Targeting van miR‑410/Wnt‑11 reguleert botvorming en remt osteoclasten om femurkoposteonecrose te behandelen

Inleiding

Osteonecrose van de femurkop (ONFH), als een van de meest bekende ziekten die de heupgewrichten aantasten, leidt tot ernstige pijn of gewrichtsonmacht en treedt voornamelijk op bij middenleeftijdigen [1]. De therapie van volwassen ONFH, die 8,12 miljoen patiënten in China heeft, is nog steeds een uitdaging voor chirurgen [2]. Veel risicofactoren zijn geassocieerd met het optreden van ONFH, zoals hyperlipidemie, auto-immuunziektes, stollingsstoornissen, alcoholisme en hypercortisonisme [3]. Chirurgische behandeling omvat kerndecompressie met of zonder adjuvans, bijvoorbeeld autologe beenmerg, terwijl totale heupprothese (THR) gereserveerd blijft voor bejaarde patiënten of gevorderde osteonecrose die niet behandeld kan worden met gewrichtsbehoud [4]. Echter, ONFH heeft een ontevredenstellende prognose bij die patiënten die vaak THR vereisen [5]. Daarom is er een dringende behoefte om een accurate therapeutische target voor de behandeling van ONFH te verkennen.

MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van celfunctie en genexpressie, die een enorme functie uitoefenen op endotheliale homeostase en een nieuwe behandeling kunnen zijn [6]. Een studie heeft gerapporteerd dat miR-410 abnormaal geëxprimeerd is in verschillende humane kwaadaardige kankertypes en kan worden gebruikt als tumorremmer in endometrium-, longkanker, myeloom en borstkanker [7,8,9,10]. Een andere studie onthulde dat er een neuroprotectief effect is van miR-410 op een Parkinson-ziekte celmodel geïnduceerd door 6-hydroxydopamine door de PTEN/AKT/mTOR signaleringsweg te onderdrukken [11]. Bovendien is onthuld dat miR-410 de maligne biologische gedragingen van kinderen met acute lymfatische leukemie moduleert via targeting van FKBP5 en AKT signaleringspaden [12]. Een artikel heeft ook het inhibitorische effect van miR-410 targeting angiotensine II type 1 in pancreaskanker aangetoond [13]. Wnt-proteïne zijn een soort cysteine-rijke gesecreteerde lipoglycoproteïnen, die een enorme functie uitoefenen op ontwikkeling en ziekte [14]. Wnt-11 behoort tot de Wnt-signaleringsweg en is een positieve regulator die een cruciale rol speelt in carcinogenese [15]. Er is een studie gerapporteerd over de klinische significantie van de expressie van plaveiselcelcarcinoomantigeen en Wnt11 in cervixcarcinoom [16]. Bovendien is gepresenteerd dat TGF-β1 en Wnt11 synergistische signalen de expressie van sm-α-actine in de gladde spier drijven via de Rho kinase-actine-MRTF-A signalering [17]. Gebaseerd op de bovenstaande literatuur was het doel van de huidige studie om de rol van miR-410 die Wnt-11 reguleert op de preventie van ONFH te onderzoeken, en een hypothese wordt voorgesteld dat miR-410 targeting Wnt-11 de osteogene en osteoclastische mechanismen in de preventie van ONFH kan moduleren.

Materialen en methoden

Ethiekverklaring

De studie werd uitgevoerd onder goedkeuring van het Institutionele Review Board van Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, en volgde de beginselen van de Verklaring van Helsinki. Deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie. Alle dierproeven waren conform de Richtlijnen voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren van de National Institutes of Health. Het protocol was toegestaan door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University.

Studieonderwerpen

In totaal 30 patiënten die behandeld werden in de orthopedische afdeling van Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, van januari 2017 tot september 2018 werden geselecteerd. Onder deze patiënten werden 15 patiënten met ONFH behandeld met THR-chirurgie, de mediaanleeftijd van patiënten was 50,6 ± 4,3 jaar, en de lichaamsmassa was 57,0 ± 5,6 kg met 7 mannen en 8 vrouwen (ONFH-groep). Andere 15 patiënten met femurhalsfractuur werden behandeld met THR-chirurgie, de mediaanleeftijd was 59,6 ± 3,3 jaar, en de lichaamsmassa was 50,0 ± 5,6 kg met 9 mannen en 6 vrouwen (controle-groep). Er was geen opmerkelijk verschil in geslacht, leeftijd en gewicht tussen de twee groepen (P > 0,05) wat vergelijkbaar was. De weefsels in het subchondrale necrotische gebied werden genomen door te beitel langs de longitudinale lijn van de femurkop en opgeslagen bij −80 °C. Elke groep werd respectievelijk pathologisch en moleculair-biologisch onderzocht.

Hematoxyline-Eosine (HE) Kleuring

De monsters werden fixatie met 4% paraformaldechyde en gedecalcifieerd met 10% ethyleendiamine tetraazijnzuur, en de decalcificatievloeistof werd wekelijks ververst. De kleur van het beenmonster werd waargenomen en de decalcificatiegraad gemeten. Na volledige decalcificatie werd het monster in paraffin ingebed en op een dikte van 4 μm gesneden. De gebakken coupes werden gedoopt in xyleen I en xyleen II voor 10 minuten op volgorde, en de gedewachste coupes werden gedoopt in absolute alcohol I, absolute alcohol II, 95% alcohol, 80% alcohol en 70% alcohol voor 2 minuten, respectievelijk. Vervolgens werden de coupes gekleurd met hematoxyline voor 3 minuten en gedifferentieerd met 1% hydrochlorische acid alcohol voor 2 minuten. Daarna werden de coupes geweekt in 50%, 70% en 80% alcohol voor 2 minuten op volgorde en gedoopt in eosine voor 5 seconden. Vervolgens werden de coupes gedoopt in 95% alcohol, absolute alcohol I en absolute alcohol II voor 3 minuten en daarna in xyleen I en xyleen II voor 5 minuten op volgorde. Ten slotte werden de coupes geseald met neutrale gom en onder een microscoop bekeken.

