Verbetering van HIFU kankertherapie met sonodynamische N₂O microbellen

Samenvatting

Hoog-intensiteit gefocuste ultrasone (HIFU) is een representatieve non-invasieve methode van kankertherapie, maar de lage therapeutische effectiviteit en het risico op schade aan omringend normaal weefsel belemmeren de verdere klinische ontwikkeling en toepassing. Sonodynamische therapie (SDT) doodt tumorcellen door reactieve zuurstofmoleculen geproduceerd door sonosensitizers tijdens ultrasone behandeling. SDT kan de HIFU effectiviteit vergroten zoals microbellen. In dit werk ontwikkelden we nanoschaalse N₂O microbellen (N₂O-mbs) door een verbeterde mechanische oscillatiemethode. Deze microbellen toonden een goede biocompatibiliteit en tumorcelbinding. De sonogevoeligheid van de N₂O-mbs werd zowel extracellulair als intracellulair gedetecteerd door de detectie van reactieve zuurstofsoorten generatie. De toxische effecten van deze sonodynamische microbellen op tumorcellen en het synergistische effect op HIFU behandeling werden geëvalueerd. Significante apoptose werd veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door N₂O-mbs onder ultrasone bestraling. N₂O-mbs gecombineerd met HIFU verhoogde tumorcel necrose en apoptose in vitro en het coagulatieve necrotische volume en echo-intensiteit in het bovine lever doelgebied ex vivo. Deze sonodynamische microbellen zijn ook aangetoond om tumorgroei efficiënt te remmen in vivo. N₂O-mbs hebben een significante impact op de behandeling en ablatie-effect van HIFU door de voordelen van microbellen en buitengewone sonogevoeligheid. Deze bevinding suggereert dat N₂O-mbs een nieuwe hulpmiddel voor ultrasone kan zijn dat gebruikt kan worden om HIFU tumor thermische ablatie te promoten.

Inleiding

Maligniteit tumoren zijn een van de belangrijkste ziekten die het menselijk leven en gezondheid bedreigen [1]. Hoog-intensiteit gefocuste ultrasone (HIFU) is een nieuwe techniek voor de non-invasieve locale ablatie van tumoren. HIFU is met succes gebruikt in de behandeling van goedaardige en kwaadaardige solide tumoren in de lever, nieren, pancreas, prostaat, borst, bot en uterus [2, 3]. Echter, de inherentie beperkingen van HIFU, zoals het verval van ultrasone energie tijdens behandeling, het verzwakken van energie-accumulatie in het doelgebied en de schade van niet-doelwit gezond weefsel verminderen zijn therapeutisch effect [4, 5]. Het focale veld gevormd door HIFU bestraling is klein, meestal in millimeter orde. Het duurt lang om grote tumoren te ablateren. De verlenging van HIFU bestralingstijd zal de lichaamstemperatuur verhogen, zelfs tot 39,2 °C. Naarmate de diepte van de tumor in het lichaam toeneemt, moet de energie van HIFU ablatie ook toenemen [6]. Dit verhoogt het risico op fysieke schade aan de patiënt en verlaagt de efficiëntie en veiligheid van HIFU behandeling. Daarom hebben onderzoekers zich in de afgelopen jaren toegewijd aan het vinden van manieren om de therapeutische efficiëntie van HIFU te verhogen [7,8,9]. Microbellen kunnen de HIFU therapeutische effectiviteit synergistisch verbeteren [7, 10]. Het gas in de microbel behoort tot het hoge akoestische impedantie materiaal. De microbellen verhogen de verstrooiing en reflectie van de ultrasone golf in het doelgebied wanneer HIFU het tumorweefselgebied bestraalt [11, 12]. Microbellen verhogen de temperatuur van het tumordoelgebied en versterken het thermische effect van HIFU behandeling door de accumulatie van HIFU energie in het doelgebied te verhogen [13]. Daarnaast fungeren microbellen als exogene cavitatiekernen en verlagen de weefselcavitatiedrempel en versterken het cavitatie-effect van HIFU als het door de bloedsomloop in het tumorweefsel passeert [14]. In de afgelopen jaren hebben studies aangegeven dat sonodynamische therapie (SDT) de HIFU behandelingseffectiviteit synergistisch kan verbeteren [15, 16]. De interacties tussen de sonosensitizers en ultrasone produceren reactieve zuurstofsoorten (ROS), waaronder singulet zuurstof en hydroxyle radicalen, die tumorcellen doden en tumorgroei remmen via apoptose en necrose [17]. SDT heeft in de afgelopen jaren grote vooruitgang geboekt in het niet-invasieve tumorbehandeling vakgebied. Het maakt het mogelijk om de medicijndosis en HIFU bestralingsvermogen te reduceren vergeleken met die van conventionele monotherapies. Om optimaal gebruik te maken van de voordelen van de twee, combineerde deze studie de microbellen en sonodynamisch effect om de effectiviteit van HIFU verder te verbeteren. Sonosensitizers zijn een belangrijk deel van SDT [18, 19]. De meeste van de momenteel bestudeerde traditionele sonosensitizers komen van fotosensitizers. N₂O is een fotosensitizer [20, 21], die giftige stoffen produceert onder ultraviolette lichtbestraalingscondities. In deze studie werd de sonogevoeligheid van N₂O ook initieel verkend. We vonden eerder dat toepassing van N₂O inhalatienarcose in HIFU operatie de letselgraad van weefsel verergerde, waaronder de verhoogde dikte van buik- en huidcongestie [22]. De gecombineerde utilizatie van N₂O en HIFU speelde een synergistisch effect op weefselschade. Maar, welk biologisch effect N₂O heeft in HIFU behandeling is onduidelijk. N₂O is een relatief stabiel klein moleculair gas zonder biotransformatie en zonder weefselspecificiteit in cellen. Het kan breed gebruikt worden in weefsel en heeft geen toxisch effect op het lichaam [23, 24]. Dus is het een aantrekkelijk prospect als sonosensitizer. In deze studie werden nanoschaalse microbellen (N₂O-mbs) bereid met lipide-omhulde N₂O en C₃F₈. De dosering van N₂O werd verminderd en het actiebereik in vivo werd ook effectief beperkt tot het tumorweefselgebied. Het sonodynamisch effect van N₂O en het synergistische effect op HIFU effectiviteit werden onderzocht.

Materialen en methoden

Materialen

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-fosfocholine (DPPC) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-mPEG2000) werden gekocht van Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Glycerine en agarose werden verkregen van Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N₂O en C₃F₈ werden gekocht van Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4′,6-Diamidino-2-fenylindole (DAPI), 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI), 2′,7′-dichlorofluorescine diacetaat (DCFH-DA), 3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescine, diacetaat (DAF-FM DA) en CCK-8 werden gekocht van Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calceïne-AM (CAM) en propidium iodide (PI) werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). Annexin V-FITC/PI werden verkregen van Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Singulet zuurstof sensor groen (SOSG) werd gekocht van Invitrogen (NY, USA).

Bereiding van N₂O-mbs en C₃F₈-mbs

N₂O-mbs werden bereid door de rotatiefilm gecombineerd met mechanische oscillatiemethode. We namen DPPC en DSPE-PEG2000 als schelpmaterialen en N₂O als kern. Kortom, 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 en 10 mL chloroforme werden gelijktijdig in een ronde-bodemfles gegoten, gemengd en volledig opgelost door ultrasone golven. Vervolgens werden de lipide films gevormd door rotatieverdamping (60 min, 55 °C, 100 t/min). Daarna werd 2 mL van 10% glycerine toegevoegd om de lipide films te hydrateren en een suspensie te bereiden. 500 μL daarvan werd aan een kapselbuis toegevoegd. De kapselbuis werd afgedicht met een rubberen dop. De lucht in de buis werd vervangen door N₂O en C₃F₈ door een gasverplaatsingsapparaat. Vervolgens werd de suspensie mechanisch geschud door een zilver-kwik kapselmenger (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) gedurende 150 s. Ten slotte werd de resulterende suspensie onderworpen aan differentiele centrifugatie om de doel N₂O-mbs te verkrijgen, en gecentrifugeerd bij 300 t/min gedurende 5 min, en daarna gecentrifugeerd bij 800 t/min gedurende 5 min. N₂O-mbs werden heropgelost in PBS en vervolgens opgeslagen bij 4 °C voor verder gebruik.

De C₃F₈-mbs werden gefabriceerd met dezelfde mechanische oscillatiemethode, zoals eerder beschreven [25]. DiI-gemarkeerde N₂O-mbs kunnen bereid worden door DiI toe te voegen tijdens de spinfilmvorming. Het is de moeite waard om te vermelden dat N₂O een laag molecuulgewicht heeft en onstabiel is. De N₂O in de microbel loopt gemakkelijk over. Daarom is de halfwaardetijd van de microbel verminderd. C₃F₈ is een macromoleculair inerte gas dat breed gebruikt wordt in de studie van ultrasone microbel contrastmiddelen. C₃F₈ kan de stabiliteit van de microbellen verhogen. Daarom werden in deze studie N₂O en C₃F₈ (2:1) gemengd als de N₂O-mbs kern om hun stabiliteit te verhogen.

Fabricatie en Prestatiedetectie van N₂O-mbs

De morfologie en grootteverdeling van N₂O-mbs werden waargenomen onder helder-veld optische microscopie. De concentraties van N₂O-mbs en C₃F₈-mbs werden berekend door globulimeter volgens de berekeningsrichtlijnen. De gemiddelde deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de N₂O-mbs werden bepaald door een dynamische laserspreidingssysteem (Malvern Instruments, Malvern, UK). De structuur en morfologie van de N₂O-mbs werden gekarakteriseerd door transmissie elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). De bereide N₂O-mbs werden opgeslagen bij 4 °C. Om de stabiliteit van N₂O-mbs te observeren, werden de morfologie en concentratie op de eerste, tweede en derde dag vastgelegd. Tegelijkertijd werden de gemiddelde deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de microbellen bepaald.

Celcultuur en Diermodel

Humane borstkankercellen (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) werden in het lab gepasseerd voor minder dan 3 maanden na herstel. De cellen werden gehandhaafd in een 37 °C incubator met 5% CO₂, met DMEM bevattende 10% foetale runderserum, 50 μg/L streptomycine en 50 μg/L penicilline. Toen de cellen 80% confluëntie bereikten, werden ze gebruikt voor experimenten.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Dierenethiekcomité van Chongqing Medical University. Een bepaald aantal vrouwelijke naakte muizen (4–6 weken oud; gewicht van 15–20 g) werden gekocht van Dierproefcentrum van Chongqing Medical University (Chongqing, China). Voor de vestiging van solide tumor, werden MDA-MB-231 cellen (1 × 10⁶ cellen/mL) opgelost in fysiologische zoutoplossing (100 μL) subcutaneus geïnjecteerd in de rechter achterflank van elke muis. Alle tumordragende muizen werden gebruikt voor therapeutische experimenten toen de tumorvolumes ongeveer 150 mm³ bereikten.

Intracellulaire Opname en Biocompatibiliteitsevaluatie van N₂O-mb

MDA-MB-231 cellen in de groeifase werden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 1 × 10⁵ cellen per confocal laser scanning microscopie (CLSM) fles voor 24 uur. Vervolgens werd 100 μL (1 × 10⁵ bellen/mL) van DiI-gemarkeerde N₂O-mbs complete medium verdunningsoplossing toegevoegd om de confocal schaal met medium te vullen. De schaal werd geseald met microplaatseals en omgekeerd in een incubator opgeslagen, waarbij de N₂O-mbs in contact bleven met de cellen. Na 2 uur en 4 uur co-incubatie, werden de cellen zachtjes 3 keer gewassen met PBS, fixatie met 4% paraformaledehyde (PFA) gedurende 20 minuten en gekleurd met DAPI gedurende 20 minuten. Ten slotte werd het cel-targeting gedrag van N₂O-mbs waargenomen door CLSM (Nikon A1, Japan).

De cytotoxiciteit van N₂O-mbs werd geëvalueerd door een standaard CCK-8 assay. MDA-MB-231 cellen werden gezaaid in een 96-putten plaat (5 × 10⁴ cellen/put) voor 24 uur. Vervolgens werd 100 μL van verschillende concentraties (1 × 10⁴/mL, 1 × 10⁵/mL en 1 × 10⁶/mL) van N₂O-mb toegevoegd. Na 24 uur incubatie werd CCK-8 oplossing (10 μL) aan elke put toegevoegd. Daarna werden de MDA-MB-231 cellen gekweekt bij 37 °C voor nog eens 2 uur. Ten slotte werd de absorbantie van elke put gemeten bij 450 nm met een Bio-Tek microplaatlezer (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA).

Tien gezonde vrouwelijke naakte muizen van ongeveer 20 g werden willekeurig in twee groepen verdeeld. De N₂O-mbs (n = 5) groep werd intraveneus geïnjecteerd met N₂O-mbs (200 μL, 1 × 10⁵/mL) en de controle groep (n = 5) geïnjecteerd met fysiologische zoutoplossing (200 μL). Na 21 dagen werden de belangrijke organen (hart, lever, milt, long en nieren) van alle muizen geëxcideerd en gekleurd met hematoxyline–eosine (H&E).

In Vitro SDT Efficiëntie van N₂O-mbs

De methode voor zuurstofradicaal detectie was gebaseerd op een eerdere rapportage [26]. Kortom, 10 μL van SOSG (500 μM) werd gemengd met 2 mL van de monsteroplossing. De behandelingsgroepen waren als volgt: groep C (de lege controlegroep), alleen PBS werd toegevoegd; N₂O-mbs groep, 100 μL van N₂O-mbs (1 × 10⁵/mL) in 2 mL PBS oplossing werd toegevoegd; C₃F₈-mbs groep, 100 μL van C₃F₈-mbs (1 × 10⁵/mL) in 2 mL PBS oplossing werd toegevoegd; LIFU groep, PBS werd bestraald door ultrasone (2 W/cm²; Instituut voor Ultrasone Beeldvorming van Chongqing Medical Sciences, Chongqing, China) gedurende 100 s; LIFU–N₂O-mbs groep, PBS met toegevoegde N₂O-mbs werd ultrasone bestraald; LIFU–C₃F₈-mbs groep, PBS met toegevoegde C₃F₈-mbs werd ultrasone bestraald. De experimentele groepsbehandelingsparameters werden ingesteld als 2 W/cm² en 100 s door analyse en vergelijking van de experimentele resultaten en raadpleging van de literatuur [27, 28]. De ultrasone parameters die voor behandelingsdoeleinden werden gebruikt, waren als volgt: frequentie, 650 kHz; brandpuntafstand, 12,5 mm; puls golf modus, 50% duty cycle; en pulsduur, 1 s. De generatie van singulet zuurstof (¹O₂) werd bepaald door fluoresentiespectrometrie (Cary Eclipse, Agilent Technologies) door de fluoresentie-intensiteit te meten (λ excitatie/λ emissie = 504 nm/525 nm). De selectie van de ultrasone intensiteit en duur was consistent met in vitro cel experimenten.

Na de generatie van extracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) was gedetecteerd met de SOSG assay, werd de productie van intracellulaire ROS gedetecteerd door een DCFH-DA-gebaseerde ROS assay kit. MDA-MB-231 cellen werden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 1 × 10⁵ cellen per CLSM fles. Daarna werden ze willekeurig verdeeld in zes groepen: de controlegroep (zonder behandeling), de N₂O-mbs alleen groep (100 μL, 1 × 10⁵ bellen/mL), de C₃F₈-mbs alleen groep (100 μL, 1 × 10⁵ bellen/mL), de LIFU alleen groep (2 W/cm² voor 100 s), de LIFU–C₃F₈-mbs groep, de LIFU–N₂O-mbs groep. Na incubatie gedurende 24 uur om celhechting toe te staan, werd elke groep onderworpen aan de corresponderende experimentele interventie zoals hierboven beschreven. Daarna werd hetzelfde bedrag DCFH-DA (30 μM) aan de corresponderende schaal in elke groep toegevoegd, en de schaal werd 20 minuten in het donker geïncubeerd. De cellen werden dan zachtjes 3 keer gespoeld met PBS om de DCFH-probe die niet in de cel binnenkwam te verwijderen. Ten slotte werd de generatie van intracellulaire ROS bepaald door CLSM. Om de SDT efficiëntie van N₂O-mbs verder te verifiëren, werden cellen gezaaid in 6-putten platen, gekweekt gedurende 24 uur en willekeurig verdeeld in zes groepen, zoals hierboven beschreven. Vervolgens werden de corresponderende behandelingen in elke groep uitgevoerd. De cellen in elke groep werden gedigesteerd en bereid tot celsuspensies bij geschikte concentraties en in een CLSM schaal geplaatst. Ten slotte werden de cellen gescand door CLSM na co-kleuring met CAM en PI kleurstoffen om dode (rode) en levende (groene) cellen te differentiëren. Apoptose werd gedetecteerd door flowcytometrie en Annexin V-FITC/PI kleuring. Na 1 uur behandeling werd elke groep cellen gecentrifugeerd, en de cellen werden verzameld. Na Annexin V-FITC/PI co-kleuring werd flowcytometrie (Becton–Dickinson, Franklin Lakes, NJ) detectie uitgevoerd.

In Vitro Sonodynamisch Effect van N₂O-mbs Verbetert HIFU Behandelingseffectiviteit

Een HIFU systeem (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) samengesteld uit diagnostische ultrasone eenheid, een therapeutische ultrasone eenheid en een centraal verwerkingssysteem werd gebruikt zoals eerder beschreven [29]. De HIFU parameters die voor behandelingsdoeleinden werden gebruikt, waren als volgt: werkende frequentie, 0,94 MHz; brandpuntafstand, 140 mm; diameter, 220 mm; en real-time diagnostische transducer frequentie, 3,5 MH. De geïntegreerde transducers werden ondergedompeld in ontgaste water. Om het versterkingseffect van N₂O-mbs op HIFU behandeling te evalueren, werden MDA-MB-231 cellen gecentrifugeerd, 5 × 10⁵/mL, en verdeeld in vier groepen: de controlegroep (zonder behandeling), de HIFU alleen groep (125 W, 5 s), de HIFU–N₂O-mbs alleen groep, de HIFU–C₃F₈-mbs alleen groep. Vervolgens werden de verschillende respectieve behandelingen voor elke groep uitgevoerd. De behandelde cellen werden gecentrifugeerd en gewassen met PBS, dubbel gekleurd met Annexin V-FITC/PI en geoogst voor flowcytometrie. De stikstofmonoxide (NO) probe DAF-FM werd gebruikt om NO in het supernataat van elke behandelingsgroep te detecteren. Alle experimenten werden 3 keer uitgevoerd. TEM werd gebruikt om de ultrastructuur morfologie van de behandelde cellen te identificeren. Na elke behandeling werden de behandelde cellen onmiddellijk fixatie met 2% OsO₄, gedeshydrateerd in een gegraalde reeks alcohol, en plat ingebed in Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Ultra-dunne coupes (100 nm) werden bereid, gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat, en onderzocht onder een elektronenmicroscoop.

Ex Vivo en In Vivo Sonodynamisch Effect van N₂O-mbs Verbetert HIFU Ablatie Effectiviteit

Verse bovine leverweefsels werden gekocht van lokale slachthuis en gebruikt binnen 12 uur na slachten. Verse ex vivo bovine lever met weinig bindweefsel en minder bloedvaten werd gesneden in 10 cm × 5 cm × 5 cm sectie en ontgast gedurende 1 uur bij 37 °C. De bovine levers werden verdeeld in drie groepen: C₃F₈-mbs groep, N₂O-mbs groep en PBS groep. Eerst werd verse geïsoleerde bovine lever in een container met ontgast water geplaatst. Vervolgens werd 200 μL (1 × 10⁵ bellen/mL) microbellen in PBS direct geïnjecteerd in de bovine lever op de manier getoond in Fig. 6a. Onder de begeleiding van een diagnostische ultrasone transducer, werd het HIFU brandpunt gepositioneerd op de injectieplaats. Vervolgens werd de therapeutische transducer gebruikt om 5 s ablatie uit te voeren bij verschillende vermogens (100 W, 125 W, 150 W) op de bovine lever injectieplaats. Ten slotte werd het coagulatieve necrotische volume van het doelgebied in het bovine leverweefsel berekend volgens de gemeten maximale lengte, breedte en diepte (mm) door de volgende vergelijking: V (mm³) = π/6 × lengte × breedte × diepte. Bovendien werd de grijswaarde van het doelgebied voor en na HIFU ablatie in elke groep vastgelegd op de diagnostische ultrasone beelden.

Twintig tumordragende muizen werden willekeurig verdeeld in vier groepen (n = 5 per groep), waaronder een controlegroep (zonder enige behandeling), een HIFU–PBS groep, een HIFU–C₃F₈-mbs groep, en een HIFU–N₂O-mbs groep. HIFU (125 W, 5 s) ablatie van tumor werd toegepast nadat de muizen een intraveneuze injectie van 200 μL van C₃F₈-mbs groep, N₂O-mbs en PBS ontvingen. De HIFU ablatieprocedure van solide tumoren was vergelijkbaar met die van ex vivo geïsoleerde bovine lever. Eerst werden muizen geanesthetiseerd met 1% pentobarbitaal (8 mL/kg). De tumorplaats van de muis werd geïnculeerd in een container met ontgast water. Onder de begeleiding van een diagnostische ultrasone transducer, werd het HIFU brandpunt gepositioneerd op het tumorweefsel. De muizen lichaamsgewichten en het tumorvolume werden vastgelegd met een 3-daags interval. Ten slotte werden alle muizen 21 dagen na behandeling gedood en tumorweefsels gedissecteerd van de muizen en vervolgens gezonden voor H&E, prolifererend cel kern antigeen (PCNA) kleuring, terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).

Statistische Analyse

Alle data werden gepresenteerd en geanalyseerd met GraphPad Prism (versie 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Data worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Elk experiment werd tenminste 3 keer herhaald. Statistische analyses werden uitgevoerd door eenrichtings ANOVA met Bonferroni post-test (vergelijking van alle groepen) of Dunnett post-test (vergelijking van alle groepen met een controlegroep). Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisatie van N₂O-mbs

De bereiding van N₂O-mbs door de gewijzigde mechanische oscillatiemethode resulteert in een hoge stabiele melkachtige witte suspensie (Fig. 1a). De N₂O-mbs veranderden niet significant in deeltjesgrootte en morfologie na 72 uur opslag bij kamertemperatuur. Onder de lichtmicroscoop werden N₂O-mbs waargenomen met uniforme grootte, goede dispersie en hoge stabiliteit (Fig. 1b). De concentratie van N₂O-mbs was 5,12 ± 0,45 × 10⁸ bellen/mL. Zoals getoond in de TEM beelden (Fig. 1c), was de grootte van N₂O-mbs gelijkmatig verdeeld, en de gemiddelde grootte was ongeveer 450 nm. De N₂O-mb dynamische lichtverstrooiing resultaten onthulden hydrodynamische diameters van 458,1 ± 17,26 nm (polydispersiteitsindex = 0,368; Fig. 1d), wat consistent was met de TEM resultaten. De potentiaal van de N₂O-mbs was −16,2 ± 0,35 mV (Fig. 1e) (Aanvullend bestand 1: Figuur S1).

Intracellulaire Opname en Biocompatibiliteit van N₂O-mbs

De cytotoxiciteit van N₂O-mbs tegen cellen in vitro werd onderzocht door de CCK-8 methode. We definieerden de cellevensvatbaarheid van de controlegroep als 100%. Na 24 uur incubatie lieten de cellevensvatbaarheidsresultaten geen significante cytotoxiciteit aan MDA-MB-231 cellen zien. Zelfs bij hoge N₂O-mb concentraties, bleef de cellevensvatbaarheid groter dan 95% (Fig. 2a). De cytotoxiciteit van N₂O-mbs in vivo op gezonde naakte muizen werd geanalyseerd. Zoals getoond in Fig. 2b, toonde histopathologie analyse van hooforganen (hart, lever, milt, long en nieren) aan dat N₂O-mbs geen significante toxische schade aan muizen veroorzaakten. Deze resultaten gaven aan dat N₂O-mbs een hoge biocompatibiliteit hebben.

De intracellulaire opname van N₂O-mbs over verlengde incubatietijden (2 uur en 4 uur) werd gevisualiseerd door CLSM. De incubatie van cellen met DiI-gemarkeerde N₂O-mbs resulteerde in de accumulatie van een groot aantal N₂O-mbs in de kankercel membraan en cytoplasma. Zoals getoond in Fig. 2c, was er een goede co-lokalisatie van rode fluorescente N₂O-mbs met de blauwe fluorescente cellen. Deze bevinding suggereert dat N₂O-mbs efficiënt geïternaliseerd worden in MDA-MB-231 kankercellen.

Sonodynamisch Effect van N₂O-mbs In Vitro

SOSG is een veelgebruikte singulet zuurstof detectie probe die hoog gevoelig en betrouwbaar is voor de detectie van zuurstofvrije radicalen generatie. Om het potentieel van N₂O-mbs als sonosensitizer te verkennen, werd SOSG gebruikt om ROS generatie in vitro te detecteren [30, 31]. SOSG combineert met ¹O₂ om SOSG-EP te vormen, wat gekenmerkt wordt door een toename in fluoresentie-intensiteit. Zoals getoond in Fig. 3a, na ultrasone bestraling van SOSG oplossing bevattende N₂O-mbs, steeg de fluoresentie-intensiteitswaarde significant; in vergelijking met die in de overige groepen, was de productie van zuurstofvrije radicalen significant toegenomen (p < 0,01).

Naast de detectie van ROS generatie in waterige oplossing na ultrasone bestraling van N₂O-mbs, werd een DCFH-DA ROS assay kit gebruikt om de intracellulaire ROS productie door N₂O-mbs te bepalen. Zoals getoond in Fig. 3b, toonde de positieve controlegroep de sterkste fluoresentie-intensiteit. De volgende sterkste groene fluoresentie signaal verscheen alleen in de LIFU–N₂O-mbs groep, wat de consequent productie van ROS in de gelijktijdige aanwezigheid van N₂O-mbs en LIFU bestraling onthulde. Echter, geen duidelijke fluoresentie werd gedetecteerd in enige van de overige groepen (Fig. 3c). De cellevensvatbaarheid van de controlegroep werd gedefinieerd als 100%. De CCK-8 assay resultaten lieten ongeveer 46% celdood zien in de LIFU–N₂O-mbs groep (Fig. 3d). De cytotoxiciteit van N₂O-mbs in combinatie met LIFU werd geëvalueerd door CLSM observatie van celdood na behandeling. CAM werd gebruikt om levende cellen te kleuren met groene fluoresentie. PI werd gebruikt om dode cellen te kleuren met rode fluoresentie. Zoals getoond in Fig. 4a, waren er veel dode cellen in de LIFU–N₂O-mbs groep. Verder toonden de flowcytometrie resultaten aan dat de apoptosegraad van de MDA-MB-231 celgroep significant hoger was dan die van andere groepen (p < 0,05) na de gecombineerde N₂O-mbs met LIFU behandeling (Fig. 4b). De gecombineerde C₃F₈-mbs met LIFU behandeling veroorzaakte geen duidelijke celdood of apoptose. De resultaten gaven verder aan dat uitgebreide apoptose en necrose optraden in reactie op SDT. De flowcytometrie resultaten waren consistent met die van de CLSM. Deze resultaten geven aan dat N₂O-mbs gecombineerd met LIFU tumorcel apoptose in vitro induceren (Aanvullend bestand 2: Figuur S2; Aanvullend bestand 3: Figuur S3).

In Vitro HIFU Synergistisch Effect Beoordeling in Kankercellen

De flowcytometrie resultaten worden getoond in Fig. 5a. Zowel N₂O-mbs als C₃F₈-mbs verhoogden de sterfte van MDA-MB-231 cellen na HIFU ablatie. Verder, in vergelijking met HIFU-C₃F₈-mbs, verhoogden N₂O-mbs de MDA-MB-231 apoptose significant (p < 0,05; Fig. 5b). De resultaten van de NO test lieten zien dat de fluoresentie-intensiteit van het supernataat van de HIFU–N₂O-mbs groep ook significant hoger was dan die van de overige groepen (p < 0,05) (Fig. 5c). Veranderingen in het cytoplasma en organellen werden waargenomen door TEM (Fig. 5d). De cel in de controlegroep (zonder enige behandeling) toonde complete celmorfologie. Grote hoeveelheden vacuolaire stoffen werden gevonden in het celcytoplasma van de HIFU groep. Maar de cellen hebben nog steeds complete celmembranen en kernmembranen. Echter, zowel de HIFU–N₂O-mbs groep als de HIFU–C₃F₈-mbs groep toonden een verlies van celmembraanintegriteit en complete desintegratie van de celstructuur. Het was de moeite waard om te vermelden dat de TEM observaties slechts het moment in het proces van celdood en apoptose na de behandeling in elke groep waren. N₂O-mbs als exogene microbellen hebben een duidelijk synergistisch effect op de HIFU behandeling. In de HIFU–N₂O-mbs groep kan het sonodynamische effect van N₂O-mbs meer celapoptose promoten. De resultaten zijn gevalideerd in zowel flowcytometrie detectie als in vivo experiment (Aanvullend bestand 4: Figuur S4; Aanvullend bestand 5: Figuur S5).

N₂O-mbs als Synergist voor HIFU Therapie

Na HIFU ablatie van de geïsoleerde bovine lever, trad een grijs-witte coagulatieve necrotische regio op in het doelgebied (Fig. 6b). De gemiddelde echo-intensiteitsveranderingen in het doelgebied voor en na HIFU worden getoond in Fig. 6c. In vergelijking met die van de PBS groep, waren de doelecho-intensiteitswaarden van de C₃F₈-mbs groep en de N₂O-mbs groep significant toegenomen na HIFU behandeling (p < 0,05) en namen toe naarmate de HIFU ablatie-intensiteit toename. Het coagulatieve necrotische volume van de laatste twee groepen en de echo-intensiteit van de B-mode ultrasone beelden van het doelgebied namen allebei toe naarmate het HIFU vermogen toename (Fig. 6d, e).

Het synergistische effect van N₂O-mbs op HIFU therapie werd verder geverifieerd in vivo. Zoals getoond in Fig. 7a, werden de digitale foto's van muizen en corresponderende tumorweefsels vastgelegd 21 dagen na verschillende behandelingen. Tumor groei was effectiever geremd na N₂O-mbs gecombineerd met HIFU behandeling. Het synergistische effect van N₂O-mbs op HIFU behandeling werd ook geëvalueerd door H&E, PCNA en TUNEL kleuring (Fig. 7b), wat aantoonde dat N₂O-mbs gecombineerd met HIFU bestraling een grotere schaal van tumorcel necrose kon veroorzaken in vergelijking met HIFU–C₃F₈-mbs groep. De celmorfologie veranderingen getoond in HIFU–N₂O-mbs waren duidelijker dan andere groepen, waaronder karyopyknose, karyorrhexis en karyolyse, wat de substantiële necrose van kankercellen aangeeft.

Daarnaast vertoonde het tumorvolume van HIFU–N₂O-mbs een meer significante geremde neiging dan HIFU–C₃F₈-mbs binnen de 21 dagen (Fig. 7c, d).

Discussie

HIFU, als een nieuwe methode van oncotherapie, is klinisch erkend en heeft opmerkelijke vooruitgang geboekt in de behandeling van veel solide tumoren [32]. Het thermische effect, cavitatie-effect, mechanisch effect en akoestisch chemisch effect spelen een significante rol in het doden van tumorcellen en het veroorzaken van onomkeerbare schade aan het doelgebied weefsel tijdens HIFU ablatie [33]. HIFU heeft beperkte impact op omringende normale weefsels en is essentieel een non-invasieve tumorbehandeling. Echter, de energie gedragen door de ultrasone wordt gedempt door de verhoogde transmissieafstand, absorptie door de bloedstroom in het doelgebied en de blokkade van botten of gas in het lichaam tijdens de HIFU behandeling, zodat de energie overgedragen aan het doelgebied wordt verminderd. Echter, het verlengen van de ablatietijd en het verhogen van de behandelingsvermogen verhoogt het risico op normaal weefsel schade, zoals brandwonden, neurovasculaire schade en andere complicaties [34]. Daarom is het nodig om de effectiviteit van HIFU te verhogen. Veel studies hebben bevestigd dat zowel microbellen als SDT de effectiviteit van HIFU kunnen verbeteren [15, 16, 35]. De N₂O-geladen microbellen bereid in deze studie hebben een kleinere deeltjesgrootte, maar vergelijkbare kenmerken als ultrasone microbel contrastmiddelen. Studies hebben getoond dat nano/microbellen dezelfde beeldvormingscapaciteit hebben als microbellen in vitro, maar een grotere capaciteit in vivo [36]. Dus, N₂O-mbs kunnen niet alleen gebruikt worden voor ultrasone begeleiding en lokalisatie voor HIFU behandeling, maar ook als exogene microbellen om de effectiviteit van HIFU te verbeteren (Aanvullend bestand 6: Figuur S6). Tegelijkertijd kan het sonodynamisch effect van N₂O-mbs de effectiviteit van HIFU effectief verbeteren. De generatie van ROS na ultrasone excitatie is een van de belangrijkste factoren voor sonosensitizers [16]. Om de sonogevoeligheid van N₂O-mbs te verifiëren, werd de productie van ROS in zowel extracellulaire als intracellulaire omgevingen gedetecteerd in deze studie. Het consistente resultaat van beide testen toonde aan dat N₂O-mbs ROS kunnen genereren in zowel waterige oplossing als intracellulair. Studies hebben ook getoond dat gassen (N₂ en O₂) ingeperkt in cavitatiekernen in oplossing kunnen splitsingsreacties ondergaan en N en O vrije radicalen produceren [37, 38], als volgt:

$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$

Het cavitatie-effect en het voordeel van microbel verpakking verminderen de moeilijkheid van de N₂O reactie [39]. Wanneer geïncubeerd met cellen, vertonen N₂O-mbs een goede biocompatibiliteit. De hoge selectiviteit, hoge affiniteit en hoge medicijnlading van nanopartikelen [40], evenals de actieve fagocytose door cellen, bevorderen efficiënte N₂O-mbs binding aan kankercellen. De nanobellen tonen verhoogde penetratie, stabiliteit en gemak van celbinnenkomst of aggregatie rond de cellen [36]. Bovendien kan het sonoporatie-effect van ultrasone de overdracht van microbellen in cellen effectief bevorderen [41].

In contrast met de traditionele microbel contrastmiddel C₃F₈-mbs, hebben N₂O-mbs een grotere inhibitorische effect op celdeling na ultrasone bestraling, gekenmerkt door verhoogde intracellulaire ROS, verminderde cellevensvatbaarheid, en apoptose en necrose. Deze resultaten gaven voorlopig het sonodynamische toxische effect van N₂O-mbs aan.

In het HIFU synergie experiment, werden de behandelingsparameters in de experimentele groep ingesteld op 125 W voor 5 s door analyse en vergelijking van de experimentele resultaten en raadpleging van de literatuur, wat valideerde dat een lage HIFU vermogen voldoende ablatie-effect kon induceren en nadelige effecten kon reduceren. De resultaten lieten zien dat N₂O-mbs de necrose en gevorderde apoptose van meer tumorcellen verhoogden. N₂O-mbs fungeerden als nanoschaalse microbel synergist en het sonodynamische effect ervan in reactie op HIFU kan de reden zijn voor de verschillende experimentele resultaten. Als microbel verhoogden N₂O-mbs de depositie van HIFU energie in het doelgebied en verhoogden de temperatuur van het doelgebied en versterkten het thermische effect van HIFU behandeling [11]. De generatie van het cavitatie-effect is nauw gerelateerd aan de cavitatiedrempel en cavitatiekern concentratie [42]. N₂O-mbs waren cavitatiekernen die de cavitatiedrempel van HIFU verlaagden en het cavitatie-effect vergemakkelijkten. Daarom bevorderden N₂O-mbs effectief celnecrose. Als nanoschaalse microbel synergist, werden N₂O-mbs gelyseerd en genereerden vrije radicalen en stikstofoxide in reactie op ultrasone. Studies hebben bevestigd dat ROS belangrijke factoren zijn in apoptose inductie [43]. Het is de moeite waard om op te merken dat veel soorten vrije radicalen schade aan cellen kunnen veroorzaken. Naast de generatie van zuurstofradicalen, kan N₂O andere typen vrije radicalen genereren in splitsingsreacties, zoals stikstofvrije radicalen, die bijdragen aan het doden van tumorcellen. Een kleine hoeveelheid stikstofmonoxide (NO) productie werd gedetecteerd in het celsupernataat na HIFU behandeling, wat verder aangeeft dat de N₂O splitsingsreactie plaatsvond. An et al. [44] rapporteerden dat NO een anti-tumor functie kan hebben, het mechanisme waarvan betreft NO die verdachte ijzerenzymen aanvalt die ervoor zorgen dat cellen niet kunnen groeien en delen wanneer ze gevangen zijn. Bovendien kan instabiele NO interageren met zuurstofmoleculen om hydroxyle radicalen (HO^·) en NO₂ te vormen. Hydroxyle radicalen zijn extreem cytotoxisch en bevorderen tumorcelapoptose. NO is ook een endotheel-afgeleide ontspanningsfactor. De generatie van NO kan de reden zijn voor hyperemie en abnormale zwelling bij patiënten tijdens HIFU operatie. In een geëxciseerde bovine lever experiment, vergelijken we zorgvuldig de echo-intensiteit van B-mode ultrasone beelden, pathologische veranderingen en coagulatieve necrotische volume van het doelgebied na HIFU ablatie in de aanwezigheid van N₂O-mbs, C₃F₈-mbs en PBS. Alle deze resultaten waren consistent. In vergelijking met PBS, versterkten N₂O-mbs effectief het ablatie-effect van HIFU. Dit synergistische effect werd ook beter gedemonstreerd in de ablatie van solide tumor in vivo, ge manifesteerd door toegenomen tumorcelapoptose, verminderd tumorvolume en tumorgroei remming. Deze bevinding geeft verder aan dat N₂O-mbs een nieuw soort hulpmiddel voor ultrasone kan zijn dat gebruikt kan worden om HIFU thermische tumorablatie te promoten. Het synergistische effect van N₂O-mbs in HIFU en het synergistische mechanisme bieden nieuwe ideeën en theoretische praktijk voor HIFU synergist onderzoek. Maar, de andere gerelateerde mechanismen van de synergie moeten verder verkend worden. Het effect van tumorablatie door HIFU gecombineerd met N₂O-mbs moet verder onderzocht worden.

Conclusie

Samengevat, hebben we N₂O-mb nanopartikelen ontwikkeld. De karakterisatie en biocompatibiliteit van de N₂O-mbs werden bepaald. De sonogevoeligheid van N₂O-mbs werd onderzocht door de productie van ROS in waterige oplossing en intracellulair te detecteren. In vergelijking met C₃F₈-mbs, genereerden N₂O-mbs ROS en promoveerden de apoptose en necrose van tumorcellen, wat buitengewone sonogevoeligheid vertoonde. In de HIFU synergie experimenten, verhoogden de sonodynamische effecten van N₂O-mbs significant de apoptose en necrose van tumorcellen in vitro, en verhoogden het coagulatieve necrotische volume en echo-intensiteit in het ex vivo geïsoleerde bovine lever doelgebied, en remden effectief tumorgroei in vivo. Deze resultaten suggereren dat N₂O-mbs een nieuw type sonosensitizer en een nieuw hulpmiddel voor ultrasone therapie kunnen zijn dat gebruikt kan worden voor de ablatie van tumoren door HIFU.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De conclusies gemaakt in dit manuscript zijn gebaseerd op de data die allemaal gepresenteerd en getoond worden in dit artikel.

Afkortingen

N₂O-mbs:

N₂O microbellen

C₃F₈-mbs:

C₃F₈ microbellen

HIFU:

hoog-intensiteit gefocuste ultrasone

LIFU:

laag-intensiteit gefocuste ultrasone

SOSG:

singulet zuurstof sensor groen

SDT:

sonodynamische therapie

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-fosfocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenylindole

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescine diacetaat

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescine, diacetaat

CAM:

Calceïne-AM

CCK-8:

Cel Tel Kit-8

CLSM:

confocale laser scanning microscopie

TEM:

transmissie elektronenmicroscoop

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

FBS:

foetale runderserum

PBS:

fosfaatgebufferde zoutoplossing

DI:

gedemineraliseerd water

ROI:

regio's van interesse

ROS:

reactieve zuurstofsoorten

NO:

stikstofmonoxide