Doxorubicine-geladen PEG-CdTe Quantum Dots als een slim medicijnafgiftesysteem voor extramedullaire multipel myeloombehandeling

Materialen en methoden

Materialen

PEG-CdTe QD's en Pierce ™ bicinchoninezuur (BCA) eiwittestkit werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, VS). DOX werd verkregen van Dalian Meilun Biology Technology Co. (Dalian, Volksrepubliek China). PRMI-1640 werd verkregen van Gibco Chemical Co. (Carlsbad, CA, VS). Foetaal runderserum (FBS) werd gekocht bij Wisent Inc. (Montreal, Canada). Annexine V-Fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) apoptose detectiekit en celtellingskit-8 (CCK-8) test werden verkregen van Beyotime Biotechnology Co., Ltd. (Nantong, Volksrepubliek China), en monoklonale antilichamen tegen Bax, Caspase- 3, Bcl2, β-actine werden verkregen van Cell Signaling Technology, plc. (Boston, VS). Een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) werd geaccepteerd door een Japan Electron Optics Laboratory, Ltd. (Tokyo, HT700, Japan). De hydrodynamische diameters en grootteverdeling van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX werden gemeten door Zetasizer sizer NanoZs size analyzer (Malvern, Zetasizer Ultra, VK). De concentratie van DOX werd gedetecteerd door HPLC (Jasco, LC-2000, Japan). De DOX-afgifte is gevonden door een confocale microscoop met laserscanning (Nikon, C 2, Japan). De apoptose en fluorescentie-intensiteit van PRMI 8226-cellen door flowcytometer (BD, Biosciences Accuri C6, VS). Eiwitblots werden gedetecteerd met behulp van het ECL-detectiesysteem (Tanon, 5200 Multi, China).

Voorbereiding van PEG-CdTe-DOX

DOX werd efficiënt geabsorbeerd op PEG-CdTe QD's via elektrostatische interactie. In het kort werden 100 μl PEG-CdTe (1 mg/ml) en 100 μl DOX (1 mg/ml) gemengd in 800 μl gedestilleerd water onder roeren van 100 rpm gedurende 24 uur bij 37 ° C in het donker. PEG-CdTe-DOX werd verzameld en gedurende 30 minuten (4 ° C, 30.000 tpm) gecentrifugeerd. PEG-CdTe-DOX werd gemengd en tweemaal gecentrifugeerd bij de bovengenoemde. De niet-gereageerde DOX werden getest met high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) [19]. Inkapselingsefficiëntie (EE) en medicijnbelading (DL) werden als volgt berekend:

De morfologie van PEG-CdTe QD's werd gekarakteriseerd door TEM. De hydrodynamische diameters van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX werden gemeten door dynamische lichtscatting (DLS) in de PBS. In het kort werd 20 ml PEG-CdTe-DOX (DOX, 1 mg/ml) overgebracht in dialysezakken (molecuulgewichtgrens van 3500 Da), die vervolgens werden ondergedompeld in 180 ml PBS bij pH 5,0, 6,0,7,4 of 8,0, onder constant draaien (bij 100 tpm) bij 37 °C. Vervolgens werd elke 2 uur 0,1 ml PBS verzameld en vervangen door een equivalent volume PBS. De DOX-concentratie werd gekwantificeerd door spectrofotometrie bij 450 nm, en de cumulatieve afgifte van DOX uit de PEG-CdTe werd uitgezet volgens de afgifteverhouding in de tijd.

Confocale fluorescentiemicroscopie

Het binnendringen van DOX in PRMI 8226-cellen (multipele myeloomlijn) werd visueel bevestigd onder confocale microscopie. De PRMI 8226-cellen werden gedurende 4 uur behandeld met PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX. Vervolgens werden de PRMI 8226-cellen verzameld, gecentrifugeerd en gesuspendeerd in 70 μl PBS. Vervolgens werden de cellen overgebracht naar objectglaasjes. Na 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) gedurende 10 minuten werden confocale fluorescentiebeelden gemaakt met een confocale omgekeerde microscoop. De emissiegolflengte van DAPI en DOX was respectievelijk 450 en 585 nm.

Celcultuur

PRMI 8226 (multipele myeloomcellen) en 293 t (menselijke embryonale niercellen) cellijnen werden gekocht bij het Shanghai Institute of Cells (Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China). PRMI 8226-cellen werden gekweekt in een Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-medium aangevuld met 10% FBS, 293 t-cellen werden gekweekt in een Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) mediumsupplement met 10% FBS en 100 E/ml penicilline , en 100 μg/ml streptomycine bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% koolstofdioxide (CO₂ ).

Cell Viability Assay

De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd met de CCK-8-assay. Eerst werden PRMI 8226-cellen gezaaid in platen met 96 putjes die elk 100 μl 2 × 10 ⁴ bevatten. cellen en behandeld met fosfaatbufferzout (PBS) (de controlegroep), PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX. De DOX-concentratie was 1,76 g/ml na incubatie gedurende 24, 48 of 72 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. 293 t-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes die elk 100 μl 8 × 10 ⁴ bevatten cellen en behandeld met PEG-CdTe (0, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 of 51,2 g/ml) gedurende 24 uur. Vervolgens werd CCK-8 (10 μl) toegevoegd aan platen met 96 putjes en nog eens 3 uur geïncubeerd. Levensvatbaarheid van cellen (%) van PRMI 8226-cellen en 293 t werden berekend als (1 − OD_behandeling /OD_controle ) × 100.

Cellulaire opname

Cellulaire opname werd kwantitatief gemeten met flowcytometrie (FCM) om te bepalen of de intracellulaire DOX-concentratie toeneemt in met PEG-CdTe-DOX behandelde cellen (Fig. 3). In het kort werden PRMI 8226-cellen gekweekt met PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX in platen met 24 putjes en 24 uur geïncubeerd. De cellen werden gecentrifugeerd en twee keer gewassen bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Het neerslag werd gedispergeerd in 200 μl PBS en geanalyseerd met FCM. De anto-fluorescentie van DOX is rood en de relatieve fluorescentie-intensiteit (FI) werd berekend als met FI_{behandelde cellen} /FI _{PEG-CdTe-cellen} .

Cell Apoptosis Study Test

PRMI 8226-cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 3 × 10 ⁵ cellen. Na incubatie met PBS, PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX gedurende 24 uur, werden deze cellen verzameld door middel van centrifugatie bij 1000 rpm en driemaal gewassen met PBS. Cellen in verschillende groepen werden gelabeld met Annexin V-FITC (5 l) in bindingsbuffer (100 l) gedurende 15 minuten, gevolgd door toevoeging van 5 μl PI gedurende 5 minuten en in de donkere kamer. De snelheid van celapoptose werd gemeten met FCM.

Western Blotting

PRMI8226-cellen werden geoogst na verschillende behandelingen (PBS, PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX) en onderworpen aan western blotting. Van alle groepen werden totale eiwitten verzameld en de eiwitconcentratie werd gedetecteerd met de Braford-methode. Totale eiwitten (40 g) werden op grootte gefractioneerd door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS / PAGE) en overgebracht naar polyvinylideendifluoridemembranen. Vervolgens werd 5% magere melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur als blokkeringsmiddel gebruikt. Western-blotting werd uitgevoerd met behulp van monoklonale antilichamen:β-actine (interne controle), Bax, Bcl2, Caspase-3. Eiwitblots werden gedetecteerd met behulp van het ECL-detectiesysteem en de eiwitband werd gekwantificeerd door Image J.

Statistische analyse

Alle waarden werden gegeven als gemiddelden ± standaarddeviatie. Verschillen tussen twee groepen geanalyseerd door Student' t test. Waarden van P < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Alle experimenten werden ten minste drie herhalingen uitgevoerd.

Resultaten

Karakterisering van PEG-CdTe-DOX

PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX vertoonden een kristalstructuur en waren goed gedispergeerd in PBS, zoals gedetecteerd door TEM (Fig. 2a, b). De nanodeeltjesgrootteverdelingen van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX werden bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS) (figuur 2c). De DL en EE van DOX in PEG-CdTe-DOX werden bepaald met HPLC (figuur 2e). De DOX-afgifte was gemaximaliseerd bij pH 5,0 en 6,0, aangezien ongeveer 92,5% en 88% van de geladen DOX binnen 24 uur in de PBS werd afgegeven, en de afgiftesnelheden waren langzamer bij pH 7,4 en 8,0, wat een pH-geactiveerd afgiftepatroon suggereerde (Fig. 2d). Het pH-gevoelige afgiftevermogen van DOX is effectief omdat er een zure omgeving wordt gevormd in de micro-omgeving van de tumor, waarin DOX snel wordt afgegeven uit het PEG-CdTe-DOX-complex. De gemiddelde hydrodynamische diameters zijn respectievelijk 8,20 en 78,31 nm; de EE en DL zijn respectievelijk 77,20% ± 1,12% en 42,12% ± 0,98%; de Zeta-potentialen van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX zijn respectievelijk − 20,12 ± 2,45 en − 10,50 ± 1,26 mV. Deze bevindingen wijzen op de gunstige belasting van DOX op PEG-CdTe en de succesvolle synthese van PEG-CdTe-DOX. Daarom zou een hogere DOX-concentratie in de micro-omgeving van de tumor en een lagere DOX-concentratie in normale weefsels kunnen worden bereikt.

Kenmerken van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX. Opmerkingen:een , b TEM-afbeeldingen van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX. c DLS-analyse van PEG-CdTe en PEG-CdTe-DOX. e Het geoptimaliseerde PEG-CdTe-DOX-medicijnafgiftesysteem dat synthetiseert van verschillende incubatieconcentraties van DOX tot PEG-CdTe. d DOX vrijgegeven uit PEG-CdTe-DOX in PBS bij pH 5,0, 6,0, 7,4 of 8,0 bij 37 ° C in vitro. v De levensvatbaarheid van 293 t-cellen na behandeling met verschillende concentraties PEG-CdTe

Confocale microscoopfluorescentiebeelden laten zien dat PEG-CdTe-DOX DOX in PRMI 8226-cellen zou kunnen afleveren. Bovendien kon rode fluorescentie die duidelijk werd opgeslagen in PRMI 8226-cellen, de PEG-CdTe-DOX-groep in vergelijking met de DOX-groep, wat aangeeft dat PEG-CdTe de cellulaire opname van PEG-CdTe-DOX en intracellulaire afgifte versterken door zich te richten op RPMI 8226-cellen.

Cellulaire opname en cytotoxiciteit van PEG-CdTe-DOX in vitro

Om te bepalen of PEG-CdTe-DOX uitsluitend DOX-accumulatie in PRMI 8226-cellen kan vergemakkelijken, hebben we de DOX-accumulatie gemeten met flowcytometrie (FCM) van intracellulaire fluorescentie-intensiteit. De intracellulaire DOX-concentratie in PRMI8226-cellen nam significant toe in de PEG-CdTe-DOX-groep in vergelijking met de DOX-groep (P < 0.01, Afb. 4). De cytotoxiciteit van PEG-CdTe-DOX tegen PRMI 8226-cellen is positief gerelateerd aan de incubatietijd, die ook langer is dan in de DOX-groep (72 uur, figuur 4). De levensvatbaarheid van de cellen na incubatie gedurende 24, 48 en 72 uur werd onderzocht met behulp van cell counting kit-8 (CCK-8) en de overeenkomstige remmingspercentages van PEG-CdTe-DOX waren respectievelijk 58%, 70% en 85%. . De resultaten suggereerden dat de levensvatbaarheid van PRMI8226-cellen in de PEG-CdTe-DOX-groep significant afnam in vergelijking met de DOX-groep (P < 0.05). Bovendien werd er geen significant verschil in cellevensvatbaarheid waargenomen tussen de controlegroep en de PEG-CdTe-groep. Er is geen significant verschil in cellevensvatbaarheid van 397 t-cellen met PBS en PEG-CdTe (de concentratie van PEG-CdTe is dezelfde als die in het RPMI 8226-experiment). Deze bevindingen komen overeen met de intracellulaire DOX-concentraties (Fig. 3 en 4) en geven aan dat PEG-CdTe de gerichte afgifte helpt zonder de therapeutische effecten te verstoren. De apoptose van PRMI 8226-cellen verbeterde dus opmerkelijk, wat aangeeft dat PEG-CdTe-DOX zou kunnen worden gebruikt als een medicijnafgiftesysteem.

Fluorescentiemicroscopiebeelden van PRMI 8226-cellen na ontvangst van PEG-CdTe, DOX of PEG-CdTe-DOX. Opmerkingen:een , d PEG-CdTe; b , e DOX; c , v PEG-CdTe-DOX. De rode fluorescentie geeft PEG-CdTe-DOX aan met pijlen (schaalbalk:50 μm, × 400; emissiegolflengten van DAPI en DOX waren respectievelijk 450 en 585 nm)

Gemiddelde fluorescentie-intensiteit in PRMI8226 door flowcytometrie en groeiremming van PRMI8266-cellen met verschillende behandelingen. Opmerkingen:een PEG-CdTe; b DOX; c PEG-CdTe-DOX; d de fluorescentie-intensiteit van DOX en PEG-CdTe-DOX vergeleken met PEG-CdTe (**P < 0.01). e CCK-8-analyse van PRMI 8226-cellen behandeld met PBS (controle), PEG-CdTe, DOX en PEG-CdTe-DOX na 24, 48 en 72 uur (*P < 0.05)

Apoptose van PRMI8226-cellen

De totale apoptosepercentages van PRMI8226-cellen gemeten door FCM waren respectievelijk 4,78%, 6,95%, 34,07% en 66,5% in de controle-, PEG-CdTe-, DOX- en PEG-CdTe-DOX-groepen (Fig. 5). Het apoptosepercentage in de PEG-CdTe-DOX-groep nam significant toe in vergelijking met de DOX-groep (P < 0.01). De apoptosepercentages waren echter niet significant verschillend tussen de controlegroep en de PEG-CdTe-groep, wat suggereert dat PEG-CdTe veilig was en de werkzaamheid van DOX aanzienlijk zou kunnen verhogen.

Apoptosepercentages van PRMI 8226-cellen met verschillende behandelingen. Opmerkingen:een PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX. e Vergelijkende apoptosepercentages van PRMI8226-cellen in verschillende groepen werden getoond in de staafgrafiek (**P < 0,01 in vergelijking met controle; ^## P < 0,01 in vergelijking met DOX)

Western Blotting

Western-blotting werd uitgevoerd om de expressieniveaus van met apoptose geassocieerde eiwitten Bax, Caspase-3 en Bcl-1 te meten (Fig. 6). Bax en Caspase-3 werden geleidelijk opgereguleerd in zowel de DOX- als PEG-CdTe-DOX-groepen. Wat het contrast betreft, veranderde de Bcl2-expressie omgekeerd. In de PEG-CdTe-DOX-groep kwamen Bax en Caspase-3 sterk tot expressie in vergelijking met de DOX-groep (P <-0,05), terwijl de Bcl2-expressie het laagst was. Deze bevindingen bevestigen dat de antitumoractiviteit van PEG-CdTe-DOX het meest effectief is van de andere.

Eiwitexpressie van apoptose-geassocieerde genen van PRMI 8226-cellen met verschillende behandelingen. Opmerkingen:een PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX (*P < 0.05)

Discussie

De belangrijkste oorzaak van het falen van tumorchemotherapie is de intolerantie van patiënten. Het PAD-regime bestaande uit Bortezomib, DOX en dexamethason is de eerstelijnstherapie voor multipel myeloom [9]. DOX speelt een belangrijke rol bij de behandeling van multipel myeloom. DOX remt proliferatie en induceert apoptose van tumorcellen door DNA te verstoren [20]. Cytotoxische geneesmiddelen zoals DOX veroorzaken echter verschillende nadelige effecten op normale weefsels en organen, met name cardiotoxiciteit [21]. Myeloom wordt het vaakst gediagnosticeerd bij mensen van 65 tot 74 jaar [22], en oudere patiënten met multipel myeloom lijden vaak aan orgaanstoornissen en kunnen geen hoge dosis chemotherapie krijgen om de resultaten te verbeteren. Tolerantie is een garantie voor voortgezette behandeling van multipel myeloom en beperkt daardoor het klinische gebruik van DOX. Daarom hebben veel EMM-patiënten geen kans op een effectieve behandeling vanwege het niet doorstaan ​​van hoge doses chemotherapie. Het is dus dringend nodig om methoden te ontwikkelen die nadelige effecten kunnen verminderen en therapeutische effecten kunnen versterken. In dit werk hebben we een DOX-geladen afgiftesysteem ontwikkeld met behulp van PEG-CdTe-nanodeeltjes, die in staat waren om geneesmiddelen selectief in tumorweefsels te concentreren door middel van systemische circulatie.

Onze studie onthulde dat PEG-CdTe-nanodeeltjes DOX konden laden met hoge DL en EE (Fig. 2e), die consistent zijn met andere onderzoeken [12, 13]. Bovendien konden de PEG-CdTe-nanodeeltjes met een diameter van 8,2 nm (<-10 nm) snel worden gemetaboliseerd door het urinestelsel [23], en PEG-CdTe-DOX-nanodeeltjes met een grootte van 78,31 nm (<-200 nm) verlengden de bloedcirculatie tijd en verminderde of zelfs vermeden plasma-opsonisatie en absorptie in het reticulo-endotheliale systeem [23]. Als drager van nanodeeltjes kwamen de medicijnen vrij uit PEG-CdTe in een pH-getriggerd en pH-gecontroleerd patroon en verlengden ze de circulatieperiode, wat belangrijk was voor een praktisch medicijnafgiftesysteem om ongewenste immuunrespons en weefselreacties tegen de medicijndrager te voorkomen [24]. De micro-omgeving van de tumor had een lagere pH in vergelijking met normale weefsels vanwege de hypoxische toestand [25], en gaf dus meer DOX vrij. De geneesmiddelconcentratie in de zure micro-omgeving (tumorweefsels), en daarmee de werkzaamheid van chemotherapeutische geneesmiddelen, kan worden verbeterd [26]. Daarom werd het medicijn massaal afgegeven rond de tumorcellen, terwijl het medicijn meestal in de drager bleef in de normale fysiologische omgeving en minder werd afgegeven aan normale weefsels. Intracellulaire experimenten bevestigden ook dat er meer DOX werd afgeleverd aan PRMI 8226-cellen. Daarom was de chemotherapeutische werkzaamheid verbeterd en werden de nadelige effecten op normale weefsels geïnduceerd.

Experimenten in vitro toonden consequent aan dat PEG-CdTe-DOX zich op tumorcellen richtte en daar de accumulatie van geneesmiddelen verhoogde (Fig. 3). Evenzo werden de proliferatieremming en apoptose van PRMI 8226-cellen verhoogd door PEG-CdTe-DOX in vergelijking met alleen DOX bij dezelfde concentratie (figuur 4). Daarom was een lagere DOX vereist om dezelfde chemotherapeutische efficiëntie te bereiken. Bovendien kan de remming van de celproliferatie van RPMI 8226 en de inductie van apoptose worden verhoogd door PEG-CdTe-DOX, wat de belangrijkste manier is waarop de medicijnen myeloomcellen doden (Fig. 5). Verder werd er geen significant verschil gevonden tussen de PEG-CdTe-groep en de controlegroep, wat bevestigde dat PEG-CdTe in vitro geen therapeutische activiteit had. Wat moet worden opgemerkt, is dat onze resultaten de hoge veiligheid en lage cytotoxiciteit van PEG-CdTe bij lage concentratie aangeven, wat consistent is met andere onderzoeken [12, 27]. De apoptosesnelheid van PMIR 8226-cellen geëvalueerd door FCM in de PEG-CdTe-DOX-groep is echter duidelijk hoger dan de DOX-groep (P < 0.01). PEG-CdTe zou dus de bijwerkingen van DOX aanzienlijk kunnen verminderen door de medicijnen aan tumorcellen te leveren.

De drie belangrijkste routes van apoptose werden overwogen:de mitochondriale route, de endoplasmatisch reticulum route en de dood receptor route. In de mitochondriale route worden apoptogene factoren (bijv. cytochroom C) eerst uit de mitochondriën in het cytosol afgegeven en vervolgens initiëren ze de apoptose van deze route, geïnduceerd door de caspase-route [28]. De Bcl2-familie bestaat uit pro-apoptotische eiwitten (Bax, Bad en Bak) en anti-apotoptische eiwitten (Bcl-xl en Bcl2) [29]. Bax kan migreren van het cytosol naar het mitochondriale membraan wanneer het wordt gestimuleerd door apoptosesignalen, wat de top is van de "leven of dood" cellulaire mechanismen. Bcl2 en Bax zijn een paar positieve en negatieve genregulaties, aangezien Bax apoptose induceert terwijl Bcl2 het remt [30]. Caspase-3 bevordert mogelijk niet alleen apoptose, terwijl overleven de sterkste remmer van apoptose is, maar bevordert ook celproliferatie, die direct caspase-3 en caspase-7 kan activeren, waardoor de apoptose wordt geblokkeerd [31, 32]. Caspase-3, een beul in de caspase-familie, kan ook poly-adp-ribose-polymerase splitsen en inactiveren wanneer het wordt gestart [12]. In de huidige studie werden de expressies van verwante apoptotische eiwitten gedetecteerd om het moleculaire mechanisme te onderzoeken hoe PEG-CdTe-DOX de antitumoractiviteit verhoogde. Er werd gevonden dat PEG-CdTe-DOX de cytotoxische effecten op tumorcellen kan verhogen door apoptose te induceren via de caspase-gemedieerde apoptotische route.

Conclusies

We hebben de PEG-CdTe-DOX gefabriceerd voor EMM-behandeling met hoge EE en DL. Dit systeem kan DOX gericht afleveren aan RPMI 8226-cellen, waardoor de therapeutische effecten toenemen en de bijwerkingen van DOX afnemen. De targeting van PEG-gemodificeerd CdTe zou de chemotherapeutische effectiviteit kunnen verhogen en de bijwerking kunnen verminderen, wat de weg kan effenen voor een betere kankerbehandeling.

Afkortingen

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenylindol

DL:

Geneesmiddel laden

DOX:

Doxorubicine

EE:

Inkapselingsefficiëntie

EMM:

Extramedullair multipel myeloom

FCM:

Flowcytometrie

HPLC:

Krachtige vloeistofchromatografie

MM:

Multipel myeloom

PBS:

Fosfaatbuffer zoutoplossing

PEG-CdTe-DOX:

Met polyethyleenglycol gemodificeerde cadmiumtelluride kwantumstippen

SDS/PAGE:

Natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop