zwarte, water-dispergeerbare oplossing, wat succesvolle conversie bevestigt. TEM-afbeeldingen (Fig. 2) tonen aan dat NrGO-30 een monolagige bladstructuur behoudt zonder aggregatie, wat aangeeft dat NHBP de grafeenmorfologie niet verstoort. FTIR-spectra (Fig. 3) tonen verdwijning van de 1725 cm⁻¹ C=O-piek van GO en het verschijnen van een 1633 cm⁻¹ C-N amide-signaal, wat covalente hechting van NHBP bevestigt. Zeta-potentieel metingen (Fig. 4) tonen een verschuiving van negatief (GO) naar positieve waarden (NrGO), wat oppervlaktefunctionalizatie verder ondersteunt. UV-vis-NIR spectra (Fig. 5) tonen sterke absorptie over het NIR-venster voor alle NrGO-monsters, terwijl GO en NHBP alleen verwaarloosbare NIR-respons tonen. Hydrodynamische grootte (Fig. 6) blijft consistent over verschillende NHBP-verhoudingen, wat groottestabiliteit aangeeft.

Fotothermale Eigenschappen

Onder 808-nm bestraling toonde water verwaarloosbare vertering, terwijl GO <5 °C verhoging toonde. In tegenstelling bereikten NrGO-monsters 40–45 °C bij 200 µg mL⁻¹, met hogere NHBP-verhoudingen grotere temperatuurstijgingen producerend (Fig. 7). Temperatuur steeg evenredig met NrGO-concentratie en laservermogen, bereikend het therapeutische venster (~41–43 °C) zonder schade aan normale cellen. Fotothermale cycli (Fig. 7d) en na-bestraaling UV-vis (Fig. 8) bevestigen uitstekende stabiliteit en behoud van optische eigenschappen.

Medicijnleveringsgedrag

DOX-afgifte van DOX@NrGO was aanzienlijk verhoogd in zuur (pH 4,0) en NIR-bebestralde omstandigheden (Fig. 9). Zuur pH ioniseert NHBP-aminegroepen, wat electrostatische binding aan DOX reduceert en afgifte bevordert. NIR-verhitting versnelt moleculaire beweging, wat medicijndiffusie verder versnelt. Dus biedt DOX@NrGO dubbele responsiviteit geschikt voor tumor-micro-omgevingen.

Cytotoxiciteit van NrGO

MTT-assays (Fig. 10a) wijzen >80 % celviabiliteit aan bij 50 µg mL⁻¹ na 24 uur, wat lage intrinsieke toxiciteit en geschiktheid als medicijndrager bevestigt.

Synergistische Tumorcelremming

Behandeling met DOX@NrGO alleen verlaagde HeLa-viabiliteit op dosis-afhankelijke wijze (Fig. 10b). Gecombineerd met NIR-bestraaling (0,5 W cm⁻², 5 min) daalde celviabiliteit significant meer, wat chemo-fotothermale synergie bewijst. Confocale afbeeldingen (Fig. 11) tonen verdeelde kernen met DOX@NrGO, terwijl bestraling uitgebreide cel-loslating induceert. PI-kleuring (Fig. 12) onthult verhoogde dode cellen na gecombineerde therapie, wat de verhoogde cytotoxide effect bevestigt.

Conclusies

Samengevat, we ontwikkelden een eenvoudige, water-oplosbare NHBP-gemodificeerde rGO met robuuste fotothermale conversie en colloïdale stabiliteit. DOX-belading verleent pH- en NIR-getriggerde afgifte, en het DOX@NrGO-systeem bereikt superieure chemo-fotothermale tumorcelremming in vitro. Deze resultaten demonstreren de belofte van DOX@NrGO als een veelzijdig platform voor kankertherapie en andere biomedische toepassingen.

Afkortingen

CLSM:

Confocale laserscannermicroscopie

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenylindol

DOX:

Doxorubicicine

DOX@NrGO:

DOX-geladen NrGO

FTIR:

Fourier-transformatie infrarood

GO:

Grafeenoxide

HBP:

Hypervertakte polymer

MTT:

Methylthiazolyltetrazolium

NHBP:

Amino-getermineerde HBP

NIR:

Nabij-infrarood

NrGO:

Amino-getermineerde hypervertakte polymer gereduceerde grafeenoxide

PI:

Propidiumiodide

PTT:

Fotothermale therapie

rGO:

Gereduceerde grafeenoxide

SEM:

Scanelektronenmicroscopie

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie