The Study of Enhanced High-Intensity Focused Ultrasound Therapy door Sonodynamic N2O Microbubbles

Materialen en methoden

Materialen

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-fosfocholine (DPPC) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N -[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-mPEG2000) werden gekocht bij Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, VS). Glycerine en agarose werden verkregen van Sigma Aldrich (St. Louis, MO, VS). N₂ O en C₃ F₈ werden gekocht van Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI), 2′,7′-dichloorfluorescinediacetaat (DCFH-DA) , 3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluoresceïne, diacetaat (DAF-FM DA) en CCK-8 werden gekocht bij Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calcein-AM (CAM) en propidiumjodide (PI) werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (TX, VS). Annexine V-FITC/PI werd verkregen van Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Singlet zuurstofsensor groen (SOSG) is gekocht bij Invitrogen (NY, VS).

Voorbereiding van N₂ O-mbs en C₃ F₈ -mbs

N₂ O-mbs werden bereid door de roterende film in combinatie met de mechanische oscillatiemethode. We namen DPPC en DSPE-PEG2000 als schaalmaterialen en N₂ O als de kern. In het kort werden 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 en 10 ml chloroform gelijktijdig in een rondbodemkolf gegoten, gemengd en volledig opgelost door ultrasone golven. Vervolgens werden de lipidefilms gevormd door een roterende verdamper (60 min, 55 ° C, 100 r/min). Vervolgens werd 2 ml 10% glycerol toegevoegd om de lipidefilms te hydrateren en een suspensie te bereiden. 500 L waarvan werd toegevoegd aan een capsulebuis. De capsulebuis was afgesloten met een rubberen dop. De lucht in de buis is vervangen door N₂ O en C₃ F₈ door een gasverplaatsingsinrichting. Vervolgens werd de suspensie gedurende 150 s mechanisch geoscilleerd door een zilver-kwikcapsulemixer (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China). Ten slotte werd de resulterende suspensie onderworpen aan differentiële centrifugatie om doel N₂ . te verkrijgen O-mbs, en werd gedurende 5 minuten bij 300 rpm gecentrifugeerd en vervolgens gedurende 5 minuten bij 800 rpm gecentrifugeerd. N₂ O-mbs werden opnieuw gesuspendeerd in PBS en vervolgens bewaard bij 4 °C voor verder gebruik.

De C₃ F₈ -mbs werden vervaardigd met behulp van dezelfde mechanische oscillatiemethode, zoals eerder beschreven [25]. DiI-gelabeld N₂ O-mbs kunnen worden bereid door DiI toe te voegen tijdens spinfilmvorming. Het is vermeldenswaard dat N₂ O heeft een laag molecuulgewicht en is onstabiel. De N₂ O in de microbel loopt gemakkelijk over. Daarom wordt de halfwaardetijd van de microbel verminderd. C₃ F₈ is een macromoleculair inert gas dat veel wordt gebruikt in de studie van ultrasone microbellencontrastmiddelen. C₃ F₈ kan de stabiliteit van de microbellen verhogen. Daarom is in deze studie N₂ O en C₃ F₈ (2:1) werden gemengd als de N₂ O-mbs-kern om hun stabiliteit te vergroten.

Fabricatie- en prestatiedetectie van N₂ O-mbs

De morfologie en grootteverdeling van N₂ O-mbs werden waargenomen onder optische helderveldmicroscopie. De concentraties van N₂ O-mbs en C₃ F₈ -mbs werden berekend met een globulimeter volgens de rekenrichtlijnen. De gemiddelde deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de N₂ O-mbs werden bepaald door een dynamisch laserlichtverstrooiingssysteem (Malvern Instruments, Malvern, VK). De structuur en morfologie van de N₂ O-mbs werden gekenmerkt door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). De voorbereide N₂ O-mbs werden bewaard bij 4 ° C. Om de stabiliteit van N₂ . te observeren O-mbs, de morfologie en concentratie werden geregistreerd op de eerste, tweede en derde dag. Tegelijkertijd werden de gemiddelde deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de microbellen bepaald.

Celcultuur en diermodel

Menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) werden gedurende minder dan 3 maanden na reanimatie in het laboratorium gepasseerd. De cellen werden bewaard in een incubator van 37 °C met 5% CO₂ , met DMEM met 10% foetaal runderserum, 50 g/L streptomycine en 50 μg/L penicilline. Toen de cellen 80% samenvloeiing bereikten, werden ze gebruikt voor experimenten.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van de Chongqing Medical University. Een bepaald aantal vrouwelijke naakte muizen (4-6 weken oud; gewicht van 15-20 g) werd gekocht bij Animal Experiment Center van Chongqing Medical University (Chongqing, China). Voor de vestiging van solide tumor, MDA-MB-231-cellen (1 × 10 ⁶ cellen/mL) gesuspendeerd in normale zoutoplossing (100 L) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechter achterflank van elke muis. Alle tumordragende muizen werden gebruikt voor therapeutische experimenten toen de tumorvolumes ongeveer 150 mm bereikten ³ .

Intracellulaire opname en biocompatibiliteitsevaluatie van N₂ O-mb

MDA-MB-231-cellen in de groeifase werden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 1 × 10 ⁵ cellen per confocale laser scanning microscopie (CLSM) kolf gedurende 24 uur. Vervolgens 100 μL (1 × 10 ⁵ bellen/ml) van met DiI gelabelde N₂ O-mbs complete medium verdunningsoplossing werd toegevoegd om de confocale schaal met medium te vullen. De schaal werd afgesloten met microplaatafdichters en omgekeerd bewaard in een incubator, waarbij de N₂ O-mbs in contact met de cellen. Na 2 uur en 4 uur co-incubatie werden de cellen 3 keer voorzichtig gewassen met PBS, gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten en gekleurd met DAPI gedurende 20 minuten. Ten slotte is het celtargeting-gedrag van N₂ O-mbs werd waargenomen door CLSM (Nikon A1, Japan).

De cytotoxiciteit van N₂ O-mbs werd geëvalueerd met een standaard CCK-8-assay. MDA-MB-231-cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes (5 × 10 ⁴ cellen/putje) gedurende 24 uur. Vervolgens 100 μL verschillende concentraties (1 × 10 ⁴ /mL, 1 × 10 ⁵ /mL, en 1 × 10 ⁶ /mL) van N₂ O-mb zijn toegevoegd. Na 24 uur incubatie werd CCK-8-oplossing (10 L) aan elk putje toegevoegd. Vervolgens werden de MDA-MB-231-cellen nog 2 uur bij 37 ° C gekweekt. Ten slotte werd de absorptie van elk putje gemeten bij 450 nm met een Bio-Tek microplaatlezer (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, VS).

Tien gezonde, naakte vrouwelijke muizen van ongeveer 20 g werden willekeurig in twee groepen verdeeld. De N₂ O-mbs (n =5) groep werden intraveneus geïnjecteerd met N₂ O-mbs (200 μL, 1 × 10 ⁵ /mL) en de controlegroep (n =5) geïnjecteerd met normale zoutoplossing (200 L). Na 21 dagen werden de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) van alle muizen uitgesneden en gekleurd met hematoxyline-eosine (H&E).

In vitro SDT-efficiëntie van N₂ O-mbs

De methode voor detectie van zuurstofradicalen was gebaseerd op een eerder rapport [26]. In het kort werd 10 L SOSG (500 M) gemengd met 2 ml van de monsteroplossing. De behandelingen werden als volgt gegroepeerd:groep C (de blanco controlegroep), PBS alleen werd toegevoegd; N₂ O-mbs-groep, 100 μL van N₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ /ml) in 2 ml PBS-oplossing werd toegevoegd; C₃ F₈ -mbs groep, 100 μL van C₃ F₈ -mbs (1 × 10 ⁵ /ml) in 2 ml PBS-oplossing werd toegevoegd; LIFU-groep, PBS werd bestraald met echografie (2 W/cm ² ; Institute of Ultrasound Imaging of Chongqing Medical Sciences, Chongqing, China) gedurende 100 s; LIFU–N₂ O-mbs groep, PBS met toegevoegde N₂ O-mbs werd met ultrageluid bestraald; LIFU–C₃ F₈ -mbs groep, PBS met toegevoegde C₃ F₈ -mbs werd ultrageluid bestraald. De experimentele groepsbehandelingsparameters waren ingesteld op 2 W/cm ² en 100 s door de analyse en vergelijking van de experimentele resultaten en raadpleging van de literatuur [27, 28]. De ultrasone parameters die voor behandelingsdoeleinden werden gebruikt, werden als volgt ingesteld:frequentie, 650 kHz; brandpuntsafstand, 12,5 mm; pulsgolfmodus, 50% inschakelduur; en pulsduur, 1 s. Het genereren van singlet-zuurstof ( ¹ O₂ ) werd bepaald door fluorescentiespectrometrie (Cary Eclipse, Agilent Technologies) door de fluorescentie-intensiteit te meten (λ opwinding/λ emissie =504 nm/525 nm). De selectie van de ultrasone intensiteit en duur was consistent met in vitro celexperimenten.

Nadat het genereren van extracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) was gedetecteerd met behulp van de SOSG-assay, werd de productie van intracellulaire ROS gedetecteerd door een op DCFH-DA gebaseerde ROS-assaykit. MDA-MB-231-cellen werden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 1 × 10 ⁵ cellen per CLSM-kolf. Vervolgens werden ze willekeurig verdeeld in zes groepen:de controlegroep (zonder behandeling), de N₂ Alleen O-mbs groep (100 μL, 1 × 10 ⁵ bubbels/mL), de C₃ F₈ -mbs alleen groep (100 μL, 1 × 10 ⁵ bellen/ml), de groep met alleen LIFU (2 W/cm ² gedurende 100 s), de LIFU–C₃ F₈ -mbs groep, de LIFU–N₂ O-mbs groep. Na incubatie gedurende 24 uur om celhechting mogelijk te maken, werd elke groep onderworpen aan de overeenkomstige experimentele interventie die hierboven is beschreven. Vervolgens werd dezelfde hoeveelheid DCFH-DA (30 M) toegevoegd aan de overeenkomstige schaal in elke groep en werd de schaal 20 minuten in het donker geïncubeerd. De cellen werden vervolgens 3 keer voorzichtig gespoeld met PBS om de DCFH-sonde te verwijderen die de cel niet was binnengekomen. Ten slotte werd de generatie van intracellulaire ROS bepaald door CLSM. Om de SDT-efficiëntie van N₂ . verder te verifiëren O-mbs, cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes, 24 uur gekweekt en willekeurig verdeeld in zes groepen, zoals hierboven beschreven. Vervolgens werden de overeenkomstige behandelingen uitgevoerd in elke groep. De cellen in elke groep werden verteerd en bereid in celsuspensies in geschikte concentraties en in een CLSM-schaal geplaatst. Ten slotte werden de cellen gescand door CLSM na co-kleuring met CAM- en PI-kleurstoffen om dode (rode) en levende (groene) cellen te onderscheiden. Apoptose werd gedetecteerd door flowcytometrie en annexine V-FITC/PI-kleuring. Na 1 uur behandeling werd elke groep cellen gecentrifugeerd en werden de cellen verzameld. Na annexine V-FITC/PI co-kleuring werd flowcytometrie (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) detectie uitgevoerd.

In vitro sonodynamisch effect van N₂ O-mbs verbetert de werkzaamheid van de HIFU-behandeling

Een HIFU-systeem (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) bestaande uit een diagnostische ultrasone eenheid, een therapeutische ultrasone eenheid en een centraal verwerkingssysteem werd gebruikt zoals eerder beschreven [29]. De HIFU-parameters die voor behandelingsdoeleinden werden gebruikt, werden als volgt ingesteld:werkfrequentie, 0,94 MHz; brandpuntsafstand, 140 mm; diameter, 220 mm; en realtime diagnostische transducerfrequentie, 3,5 MH. De geïntegreerde transducers werden ondergedompeld in ontgast water. Om het verbeteringseffect van N₂ . te evalueren O-mbs op HIFU-behandeling, MDA-MB-231-cellen werden gecentrifugeerd, 5 × 10 ⁵ /mL, en verdeeld in vier groepen:de controlegroep (zonder behandeling), de groep met alleen HIFU (125 W, 5 s), de HIFU–N₂ Alleen O-mbs groep, de HIFU–C₃ F₈ -mbs enige groep. Vervolgens werden de verschillende respectieve behandelingen uitgevoerd voor elke groep. De behandelde cellen werden gecentrifugeerd en gewassen met PBS, dubbel gekleurd met Annexine V-FITC/PI en geoogst voor flowcytometrie. De stikstofmonoxide (NO)-sonde DAF-FM werd gebruikt om NO te detecteren in het supernatant van elke behandelingsgroep. Alle experimenten werden 3 keer uitgevoerd. TEM werd gebruikt om de ultrastructurele morfologie van de behandelde cellen te identificeren. Na elke behandeling werden de behandelde cellen onmiddellijk gefixeerd met 2% OsO₄ , gedehydrateerd in een gegradeerde reeks alcohol en plat ingebed in Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Er werden ultradunne coupes (100 nm) gemaakt, gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en onderzocht onder een elektronenmicroscoop.

Ex vivo en in vivo sonodynamisch effect van N₂ O-mbs verbetert de werkzaamheid van HIFU-ablatie

Verse runderleverweefsels werden gekocht bij een lokaal slachthuis en binnen 12 uur na het slachten gebruikt. Verse ex vivo runderlever met weinig bindweefsel en minder bloedvaten werd in plakjes van 10 cm x 5 cm x 5 cm gesneden en gedurende 1 uur bij 37 ° C ontgast. De runderlevers werden in drie groepen verdeeld:C₃ F₈ -mbs groep, N₂ O-mbs-groep en PBS-groep. Eerst werd vers geïsoleerde runderlever in een houder geplaatst die ontlucht water bevatte. Vervolgens 200 μL (1 × 10 ⁵ bellen / ml) microbellen in PBS werd direct in de runderlever geïnjecteerd op de manier die wordt getoond in Fig. 6a. Onder begeleiding van een diagnostische ultrasone transducer werd het HIFU-brandpunt op de injectieplaats gepositioneerd. Vervolgens werd de therapeutische transducer gebruikt om 5 s ablatie uit te voeren met verschillende vermogens (100 W, 125 W, 150 W) op de injectieplaats van de runderlever. Ten slotte werd het coagulatieve necrotische volume van het doelgebied in het runderleverweefsel berekend volgens de gemeten maximale lengte, breedte en diepte (mm) met de volgende vergelijking:V (mm ³ ) =π/6 × lengte × breedte × diepte. Bovendien werd de grijswaarde van het doelgebied voor en na HIFU-ablatie in elke groep vastgelegd op de diagnostische echografiebeelden.

Twintig tumordragende muizen werden willekeurig verdeeld in vier groepen (n =5 per groep), inclusief een controlegroep (zonder enige behandeling), een HIFU-PBS-groep, een HIFU-C₃ F₈ -mbs groep, en een HIFU–N₂ O-mbs groep. HIFU (125 W, 5 s) ablatie van tumor werd toegepast nadat de muizen een intraveneuze injectie van 200 μL C₃ hadden gekregen F₈ -mbs groep, N₂ O-mbs en PBS. De HIFU-ablatieprocedure van solide tumoren was vergelijkbaar met die van ex vivo geïsoleerde runderlever. Ten eerste werden muizen verdoofd met 1% pentobarbital (8 ml/kg). De tumorplaats van de muis werd geënt in een houder die ontlucht water bevatte. Onder begeleiding van een diagnostische ultrasone transducer werd het HIFU-brandpunt op het tumorweefsel gepositioneerd. Het lichaamsgewicht van de muizen en het tumorvolume werden geregistreerd met een interval van 3 dagen. Uiteindelijk werden alle muizen 21 dagen na de behandeling gedood en werden tumorweefsels uit de muizen gesneden en vervolgens opgestuurd voor H&E, prolifererende celkernantigeen (PCNA) kleuring, terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick-end labeling (TUNEL).

Statistische analyse

Alle gegevens werden gepresenteerd en geanalyseerd met GraphPad Prism (versie 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, VS). Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. Elk experiment werd minstens 3 keer herhaald. Statistische analyses werden uitgevoerd door eenrichtings-ANOVA met Bonferroni-posttest (alle groepen vergelijken) of Dunnett-posttest (alle groepen vergelijken met een controlegroep). Een waarde van p <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van N₂ O-mbs

De voorbereiding van N₂ O-mbs door de gemodificeerde mechanische oscillatiemethode resulteert in een zeer stabiele melkachtige witte suspensie (figuur 1a). De N₂ O-mbs veranderde niet significant in deeltjesgrootte en morfologie na 72 uur opslag bij kamertemperatuur. Onder de lichtmicroscoop, N₂ O-mbs werden waargenomen met uniforme grootte, goede dispersie en hoge stabiliteit (figuur 1b). De concentratie van N₂ O-mbs was 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ bubbels/ml. Zoals te zien is in de TEM-afbeeldingen (Fig. 1c), is de grootte van N₂ O-mbs was gelijkmatig verdeeld en de gemiddelde grootte was ongeveer 450 nm. De N₂ O-mb dynamische lichtverstrooiingsresultaten onthulden hydrodynamische diameters van 458,1 ± 17,26 nm (polydispersiteitsindex =0,368; Fig. 1d), wat consistent was met de TEM-resultaten. Het potentieel van de N₂ O-mbs was − 16,2 ± 0,35 mV (Fig. 1e) (Extra bestand 1:Figuur S1).

een Foto's van N₂ O-mbs gedispergeerd in gedeïoniseerd water; b afbeelding van N₂ O-mbs onder helderveld optische microscopie; c transmissie-elektronenmicroscoop opname van N₂ O-mbs; d grootteverdeling van N₂ O-mbs; e schijnbare zeta-potentiaal van N₂ O-mbs

Intracellulaire opname en biocompatibiliteit van N₂ O-mbs

De cytotoxiciteit van N₂ O-mbs tegen cellen in vitro werd onderzocht met de CCK-8-methode. We definieerden de levensvatbaarheid van de cellen van de controlegroep als 100%. Na 24 uur incubatie vertoonden de resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen geen significante cytotoxiciteit voor MDA-MB-231-cellen. Zelfs bij hoge N₂ O-mb-concentraties bleef de levensvatbaarheid van de cellen groter dan 95% (figuur 2a). De cytotoxiciteit van N₂ O-mbs in vivo op gezonde naakte muizen werd geanalyseerd. Zoals getoond in Fig. 2b, toonde histopathologische analyse van de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) aan dat N₂ O-mbs veroorzaakte geen significante toxische schade aan muizen. Deze resultaten gaven aan dat N₂ O-mbs hebben een hoge biocompatibiliteit.

een De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door middel van een CCK-8-assay; b H&E-kleuring van de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) bij gezonde vrouwelijke naakte muizen met of zonder het ontvangen van de N₂ O-mbs; c de afbeeldingen van a naar d toon cel in helder veld, celkernen gekleurd door DAPI, N₂ O-mbs gekleurd door DiI, en de samengevoegde resultaten van de drie fluorescentiebeelden; schaalbalk =50 m [NS geen significantie, vergeleken met controlegroep (0 bellen/ml)]