Alkalische Fosfatase (ALP) Kleuring

Eén coupe werd geselecteerd in elk monster en gebakken bij 60 °C gedurende 60 minuten. De paraffin coupes werden gedewachst met xyleen I en xyleen II voor 15 minuten, respectievelijk, en gedoopt in absolute alcohol I, absolute alcohol II, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol en 75% ethanol voor 5 minuten op volgorde, en gereinigd met driedestilleerd water 2 minuten voor drie keer. De coupes werden besproeid met een substratenvloeistof bereid in ALP kleuringskit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), waardoor de substratenvloeistof het monster volledig bedekte, en vervolgens geïncubeerd bij 37 °C in het donker voor 15 minuten. De overbodige kleurstofoplossing werd weggegooid, en de coupes werden onmiddellijk besproeid met chromogene agent A voor 5 minuten en gereinigd met driedestilleerd water voor 30 seconden. Daarna werden de coupes gekleurd met chromogene agent B voor 30 seconden en tegengekleurd met reagent voor 30 seconden. De foto werd verkregen onder een 200× optische microscoop, en het aantal osteoblasten werd geteld via een beeldanalysesysteem voor microscoop (Image-Proplus 6.0).

Tartraat Resistente Zuur Fosfatase (TRAP) Kleuring

Eén coupe werd geselecteerd voor elk monster en geroosterd bij 60 °C gedurende 60 minuten. De paraffin coupes werden gedewachst met xyleen I en xyleen II voor 15 minuten, en gedoopt in absolute alcohol I, absolute alcohol II, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol en 75% ethanol voor 5 minuten op volgorde. De coupes werden fixatie met een bereide fixatievloeistof voor 30 seconden. De coupes werden in het kleuringsrek geplaatst en in een donkere doos met verse TRAP kleuringsoplossing (Sigma, St. Louis, MO, USA) geplaatst, de kleuringsoplossing moest de coupes volledig bedekken, en vervolgens werden de coupes geïncubeerd in een 37 °C waterbad voor 1 uur. Vervolgens werden de coupes tegengekleurd met hematoxyline voor 2 minuten en gedroogd. Omdat TRAP-kleuring vervalt met de tijd, werden de coupes direct onder de microscoop bekeken zonder te sealen. De foto werd verkregen onder een 200× optische microscoop, en het aantal osteoclasten werd geteld door het beeldanalysesysteem voor microscoop (Image-Proplus 6.0).

Immunohistochemische Kleuring

Na decalcificatie werden de coupes in paraffinwas ingebed en op een dikte van 4 μm gesneden. De coupes werden gedewachst met conventioneel xyleen, gedeshydrateerd met gradient alcohol, geïncubeerd met 3% H₂O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA) bij 7 °C gedurende 30 minuten, en vervolgens gekookt met 0,01 M citraatbuffer bij 95 °C gedurende 20 minuten. De coupes werden geblokkeerd met normale schaapserum werkvloeistof voor 10 minuten, gemengd met primaire antilichaam Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, Californië, USA) bij 4 °C overnachten, secundair antilichaam (klaar-voor-gebruik secundair antilichaam kit (PV-6000), ZSGB-Bio, Beijing, China) voor 20 minuten, en perioxidase-gemarkeerde streptomyces ovalbumine werkvloeistof (S-A/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Beijing, China) voor 2 minuten. De coupes werden ontwikkeld met diaminobenzidine (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, USA), tegengekleurd met hematoxyline (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China) en vervolgens geseald. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) verving het primaire antilichaam als negatieve controle (NC). Onder de lichtmicroscoop werden de positieve cellen gelokaliseerd met bruine reactanten in het cytoplasma, de sterke positieve expressie was donker bruingeel, de zwakke positieve expressie was licht bruingeel, en de negatieve expressie had geen kleuring. De kleuring van de celles werd waargenomen onder de lichtmicroscoop, vijf hoge-vermogen velden (400×) werden geobserveerd voor elke coupe, en 100 cellen werden geteld per veld. De gemiddelde waarde was het waarnemingsresultaat van elke coupe. In overeenstemming met de verhouding en verdeling van positieve cellen werd het als volgt bepaald: negatief (−), enkelcel kleuring, de positieve cellen minder dan 5%; zwak positief (+), verspreide of kleine celmassa kleuring, het aantal positieve cellen was 5–24%; positief (++), vlam of cluster celkleuring, het aantal positieve cellen was 25–50%; en sterk positief (+++), diffuse celkleuring, het aantal positieve cellen was meer dan 50%. De resultaten van immunohistochemie werden geëvalueerd met dubbelblinde score door twee personen onafhankelijk.

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Kettingreactie (RT-qPCR)

De totale RNA werd geëxtraheerd uit weefselmonsters door Trizol extractiekit (Invitrogen, Carlsbad, Californië, USA). De concentratie en zuiverheid van RNA werden bepaald. Primers werden ontworpen en gesynthetiseerd door Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan) (Aanvullend bestand 1: Tabel S1). Vervolgens werd RNA omgezet in cDNA met behulp van PrimeScript RT kit (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). De reactieoplossing werd gebruikt voor fluoresentie kwantitatieve PCR, met verwijzing naar de instructies van SYBR® Premix Ex Taq^TM II kit (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). De fluoresentie kwantitatieve PCR werd uitgevoerd in ABI PRISM® 7300 systeem (Applied Biosystems, Massachusetts, USA). U6 was de laadcontrole van miR-410, en glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase (GAPDH) was de interne parameter van Wnt-11, ALP, bot gamma-carboxyglutamaat proteïne (BGLAP), Collα1, tartraat-resistente zuur fosfatase 5 (ACP5), cathepsine K (CTSK), matrix metallopeptidase (MMP)9, Bcl-2 en Bax. De relatieve transcriptieniveaus van doelgenen werden berekend door de 2^−△△Ct methode [18].

Western Blot Analyse

Het totale eiwit werd geëxtraheerd uit de weefsels van de femurkop. De eiwitconcentratie van elk monster werd gemeten en de monsterlading werd aangepast met gedemineraliseerd water om de grootte consistent te maken. Natrium dodecyl sulfataafscheidingsgel en spacer gel (10%) werden bereid. Na ijskoken en centrifugatie werd het monster gescheiden door electroforese met hetzelfde aantal microsamplers, en vervolgens werd het eiwit op het gel overgebracht naar het nitrocellulose membraan. Het nitrocellulose membraan werd geseald met 5% magere melkpoeder bij 4 °C overnachten en gemengd met primaire antilichamen Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ALP (1:100, Sigma, St. Louis, MO, USA), BGLAP, Collα1 en MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA), en Bcl-2 en Bax (1:500, Proteintech, Chicago, USA) en geïncubeerd overnachten. En het monster werd besproeid met secundair antilichaam IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) gemarkeerd met HRP en geïncubeerd voor 1 uur. Het membraan werd gedoopt in een versterkte chemiluminescentie reactieoplossing (Pierce, Rockford, IL, USA) voor 1 minuut. Na het verwijderen van de vloeistof werd het monster bedekt door voedselbewaarfolie. Na ontwikken en fixeren werd het resultaat waargenomen. GAPDH was de interne parameter, en het eiwitimprintbeeld werd geanalyseerd door de ImageJ2x software.

Opzet van Rattenmodellen van ONFH

Negenentig mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China), gewicht tussen 300 g en 350 g, werden geselecteerd. De omgeving was ingesteld op 18–25 °C en de vochtigheid was 45–70%. Ratten werden in afzonderlijke kooien opgevoed om geluid te vermijden. Na 1 week adaptieve voeding werden opvolgproeven uitgevoerd.

Het model werd gevestigd door traumatische ONFH. De modelmethoden waren als volgt: SD ratten werden geanesthetiseerd met buikholte, gevolgd door haren verwijderen en huidvoorbereiding. De rathuid werd gesneden, de weefsels werden gescheiden, en de ronde band werd afgeknipt na blootstelling van de femurkop. Het periost van de femurhals van ratten werd afgeschraapt, en de bloedvoorziening rond de femurkop werd vernield. De gewrichtskapsel, spier en huid werden laag voor laag genaaid en opnieuw gesteriliseerd.

Diergroepering

Zeventig succesvol gemodelleerde SD ratten werden verdeeld in zeven groepen, met 10 ratten in elke groep: ONFH groep; agomir-NC groep (0,5 mL van miR-410 agonist NC (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH), agomir-miR-410 groep (0,5 mL van miR-410 agonist (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH), siRNA-NC groep (NC van 0,4 mL gesilenceerde Wnt-11 vector (bevattende 1 × 10⁹ plaque-vormende eenheid (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH), Wnt-11-siRNA groep (0,4 mL gesilenceerde Wnt-11 vector (bevattende 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH), agomir-miR-410 + overexpressed (OE)-NC groep (0,5 mL van miR-410 agonist en NC van 0,4 mL opgevoerde Wnt-11 vector (bevattende 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH), en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (0,5 mL van miR-410 agonist en 0,4 mL opgevoerde Wnt-11 vector (bevattende 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) werd geïnjecteerd rond het heupgewricht 1 week na succesvolle vestiging van ONFH). Tegelijkertijd werd de normale groep (alleen zoutoplossing werd geïnjecteerd in de buikholte, 10 ratten) ingesteld als controle. Na 4 weken ONFH werden micro-CT, osteometrie analyse, X-ray observatie, botdensitometrie en serum calcium- en fosfaatniveau bepaling uitgevoerd.

Micro-CT Test en Osteometrie Analyse

De rechter femurkop van ratten werd op de micro-CT machine (General Electric (GE) Company, Massachusetts, USA) geplaatst, en het willekeurig uitgeruste standaard phantom werd ook gescand. De scanparameters zijn als volgt: resolutie 27 μm × 27 μm × 27 μm, scanstroom 450 mA, scanspanning 80 kV, en enkele scantijd 88 min. De microstructuur van de rattenfemurkop werd in detail waargenomen. Na kalibratie volgens de specificatie, werden drie cuboïde regio's van interesse (ROI) willekeurig geselecteerd uit verschillende groepen ratten voor reconstructie (0,5 × 0,5 × 0,5 cm³). De beeldverwerking werd uitgevoerd met de machinesoftware GE Microview, en de ROI werd gereconstrueerd en geanalyseerd door botmetrie. De parameters van botmineraldichtheid (BMD) en botvolumefractie (BV/TV) werden geselecteerd.

X-ray Observatie, BMD Bepaling en Serum Calcium- en Fosfaatniveau Bepaling

Vier weken na de operatie werden de ratten in elke groep geïnjecteerd via de buik met 10% chlooraalhydraat. Na anesthesie werden de ratten in rugliggend geplaatst, en de ledematen werden fixatie en vervolgens onderzocht door X-ray fotografie. De verandering van de femurkopvorm en dichtheid werd waargenomen. De botdensiteit van de linker femurshaft, femurkop en wervelkolom werd getest door een dual-energy X-ray botdensiteetmeetinstrument. Op 4 weken na de operatie werden de ratten in elke groep 12 uur vasten voordat bloedafname plaatsvond. De bloedmonsters (5 mL) werden verzameld door het hart in de ochtend en in een vacuüm schone coagulatiebuis geplaatst. Het serum werd gescheiden door 3000 t/min centrifugatie gedurende 15 minuten. De serumcalcium- en fosfaatniveaus werden gemeten door een geautomatiseerde biochemische analyzer.

Elektronenmicroscopische Observatie

De rattenbeenweefsels werden fixatie met 3,5% glutaraldehyde, gedecalcifieerd met 5% zoutzuuroplossing en 1% oszuur, vervolgens gedeshydrateerd met gradient aceton, dubbel gekleurd met uraniumacetaat en citraatzuur, en ten slotte ingebouwd met Epon-61. Na de halfdunne coupe werd bereid, werd de ultra-dunne coupe waargenomen door een transmissie elektronenmicroscoop.

TdT-Gemedieerde dUTP-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) Assay

De paraffin-ingebedde coupes werden voorbehandeld met conventioneel dewaxen en deshydratatie. De coupes werden geïncubeerd met pepsine (0,25~0,5% zoutzuuroplossing) gedurende 25 minuten, vervolgens besproeid met 50 μL TUNEL reactie gemengde oplossing en geïncubeerd in een vochtige doos gedurende 60 minuten, en besproeid met 50 μL agent-peroxidase en geïncubeerd in een vochtige doos gedurende 30 minuten. De coupes werden ontwikkeld met DAB reagent, of de coupes gekleurd waren werden waargenomen onder de microscoop. De coupes werden met water toegevoegd om het ontwikkelen te stoppen en gekleurd met hematoxyline voor 2 minuten. Vervolgens werden de coupes gedoopt in 95% ethanol I–II, absolute ethanol I–II voor 3–5 minuten, respectievelijk, xyleen I–II voor 3–5 minuten en geseald met neutrale gom. De resultaten werden geanalyseerd onder de lichtmicroscoop.

Enzyme-Gekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA)

Na de ratten geanesthetiseerd waren, werd het bloed van de dijbeen genomen en de serummonsters verzameld door centrifugatie na 1-uurs rust. Op basis van de specificatie van ELISA kit (Shanghai enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), werden zeven standaardputten met verschillende concentratie standaarden (100 μL) op volgorde toegevoegd, de lege putten werden toegevoegd met 100 μL standaard verdunningsoplossing, en de overige putten werden toegevoegd met 100 μL te testen monster. De enzymeplaat werd bedekt met film en geplaatst voor 1 uur, en daarna werd de vloeistof weggegooid. Een oplossing (100 μL) werd aan alle putten toegevoegd, en de enzymeplaat werd bedekt met de film voor 1 uur. Na wassen werd 100 μL B oplossing aan alle putten toegevoegd, en de enzymeplaat werd bedekt met de film voor 30 minuten. Vervolgens werd tetramethylbenzidine substraatoplossing (90 μL) toegevoegd, de enzymeplaat werd bedekt met de film voor 10–20 minuten en 50 μL stopoplossing werd aan alle putten toegevoegd. De optische dichtheid (OD) waarde van elke put werd gemeten door een microplaatlezer, en de werkelijke concentratie van het monster werd gerekend.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

De bindingsplaatsen en targetrelatie van miR-410 en Wnt-11 3′ onvertaalde regio (UTR) werden voorspeld met behulp van bioinformatics software https://www.targetscan.org. De Wnt-11 3′UTR promotorregio sequentie bevattende de miR-410 bindingsplaats werd samengesteld en in pMIR-REPORT^TM Luciferase vector plasmid (Ambion, Company, Austin, TX, USA) ingevoegd voor het formuleren van het Wnt-11 3′UTR wild-type plasmid (Wnt-11-WT). En het Wnt-11 3′UTR mutante plasmid (Wnt-11-MUT) werd geconstrueerd op basis van het plasmid en de mutatie bindingsplaats. Volg de stappen van de gekochte plasmid extractiekit (Promega, Madison, Wisconsin, USA), en de logaritmische cellen werden gezaaid in de 96-putten platen. Toen de celconfluëntie ongeveer 70% was, werd Lipofectamine 2000 geadopteerd voor transfectie. Wnt-11-WT en Wnt-11-MUT werden gemengd met mimics NC en miR-410 mimics (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China), respectievelijk, en vervolgens geco-transfecteerd naar 293 T cellen. De cellen werden verzameld en gelyseerd na 48 uur transfectie, en luciferase activiteit werd getest door luciferase detectiekit (BioVision, San Francisco, CA, USA) en Glomax 20/20 luminometer (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Statistische Analyse

Alle data werden verwerkt door SPSS 21.0 software (IBM Corp. Armonk, NY, USA). De meetdata werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Eenrichtings variantieanalyse (ANOVA) werd uitgevoerd voor meervoudige groepsvergelijkingen en de t-toets voor twee-groepsvergelijkingen en Fisher's minst significante verschil t-toets (LSD-t) werd gebruikt na ANOVA. P waarde < 0,05 was indicatief voor een statistisch significant verschil.

Resultaten

Pathologische Veranderingen in ONFH Weefsels van Klinische Monsters

HE-kleuring werd gebruikt om de pathologische veranderingen van de femurkop in de femurhalsfractuur groep (controle groep) en de ONFH groep te observeren; de resultaten lieten zien dat in de controle groep de beentrabekel dichtheid goed verdeeld was en de structuur integriteit had. Terwijl in de ONFH groep waren er veel lege beenlacunes in het beenkleine hersen, met beencellen afgenomen, en beenrabekelen continu veranderden. Daarnaast waren er veel andere weefselhyperplasie rond het beenkleine hersen (Fig. 1a).

TRAP-kleuring onthulde dat TRAP voornamelijk in osteoclasten werd gevonden en vaak gebruikt werd om volwassen osteoclasten in amarant te identificeren. In vergelijking met de controle groep, steeg het aantal TRAP-positieve osteoclasten in de ONFH groep, de morfologie van osteoclasten was divers, en de cellen waren groot met multinucleaire verschijning. Duidelijke beendefecten werden waargenomen in het beenkleine hersen aangrenzend aan osteoclasten, wat botresorptie toonde (Fig. 1b).

Het resultaat van ALP-kleuring presenteerde dat ALP een markerenzyme was voor osteoblastdifferentiatie en rijping, die betrokken was bij de regulatie van botmatrix rijping calcinatie. Daarom werd ALP-expressie veel gebruikt om osteoblasten te identificeren. Bruine of koffie deeltjes konden gezien worden in het cytoplasma van volwassen osteoblasten. In relatie tot de controle groep, nam het aantal ALP-positieve osteoblasten af in de ONFH groep (Fig. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP en Collα1 Afgenomen en Wnt-11, ACP5, CTSK en MMP9 Toegenomen in ONFH Weefsels van Klinische Monsters

Western blot analyse en RT-qPCR toonden aan dat miR-410 expressie in de ONFH groep afnam ten opzichte van de controle groep, terwijl Wnt-11 expressie toename; de expressie van osteoblast-gerelateerde factoren ALP, BGLAP en Collα1 afnam; en de osteoclast-gerelateerde factoren ACP5, CTSK en MMP9 expressie nam toe (alle P < 0,05) (Fig. 2a–c).

Wnt-11 expressie werd getest door immunohistochemie en de resultaten toonden aan dat Wnt-11 proteïne voornamelijk in het cytoplasma tot expressie kwam, en de positieve expressie was in het basis bruingeel of bruin. In contrast met de controle groep, was de positieve graad van Wnt-11 proteïnexpressie in de ONFH groep verhoogd (P < 0,05) (Fig. 2d).

Opgereguleerde miR-410 en Gedownreguleerde Wnt-11 Verhogen BMD en BV/TV van Ratten

Micro-CT suggereerde dat in de normale groep de verschijning van de femurkop rond was, de dikte van de hals uniform, en de structuur van de beenrabekelen continu en gelijkmatig verdeeld. De femurkop van de ratten in de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep zakte geleidelijk in, het botresorptiegebied trad geleidelijk op, de hals van de femur werd dunner, en de beenrabekelen waren gebroken en de continuiteit vernietigd. In de agomir-miR-410 groep, Wnt-11-siRNA groep en agomir-miR-410 + OE-NC groep, bleef de verschijning van de ratten intact, er trad geen instorting op, er trad geen duidelijk botresorptiegebied op, de beenrabekelen waren normaal gerangschikt en de structuur was compleet (Fig. 3a).

De resultaten van botmetrie rapporteerden dat in contrast met de normale groep, de BMD en BV/TV in de ONFH groep waren gedaald (beide P < 0,05). In relatie tot de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, steeg de BMD en BV/TV in de agomir-miR-410 groep en de Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In vergelijking met de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde de BMD en BV/TV in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (beide P < 0,05) (Fig. 3b, c).

Overexpressie van miR-410 en Lage Expressie van Wnt-11 Verhogen BMD Niveaus van de Femurshaft, Femurkop en Wervelkolom, en Verhogen Ook de Serum Calcium- en Fosfaatniveaus van Ratten

X-ray observeerde dat de verschijning van de femurkop in de normale groep rond was, de femurkop dichtheid uniform, en de structuur compleet. In de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt11 groep, werd de verschijning van de femurkop van ratten dunner en het botresorptiegebied trad op. De verschijning was glad en de dikte van de femurkop van de ratten was compleet in de agomir-miR-410 groep, Wnt11-siRNA groep en agomir-miR-410 groep + OE-NC groep (Fig. 4a).

BMD en serum calcium- en fosfaatniveau bepaling rapporteerden dat in vergelijking met de normale groep, de BMD van de femurshaft, femurkop en wervelkolom, alsook de serumcalcium- en fosfaatniveaus, daalden in de ONFH groep (alle P < 0,05). In contrast met de agomir-NC groep en siRNA-NC groep, steeg de BMD van de femurshaft, femurkop en wervelkolom, alsook serumcalcium- en fosfaatniveaus in de agomir-miR-410 groep en Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In relatie tot de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde de BMD van de femurshaft, femurkop en wervelkolom, alsook de serumcalcium- en fosfaatniveaus in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (alle P < 0,05) (Fig. 4b, c).

Silencing van Wnt-11 en Upreguleren van miR-410 Verlichten Pathologische Veranderingen van Rat Weefsels en Remmen Apoptose van Osteocyten

De resultaten van HE-kleuring lieten zien dat de beenrabekelen netjes en helder waren en regelmatig en strak gerangschikt. Botcellen vulden de beenlacunes, en de gecalcificeerde zone was goed verbonden met de subkraakbeenrabekelen in de normale groep. In de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep, was de beenrabekel spaarzam; verdund, en zelfs gebroken; de structuur was ongerangschikt; en enkele fragmenten verschenen. Sommige osteocyten in de beenlacunes waren necrotisch en een groot aantal beenlacunes was in leegte dat geen botcellen vulden, en duidelijke proliferatie van granulatieweefsel werd waargenomen in de necrotische beenrabekel ruimte, die om de necrotische beenrabekelen omwikkeld was. In de agomir-miR-410 groep, de Wnt-11-siRNA groep en de agomir-miR-410 + OE-NC groep, bleef de verschijning van de ratten intact, er trad geen duidelijk botresorptiegebied op en de beenrabekelen waren normaal gerangschikt en de structuur was compleet (Fig. 5a).

Elektronenmicroscopische observatie observeerde dat de vorm van de botcellen in de normale groep consistent was met de lacunes, en er was een kleine opening tussen de cel en de lacune wand. De organellen waren rijkelijk, de cellen in de lacunes waren normaal, de kern was eivormig, de kernmembraan was intact, het chromatine agglomereerde niet, en de cytoplasmatische pseudopoot strekte zich uit naar de perifere botbuisje en was verbonden met de aangrenzende botcellen. Osteoblasten bevonden zich op het oppervlak van de beenrabekel, het monster was lang, en er waren veel organellen. In de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep, werd een groot aantal lipide deposities gevonden in het cytoplasma van osteoblasten, de opening tussen kapsel en lacunes werd verder verbreed, edema heldere banden verschenen tussen de kernmembraan en cytoplasma, kernmarginalisatie toonde met compressie, kernmembraan was intact, mitochondrien in cytoplasma was gezwollen, en het endoplasmatisch reticulum en Golgi apparaat verdween. In de agomir-miR-410 groep, Wnt-11-siRNA groep en agomir-miR-410 + OE-NC groep, was de morfologie van ratten osteoblasten normaal, chromatine aggregatie werd gevonden in de kern van een klein aantal cellen, geen duidelijke lipiddruppels werden gevonden in het cytoplasma, en de kernmembraan was intact (Fig. 5b).

De resultaten van TUNEL-kleuring toonden aan dat in vergelijking met de normale groep, de apoptosegraad van osteocyten in de ONFH groep was toegenomen (P < 0,05). In contrast met de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, daalde de apoptosegraad van osteocyten in de agomir-miR-410 groep en de Wnt-11-siRNA groep (beide P < 0,05). In relatie tot de agomir-miR-410 + OE-NC groep, nam de apoptosegraad van osteocyten toe in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (P < 0,05) (Fig. 5c, d).

Western blot analyse en RT-qPCR rapporteerden dat de Bcl-2 expressie afnam en Bax expressie toename in de ONFH groep in vergelijking met de normale groep (beide P < 0,05). In vergelijking met de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, steeg Bcl-2 expressie en daalde Bax expressie in de agomir-miR-410 groep en de Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In contrast met de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde de Bcl-2 expressie en nam Bax expressie toe in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (beide P < 0,05) (Fig. 5e–g).

Overexpressie van miR-410 en Lage Expressie van Wnt-11 Verhogen het Aantal Osteoblasten en Verminderen het Aantal Osteoclasten

TRAP-kleuring onthulde dat in de normale groep de morfologie van osteoclasten met positieve TRAP-kleuring anders was, de meeste waren spoel- of spindelvormig, weinig grote osteoclasten waren polygonen, en de meeste waren verdeeld rond het beenkleine hersen. In de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep, waren TRAP-positieve cellen toegenomen, de morfologie van cellen was divers in grote polygonen en polykaryoten, botresorptie werd gevonden in de beenrabekelen aangrenzend aan osteoclasten, en typische resorptielacunes werden gevormd. In de agomir-miR-410 groep, Wnt-11-siRNA groep en agomir-miR-410 + OE-NC groep, was het aantal cellen positief voor TRAP-kleuring verminderd, de cellen waren in een lang strookvormige vorm en de morfologie was regelmatiger, de polygonale polynucleaire osteoclasten waren zeldzaam, en de botstructuur van aangrenzende beenrabekelen was relatief compleet (Fig. 6a).

ALP-kleuring presenteerde dat in de normale groep, in osteoblasten die positief waren voor ALP-kleuring, de morfologie klein en rond was. De cellen waren verdeeld in aggregatie, waarvan de meeste zich in de beenrabekel ruimte van de beenmergcaviteit en op het oppervlak van sommige beenrabekelen bevonden. In de ONFH groep, agomir-NC groep, siRNA-NC groep en agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep, was het aantal osteoblasten positief voor ALP-kleuring verspreid verdeeld in de rabekel ruimte van de beenmergcaviteit. In de agomir-miR-410 groep, Wnt-11-siRNA groep en agomir-miR-410 + OE-NC groep, nam het aantal osteoblast-positieve cellen toe, en ze waren verdeeld in de rabekel ruimte van de beenmergcaviteit en het oppervlak van het deel van de beenrabekel (Fig. 6c).

In vergelijking met de normale groep, was het aantal osteoblasten per eenheidsoppervlakte onderdrukt en het aantal osteoclasten verhoogd in de ONFH groep (beide P < 0,05). In relatie tot de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, was het aantal osteoblasten per eenheidsoppervlakte verhoogd en het aantal osteoclasten gedaald in de agomir-miR-410 groep en Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In contrast met de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde het aantal osteoblasten per eenheidsoppervlakte en steeg het aantal osteoclasten in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (beide P < 0,05) (Fig. 6b, d).

Hoog Geëxprimeerde miR-410 en Laag Geëxprimeerde Wnt-11 Verhogen de Expressie van Osteocalcine (OCN), ALP, BGLAP en Collα1, evenals Verminderen C- en N-terminale Telopeptiden van Type I Collageen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK en MMP9 Expressie in ONFH Ratten

De resultaten van ELISA onthulden dat in relatie tot de normale groep, het niveau van osteogene functie-index ALP en OCN afnam terwijl de niveaus van osteoclast functie-index NTX-1 en CTX-1 toenamen in de ONFH groep (alle P < 0,05). In contrast met de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, steeg ALP en OCN en daalde NTX-1 en CTX-1 in de agomir-miR-410 groep en de Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In vergelijking met de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde ALP en OCN en steeg NTX-1 en CTX-1 in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (alle P < 0,05) (Fig. 7a).

De resultaten van western blot analyse en RT-qPCR onthulden dat in relatie tot de normale groep, de expressie van osteoblast-gerelateerde factoren ALP, BGLAP en Collα1 afnam, en osteoclast-gerelateerde factoren ACP5, CTSK en MMP9 expressie toename (alle P < 0,05). In contrast met de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, steeg de expressie van ALP, BGLAP en Collα1 en nam ACP5, CTSK en MMP9 expressie af in de agomir-miR-410 groep en de Wnt-11-siRNA groep (alle P < 0,05). In vergelijking met de agomir-miR-410 + OE-NC groep, daalde de expressie van ALP, BGLAP en Collα1 en nam ACP5, CTSK en MMP9 expressie toe in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (alle P < 0,05) (Fig. 7b–d).

Verhoogde Wnt-11 en Afgenomen miR-410 Worden Gevonden in ONFH Weefsels van Ratten evenals Wnt-11 is het Target Gen van miR-410

De targetrelatie tussen miR-410 en Wnt-11 gen werd geanalyseerd door een online analyse software. Het werd getoond dat een specifieke bindingsregio bestond tussen Wnt-11 gensequentie en miR-410 sequentie, wat impliceert dat Wnt-11 het target gen van miR-410 was (Fig. 8a). Luciferase activiteit assay werd gebruikt om deze relatie te verifiëren (Fig. 8b). De resultaten presenteerden dat in vergelijking met de NC groep, de luciferase activiteit daalde in de miR-410 mimics groep (P < 0,05), maar er was geen significant verschil in de luciferase activiteit van MUT 3′UTR (P > 0,05), wat aangeeft dat miR-410 specifiek kan binden aan Wnt-11.

De resultaten van western blot analyse en RT-qPCR onthulden dat in relatie tot de normale groep, miR-410 expressie daalde en Wnt-11 expressie toename in de ONFH groep (beide P < 0,05). In vergelijking met de agomir-NC groep, steeg miR-410 en daalde Wnt-11 in de agomir-miR-410 groep (beide P < 0,05). In contrast met de siRNA-NC groep, daalde Wnt-11 in de Wnt-11-siRNA groep (P < 0,05). Wnt-11 nam toe in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep ten opzichte van die in de agomir-miR-410 + OE-NC groep (P < 0,05) (Fig. 8c–e).

Wnt-11 expressie werd geverifieerd door immunohistochemie. Wnt-11 proteïne werd voornamelijk in het cytoplasma geëxprimeerd, en de positieve expressie was voornamelijk bruingeel of bruin. In vergelijking met de normale groep, was de positieve graad van Wnt-11 proteïnexpressie in de ONFH groep verhoogd (P < 0,05). In vergelijking met de agomir-NC groep en de siRNA-NC groep, daalde de positieve graad van de Wnt-11 proteïnexpressie in de agomir-miR-410 groep en Wnt-11-siRNA groep (beide P < 0,05). In relatie tot de agomir-miR-410 + OE-NC groep, nam de positieve graad van Wnt-11 proteïnexpressie toe in de agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 groep (P < 0,05) (Fig. 8f, g).

Discussie

ONFH, een soort botverwoestingsziekte, wordt veroorzaakt door bloedvoorzieningsfalen en stollings- en fibrinolyse systeemstoornis en leidt uiteindelijk tot instorting van de femurkop [19]. Een eerdere studie heeft miRNA expressie in botmerg mesenchymale stamcellen geïnduceerd door hormonen in muizen met ONFH besproken [20]. Ook een recente studie heeft bewijs geleverd dat het expressieprofiel van miRNA van botmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen in osteogenese gerelateerd aan steroïde-geïnduceerde ONFH [21]. Verder werd onthuld dat Li-nHA/GM/rhEPO stenten zowel Wnt als HIF-1/VEGF pathways kunnen verhogen en osteogenese en angiogenese promoten, wat gunstig is voor de reparatie van ONFH geïnduceerd door glucocorticoïden [22]. Gebaseerd op deze feiten, stelde de studie zich ten doel om de effecten van miR-410 in de preventie van ONFH te verkennen door targeting van Wnt-11.

Onze studie heeft substantiële bewijzen geleverd in relatie tot het idee dat miR-410, ALP, BGLAP en Collα1 afnamen en Wnt-11, ACP5, CTSK en MMP9 toenamen in ONFH weefsels. Een recente studie heeft voorgesteld dat de expressie van miR-410 in osteosarcocoma is gedaald, en het anti-tumor effect wordt getoond [23]. Een andere studie heeft gepresenteerd dat miR-410 expressie was verminderd in humane oestrogeenreceptor-positieve weefsels van borstkanker [24]. Het wordt gerapporteerd dat gesecreteerde factor Wnt-11 expressie is toegenomen in verschillende typen kanker, waaronder darmkanker, waar het de migratie en invasie van kankercellen bevordert [25]. Op dezelfde manier heeft een eerdere studie bewezen dat Wnt-11 expressie is verhoogd in hormoon-onafhankelijke prostaatkanker [26]. ALP is een nuttige index voor de toestandsdiagnose en klinische prognose van de ziekte [27]. OCN (bot gamma-carboxyglutamaat proteïne; BGLAP) is een breed geconserveerd molecuul gerelateerd aan mineralisatie van botmatrix [28]. ACP5 is noodzakelijk voor osteoclaatdifferentiatie en botresorptie, en het bevordert celbeweging door adhesie kinase fosforylatie te reguleren [29]. CTSK is een kritische protease verantwoordelijk voor osteopontine, afbraak van type I collageen en andere botmatrixproteïnen [30]. MMPs kunnen de meeste componenten van de extracellulaire matrix en basale membraan afbreken en wijzigen en een enorme invloed uitoefenen op kankerinvasie en metastasering [31]. Ook onthulde onze studie dat Wnt-11 het target gen is van miR-410. Op dezelfde manier vonden Zhang et al. dat miR-410 de afgeleide bindingsplaats in de Wnt3a 3′-UTR targetteerde om de Wnt-signaleringsweg te moduleren [32].

Daarnaast werd onthuld dat opgereguleerde miR-410 en gedownreguleerde Wnt-11 BMD en BV/TV van ONFH ratten verhoogden. Er is eerder voorgesteld dat een afname van wervelkolom BMD en een toename van urinaire DPD/Cr verhouding in niet-traumatische ONFH patiënten [33]. Een andere studie heeft geverifieerd dat BMD van de femurkop en lendenwervels in de ONFH groep waren gedaald ten opzichte van de controle groep [34]. Bovendien onthulde beeldanalyse dat muscone BMD en BV/TV verhouding van de necrotische femurkop kan herstellen, terwijl histologische examine verder het beschermende effect van muscone op alcohol-geïnduceerde ONFH bevestigde [35]. Een resultaat uit onze data dat hoog geëxprimeerde miR-410 en laag geëxprimeerde Wnt-11 apoptose van osteocyten remden. Een studie heeft aangetoond dat silencing van miR-410 celproliferatie kan induceren en de apoptose van humane navelstreng endotheele cellen geïnduceerd door geoxideerde laag-dichtheid lipoproteïne kan verminderen [36]. Het wordt gerapporteerd dat de gedaalde miR-410 expressie en verhoogde SOCS3 expressie de expressie van anti-apoptose factor Bcl-2 konden verminderen en de apoptose van cellen bevorderden [37]. Daarnaast kan in androgeen deficiënte LNCaP cellen de downregulatie van Wnt-11 neuroendocriene-achtige differentiatie voorkomen en leiden tot apoptose van prostaatkankercellen [26]. De studie toonde ook dat de downregulatie van Wnt-11 en upregulatie van miR-410 ALP, BGLAP en Collα1 expressie verhoogden en ACP5, CTSK en MMP9 expressie verminderden. Een studie heeft aangegeven dat Wnt-11 expressie verhoogd in cervixkankercellen kan leiden tot activatie en fosforylatie van JNK-1 door de Wnt/Jnk pathway te activeren en de proliferatie en migratie/invasie van tumorkellen te stimuleren [15]. Het is voorgesteld dat Wnt-11 gen silencing in darmkankercellijnen de invasieve capaciteit van cellen verminderde [25]. Verder kan de overexpressie van miR-410 de invasie, migratie, proliferatie en epitheliale mesenchymale transformatie van osteosarcocoma cellen remmen via direct targeting van TRIM44 [23]. Verder stelde een eerdere studie dat opgereguleerde miR-410 de groei van cholangiocarcinoom in een xenograft muismodel remde door apoptose te induceren [38].

Conclusie

Samengevat, onthulde ons onderzoek dat miR-410 laag geëxprimeerd was en Wnt-11 hoog geëxprimeerd in ONFH, en upreguleren van miR-410 of downreguleren van Wnt-11 verhoogde osteoblasten en verminderde osteoclasten om ONFH te verlichten. Echter, klinische studies kunnen verder uitgevoerd worden om de effectiviteit van miR-410 en Wnt-11 voor de behandeling van ONFH te detecteren.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing

Wijzigingsgeschiedenis

Afkortingen

ALP:

Alkalische fosfatase

ANOVA:

Variantieanalyse

BMD:

Botmineraldichtheid

EDTA:

Ethyleendiamine tetraazijnzuur

ELISA:

Enzyme-gekoppelde immunosorbent assay

GAPDH:

Glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxyline-eosine

LSD-t:

Minst significante verschil t-toets

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Negatieve controle

OD:

Optische dichtheid

ONFH:

Osteonecrose van de femurkop

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

ROI:

Regio's van interesse

RT-qPCR:

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Natrium dodecyl sulfataat

THR:

Totale heupprothese

TRAP:

Tartraat resistente zuur fosfatase

TUNEL:

TdT-gemedieerde dUTP-biotine nick end-labeling