De intracellulaire opname van N₂ O-mbs gedurende langere incubatietijden (2 uur en 4 uur) werd gevisualiseerd door CLSM. De incubatie van cellen met DiI-gelabelde N₂ O-mbs resulteerde in de accumulatie van een groot aantal N₂ O-mbs in het kankercelmembraan en cytoplasma. Zoals weergegeven in Fig. 2c, was er een goede colokalisatie van rood fluorescerend N₂ O-mbs met de blauwe fluorescerende cellen. Deze bevinding suggereert dat N₂ O-mbs worden efficiënt geïnternaliseerd in MDA-MB-231 kankercellen.

Sonodynamisch effect van N₂ O-mbs in vitro

SOSG is een veelgebruikte singlet-zuurstofdetectiesonde die zeer gevoelig en betrouwbaar is voor de detectie van de vorming van vrije zuurstofradicalen. Het potentieel van N₂ . verkennen O-mbs als een sonosensitizer, SOSG werd gebruikt om ROS-generatie in vitro te detecteren [30, 31]. SOSG combineert met ¹ O₂ om SOSG-EP te vormen, dat wordt gekenmerkt door een toename van de fluorescentie-intensiteit. Zoals weergegeven in Fig. 3a, na ultrasone bestraling van SOSG-oplossing die N₂ bevat O-mbs, de fluorescentie-intensiteitswaarde nam significant toe; vergeleken met die in de rest van de groepen was de productie van vrije zuurstofradicalen significant verhoogd (p <0,01).

een Fluorescentiespectrum van SOSG met N₂ O-mbs bestraald door LIFU; b cellevensvatbaarheid werd bepaald door CCK8-assay; c confocale beelden van intracellulaire ROS-generatie (groene fluorescentie geeft positieve kleuring aan voor ROS gekleurd met DCFH-DA); d de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarde (DCFH-DA) van elke groep berekend door Image J. (De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, n =5 per groep, *p <0,05, vergeleken met LIFU–C₃ F₈ -mbs groep)

Naast de detectie van ROS-generatie in waterige oplossing na ultrasone bestraling van N₂ O-mbs, een DCFH-DA ROS-assaykit werd gebruikt om de intracellulaire ROS-productie door N₂ te bepalen O-mbs. Zoals weergegeven in figuur 3b, vertoonde de positieve controlegroep de sterkste fluorescentie-intensiteit. Het volgende sterkste groene fluorescentiesignaal verscheen alleen in de LIFU–N₂ O-mbs-groep, die de daaruit voortvloeiende productie van ROS onthult in de gelijktijdige aanwezigheid van N₂ O-mbs en LIFU-bestraling. Er werd echter geen duidelijke fluorescentie gedetecteerd in een van de overige groepen (figuur 3c). De cellevensvatbaarheid van de controlegroep werd gedefinieerd als 100%. De resultaten van de CCK-8-assay lieten ongeveer 46% celdood zien in de LIFU–N₂ O-mbs-groep (Fig. 3d). De cytotoxiciteit van N₂ O-mbs in combinatie met LIFU werd geëvalueerd door CLSM-waarneming van celdood na behandeling. CAM werd gebruikt om levende cellen te kleuren met groene fluorescentie. PI werd gebruikt om dode cellen te kleuren met rode fluorescentie. Zoals te zien is in figuur 4a, waren er veel dode cellen in de LIFU–N₂ O-mbs groep. Bovendien toonden de flowcytometrieresultaten aan dat de apoptosesnelheid van de MDA-MB-231-celgroep significant hoger was dan die van andere groepen (p <0.05) na de gecombineerde N₂ O-mbs met LIFU-behandeling (Fig. 4b). De gecombineerde C₃ F₈ -mbs met LIFU-behandeling veroorzaakten geen duidelijke celdood of apoptose. De resultaten gaven verder aan dat uitgebreide apoptose en necrose optraden als reactie op SDT. De resultaten van de flowcytometrie waren consistent met die van de CLSM. Deze resultaten geven aan dat N₂ O-mbs gecombineerd met LIFU induceren apoptose van tumorcellen in vitro (aanvullend bestand 2:figuur S2; aanvullend bestand 3:figuur S3).

een Flowcytometrie-analyse van apoptose en necrose van tumorcellen; b confocale beelden van CAM/PI co-gekleurde MDA-MB-231-cellen na verschillende behandelingen. De schaalbalken zijn 100 m

In vitro HIFU synergetische effectbeoordeling in kankercellen

De resultaten van de flowcytometrie worden getoond in Fig. 5a. Beide N₂ O-mbs en C₃ F₈ -mbs verhoogde de mortaliteit van MDA-MB-231-cellen na HIFU-ablatie. Bovendien, vergeleken met HIFU-C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs verhoogde significant MDA-MB-231-apoptose (p <0,05; Afb. 5b). De resultaten van de NO-test toonden aan dat de fluorescentie-intensiteit van het supernatant van de HIFU-N₂ O-mbs-groep was ook significant hoger dan die van de overige groepen (p <0,05) (Fig. 5c). Veranderingen in het cytoplasma en organellen werden waargenomen door TEM (figuur 5d). De cel in de controlegroep (zonder enige behandeling) vertoonde een volledige celmorfologie. In het celcytoplasma van de HIFU-groep werden grote hoeveelheden vacuolaire stoffen gevonden. Maar de cellen hebben nog steeds volledige celmembranen en kernmembranen. Echter, zowel de HIFU–N₂ O-mbs-groep en de HIFU–C₃ F₈ -mbs-groep vertoonde een verlies van celmembraanintegriteit en volledige desintegratie van de celstructuur. Het was vermeldenswaard dat de TEM-waarnemingen slechts het moment waren in het proces van celdood en apoptose na de behandeling in elke groep. N₂ O-mbs als exogene microbellen hebben een duidelijk synergetisch effect op de HIFU-behandeling. In de HIFU–N₂ O-mbs-groep, het sonodynamische effect van N₂ O-mbs zou meer celapoptose kunnen bevorderen. De resultaten zijn gevalideerd in zowel flowcytometriedetectie als in vivo-experimenten (Aanvullend bestand 4:Afbeelding S4; Aanvullend bestand 5:Afbeelding S5)

een Resultaten van annexine V-FITC/PI-bindingstest; b de gemiddelde celapoptosesnelheid in elke groep; c kwantitatieve analyse van NO-generatie van N₂ O-mbs bestraald door HIFU; d transmissie-elektronenmicroscopiebeeld van cellen. De schaalstaven zijn 100 m. (De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD, n =5 per groep, *p <0,05, vergeleken met controle, HIFU , HIFU–C₃ F₈ -mbs groepen)

N₂ O-mbs als synergist voor HIFU-therapie

Na HIFU-ablatie van de geïsoleerde runderlever verscheen een grijs-wit coagulatief necrotisch gebied in het beoogde gebied (figuur 6b). De gemiddelde echo-intensiteitsveranderingen in het doelgebied voor en na HIFU worden getoond in Fig. 6c. Vergeleken met die van de PBS-groep, zijn de doelecho-intensiteitswaarden van de C₃ F₈ -mbs groep en de N₂ O-mbs-groep was significant verhoogd na HIFU-behandeling (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

een Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

een Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Discussion

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. De N₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ en O₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Conclusie

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de gegevens die allemaal in dit artikel worden gepresenteerd en getoond.

Afkortingen

N₂ O-mbs:

N₂ O microbubbles

C₃ F₈ -mbs:

C₃ F₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

TEM:

transmission electron microscope

DMEM:

Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium

FBS:

fetal bovine serum

PBS:

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide