Nieuwe dubbele mitochondriale en CD44-receptor richtende nanodeeltjes voor door Redox Stimuli geactiveerde afgifte

Abstract

In dit werk werden nieuwe mitochondriale en CD44-receptor dual-targeting redox-gevoelige multifunctionele nanodeeltjes (micellen) op basis van oligomeer hyaluronzuur (oHA) voorgesteld. De amfifiele nanodrager werd bereid door (5-carboxypentyl)trifenylfosfoniumbromide (TPP), oligomeer hyaluronzuur (oHA), disulfidebinding en curcumine (Cur), genaamd TPP-oHA-S-S-Cur. De TPP was gericht op de mitochondriën, het antitumormedicijn Cur diende als een hydrofobe kern, de CD44-receptor die gericht was op oHA werkte als een hydrofiele schil en de disulfidebinding fungeerde als een verbindende arm. De chemische structuur van TPP-oHA-S-S-Cur werd gekenmerkt door ¹ HNMR-technologie. Cur werd door zelfassemblage in de TPP-oHA-S-S-Cur-micellen geladen. Sommige eigenschappen, waaronder de bereiding van micellen, morfologie, redoxgevoeligheid en mitochondriale targeting, werden bestudeerd. De resultaten toonden aan dat TPP-oHA-S-S-Cur-micellen een gemiddelde diameter hadden van 122,4 ± -23,4 nm, zeta-potentiaal − 26,55 ± 4,99 mV. In vitro afgifte-onderzoek en cellulaire opnametest toonden aan dat TPP-oHA-S-S-Cur-micellen redox-gevoeligheid hadden, dubbele targeting op mitochondriale en CD44-receptor. Dit werk leverde een veelbelovend slim multifunctioneel nanodragerplatform op om de oplosbaarheid te verbeteren, de bijwerkingen te verminderen en de therapeutische werkzaamheid van geneesmiddelen tegen kanker te verbeteren.

Achtergrond

In de afgelopen jaren zijn, om de effectieve behandeling van kanker te bereiken, veel medicijnafgiftesystemen [1] bestudeerd om multifunctionele macromolecuul-polymeermedicijndragers te maken met structurele modificaties die veel voordelen zouden kunnen opleveren, zoals het verbeteren van de biologische beschikbaarheid van medicijnen door hun afbraaksnelheid te verminderen , het verbeteren van de cellulaire opname, het mogelijk maken van doelgerichtheid en controle van de afgifte van geneesmiddelen en het verminderen van bijwerkingen [2, 3].

Curcumine (Cur), een difenolische verbinding, werd geïsoleerd uit een traditioneel Chinees medicijn Curcuma longa . In vergelijking met algemene antitumormiddelen had Cur brede antitumoreffecten op veel tumoren zoals prostaat-, borst- en darmkanker, en die relatief lagere cytotoxiciteit [4]. Maar de ontoereikende oplosbaarheid, instabiliteit en slechte biologische beschikbaarheid beperken de klinische toepassing ervan extreem [5, 6]. Om de oplosbaarheid en biologische beschikbaarheid van hydrofobe geneesmiddelen te verbeteren, zijn veel goed ontworpen nanomaterialen gefabriceerd door hydrofobe geneesmiddelen en hydrofiel materiaal oligomeer hyaluronzuur (oHA) [7] op te nemen. We ontwierpen een soort amfipathische polymeer-geneesmiddelconjugaten als nanodrager door curcumine via zelfassemblage in polymeermicellen te laden, die een goede stabiliteit hadden en de halfwaardetijd van het medicijn in de bloedcirculatie kunnen verlengen. Micellen met kleine deeltjesgrootte kunnen zich passief ophopen tot solide tumor door EPR-effect van tumorangiogenese effectief om een beter behandeleffect te bereiken [8, 9].

oHA, een klein molecuul afgeleid van de afbraak van HA, bezit unieke eigenschappen, zoals goede hydrofiliciteit, biocompatibiliteit, stabiliteit in plasma en targeting op CD44-receptor in het celoppervlak [7, 10, 11], terwijl CD44-receptoren tot overexpressie worden gebracht in longkankercellen en borstkankercellen, vergeleken met lagere expressie in de normale cellen [12]. De tumorcellen hebben de unieke cellulaire signalen, waaronder glutathion (GSH, 2-10 mM), lage pH en sommige enzymen, in tegenstelling tot de normale menselijke cellen [13,14,15,16,17,18,19,20 ], terwijl disulfidebindingen reductiegevoeligheid hebben en zouden kunnen breken onder invloed van verminderd GSH in het cytoplasma [21, 22].

Mitochondriën zijn de vitale organellen voor celoverleving en spelen een belangrijke rol bij energieproductie en apoptotische routes [23,24,25,26,27]. Daarom werden mitochondriën lang beschouwd als de subcellulaire doelen die in de vorige rapporten werden toegepast voor de behandeling van kanker [28]. Vanwege het hogere membraanpotentieel van mitochondriën tussen cellulaire organellen, kunnen trifenylfosfine, trifenylmethylfosfonium en andere soorten lipofiele kationen gemakkelijk worden verrijkt in de mitochondriën via hun lipide dubbellaagse hydrofiele barrière [29, 30].

In dit werk werden, om de oplosbaarheid van Cur en de specificiteit voor kankercellen te verbeteren, polymeer-geneesmiddelconjugaten, samengesteld uit oHA, TPP, disulfidebindingen en Cur, ontworpen en gesynthetiseerd, die specifiek gericht waren op de CD44-receptor en mitochondriën. . Het had ook een reductiegevoeligheid en kan worden gebruikt als een fluorescentiemarker. Deze multifunctionele nieuwe nanodrager is vernoemd naar (5-carboxypentyl)trifenylfosfoniumbromide, oligomeer hyaluronzuur, disulfidebinding en curcumine (TPP-oHA-S-S-Cur). Cur werd via zelfassemblage in water in TPP-oHA-S-S-Cur-micellen geladen [1, 31]. De polymere TPP-oHA-S-S-Cur-micellen ingekapseld Cur (hierna aangeduid als Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen) zouden de therapeutische werkzaamheid en de medicijnbelading van curcumine kunnen verbeteren en de bijwerkingen kunnen verminderen. Na het richten op de tumorweefsels drongen de Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen de cellen binnen via CD44-gemedieerde endocytose, gevolgd door het richten op de mitochondriën en de disulfidebindingen braken als reactie op hoge GSH (2-10 mM) wat leidde tot de snelle afgifte van het medicijn (Fig. 1). Hierin kunnen we een hypothese voorstellen dat deze nieuwe mitochondriale en CD44-receptor dual-targeting redox-gevoelige multifunctionele nanodeeltjes een nieuw platform zullen zijn voor tumor-targeting drug delivery system. Na het voorbereiden van micellen werden in deze studie enkele voorlopige onderzoeken uitgevoerd naar de kenmerken van de Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen.

Schematische illustratie van mitochondriale en CD44-receptor dual-targeting redox-gevoelige nanodeeltjes

Methoden

Materialen

Curcumine (Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); oligomeer hyaluronzuur (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); 3,3′-dithiodipropionzuur werd geleverd door Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). (5-carboxypentyl)trifenylfosfoniumbromide (TPP), watervrij tetrahydrofuran (THF), dimethylsulfoxide (DMSO), triethylamine (TEA), 1-ethyl-(3-twee-methylaminopropyl) gecarboniseerd carbodiimidehydrochloride (EDC) en 4-dimethylaminopyridine (DMAP) werden verkregen van Aladdin Chemistry Co. Ltd. Alle andere reagentia waren van analytische kwaliteit en geleverd door Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.

Synthese en karakterisering van TPP-oHA-S-S-Cur

De multifunctionele nanodragers werden in drie stappen gesynthetiseerd, zoals weergegeven in figuur 2.

Synthetische route van TPP-oHA, S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur

Stap 1

TPP werd gecombineerd met oHA via esterbinding met behulp van een eerder gerapporteerde methode [32]. Eerst werden TPP, EDC en DMAP opgelost in DMSO om gedurende 1 uur bij 60 ° C te reageren. Vervolgens werd oHA opgelost in DMSO:H₂ O (v /v =-1:1) en voegde de bovenstaande reactie er gedurende 8 uur bij kamertemperatuur aan toe. Het reactiemengsel werd 48 uur gedialyseerd met een dialysezak (MWCO 2000 Da) in gedeïoniseerd water om de onzuiverheden te verwijderen en gevriesdroogd om TPP-oHA-polymeren te verkrijgen.

Stap 2

In het kort werd 3,3'-dithiodipropionzuur opgelost in THF en geactiveerd door oxalylchloride. Vervolgens liet men het mengsel reageren met Cur gekatalyseerd door TEA. Het verkregen product werd geïsoleerd door middel van silicagelkolomchromatografie om het zuivere product S-S-Cur te verkrijgen.

Stap 3

S-S-Cur, EDC en DMAP werden opgelost in DMSO en gedurende 2 uur geactiveerd bij 60 ° C, en vervolgens werd TPP-oHA toegevoegd aan de bovenstaande oplossing en gedurende 24 uur bij kamertemperatuur gereageerd. Het mengsel werd 48 uur gedialyseerd in gedestilleerd water met dialyseslangen (MWCO 2000 Da), gevolgd door vriesdrogen om het eindproduct TPP-oHA-S-S-Cur te verkrijgen.

De structuren van TPP-oHA, S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur werden bevestigd met ¹ HNMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, VS) met gedeutereerde DMSO-d₆ , CD₃ Cl en DMSO-D₆ :D₂ O (DMSO-d₆ :D₂ O = 1:1, v /v ) respectievelijk als oplosmiddel.

Voorbereiding en karakterisering van micellen

De TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en oHA-Cur-micellen werden beide bereid door middel van dialysemethoden [33]. Eerst werden TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) en curcumine (1,5 mg) opgelost in formamide (6 ml). Vervolgens werd het mengsel 24 uur in het donker gedialyseerd in gedeïoniseerd water met een dialysezak (MWCO 2000 Da) om de organische oplosmiddelen te verwijderen. Daarna werd de gedialyseerde oplossing gedurende 10 minuten bij 2500 rpm gecentrifugeerd om onbeladen Cur te verwijderen. Ten slotte werd de micelsuspensie gefiltreerd door spuitfiltermembranen van 0,45 m. De enkelvoudige functionele oHA-Cur-micellen werden met dezelfde methode verkregen.

De deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en polydispersiteitsindex (P.I.) van met Cur geladen micellen werden waargenomen door Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.). De morfologie van met Cur beladen micellen werd gevolgd door een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan). De stabiliteit van Cur-geladen micellen werd uitgevoerd in PBS met 20% FBS door de Delsa Nano C.

De invangefficiëntie (EE) en geneesmiddelbelading (DL) werden gemeten door middel van membraanfiltratie. Na filtratie door een membraan van 0,45 m werd de verkregen oplossing gemeten door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC, Agilent Technologies) bij 425 nm om EE en DL te verkrijgen. De vergelijkingen om EE en DL van de micellen te berekenen waren als volgt:

$$ \mathrm{EE}\left(\%\right)=\mathrm{Amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{micelles}/\mathrm{total }\ \mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{feeding}\ \mathrm{drug}\times 100 $$ $$ \mathrm{DL}\left(\%\right)=\mathrm{Bedrag }\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{micellen}/\mathrm{bedrag}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{loaded}\ \mathrm{micellen}\times 100 $$

In vitro geneesmiddelafgifte in aanwezigheid van GSH

De intracellulaire GSH-redox-responsiviteit van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen werd geëvalueerd met behulp van de dialysemethode. Vier milliliter Cur/TPP-oHA-SS-Cur micelsuspensies (50 μg curcumine/ml) werden in een dialysezak (MWCO 7000 Da) gedaan en gedialyseerd tegen 45 ml PBS (pH 7,4, met 45% foetaal runderserum) en 0,5% Tween 80) met verschillende GSH-niveaus (0, 10, 2 en 10 mM). De monsters in centrifugebuizen werden bij 37 ° C bewaard in een schudincubator (BS-2F, Changzhou, China) met 100 tpm. Met vooraf gedefinieerde tijdsintervallen (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 en 120 uur) werd 2 ml afgiftemedium uit de centrifugebuisjes gehaald en aangevuld met een gelijk volume van overeenkomstige verse media en de concentraties van Cur werden geanalyseerd met HPLC. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.

Celcultuur

MDA-MB-231 humane borstcarcinoomcellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, Hyclone) dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat. CD44-receptoren waren hoog tot expressie gebracht in MDA-MB-231-cellen, dus werden MDA-MB-231-cellijnen geselecteerd en gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO₂ sfeer aangevuld.

In vitro cytotoxiciteitstesten

De in vitro cytotoxiciteitstest van TPP-oHA-S-S-Cur werd geëvalueerd met de MTT-methode [32]. MDA-MB-231-cellen (hoog tot expressie gebrachte CD44-receptor) werden gekweekt met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/putje in platen met 96 putjes. Honderd microliter vrije Cur, Cur/oHA-Cur-micellen en Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen inclusief verschillende concentraties Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 μg/ml) werd toegevoegd aan verschillende putjes, terwijl PBS als controle werd toegevoegd. Na 24 uur te zijn geïncubeerd, werd 100 μL MTT-oplossing (5 mg / ml) aan elk putje toegevoegd en vervolgens 4 uur geïncubeerd. Vervolgens werd MTT vervangen door 100 μL DMSO en in een schudincubator geplaatst om het formazan-kristal op te lossen. Na 20 minuten incuberen werd de absorptie gemeten met een microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) bij 570 nm.

In vitro cellulaire opname en de mitochondriale lokalisatie

Kwalitatieve analyses van cellulaire opname van Cur / TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en Cur / oHA-Cur-micellen werden waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Japan). MDA-MB-231-cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 5000 cellen per putje en geïncubeerd met DMEM (1 ml) met 10% FBS en vervolgens 24 uur gekweekt bij 37 ° C in 5% CO₂ . Daarna werd aan elk putje vers kweekmedium (1 ml) met met geneesmiddel beladen micellen (Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en Cur/oHA-Cur-micellen) toegevoegd. Cellen werden gekweekt met vrij Cur fungeerde als controle; de uiteindelijke Cur-concentratie was 20 g/ml. Verder werden de cellen gedurende verschillende tijdsintervallen met geneesmiddel geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen drie keer gewassen met PBS en gedurende 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde.

Om het CD44-targetingvermogen van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen te evalueren, werd bovendien HA (2 mg/ml) aan het medium toegevoegd als een controlegroep om aan de CD44-receptoren te binden.

Om de celmitochondriën te labelen voor het lokaliseren van Cur / TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en Cur / oHA-Cur-micellen in cellen, werden de cellen bovendien gedurende 15 minuten verder geïncubeerd met een mitochondriale tracker (Mito-tracker Red CMXROS). Ten slotte werden de cellen drie keer gewassen en geobserveerd met fluorescentiemicroscopie.

Flowcytometrie

De kwantitatieve analyses werden gemeten met behulp van flowcytometrie. MDA-MB-231-cellen werden uitgezaaid in platen met zes putjes met een dichtheid van 10⁵ cellen / putje in 2 ml media met 10% FBS en behandeld zoals de bovenstaande beschrijving. Na incubatie met Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en Cur/oHA-Cur-micellen (20 μg Cur/ml) gedurende verschillende tijdsintervallen, werden de cellen driemaal gewassen met PBS en getrypsiniseerd met 0,25% trypsine. Vervolgens werden de cellen gedurende 5 minuten bij 1500 tpm gecentrifugeerd. Na resuspensie in PBS (0,5 ml) werden de cellen geanalyseerd met flowcytometrie (EPICS XL, Beckman, VS).

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (n = 3). Bovendien werd SPSS-software (ver. 20, VS) gebruikt; de gegevens werden geanalyseerd op significante verschillen met waarschijnlijkheidsniveaus van *p < 0,05 (significant) met behulp van eenrichtingsanalyse van variatie (ANOVA).

Resultaten en discussie

Karakterisering van dragermaterialen TPP-oHA-S-S-Cur

De routes van de synthese van TPP-oHA, S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur zijn weergegeven in figuur 2.

Bovendien is de ¹ HNMR-spectra van oHA, TPP-oHA, S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur werden gezien in Fig. 3. TPP-oHA werd gesynthetiseerd door TPP en oHA. Karakteristieke pieken van drie benzeenringen in TPP werden waargenomen bij 7.570-7.717 ppm in de ¹ HNMR-spectrum van TPP-oHA, wat bevestigde dat TPP-oHA met succes werd gesynthetiseerd. Bovendien werd S-S-Cur gesynthetiseerd door 3,3′-dithio-dipropionzuur en Cur. Bovendien werd TPP-oHA-S-S-Cur gesynthetiseerd door TPP-oHA en S-S-Cur. De TPP in TPP-oHA-S-S-Cur werd waargenomen in de regio tussen 7.570 en 7.717 ppm. De karakteristieke pieken van Cur werden waargenomen in de ¹ HNMR-spectrum van S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur bij 6,795–7,467 ppm, en de protonpiek (-CH₂ -S-S-CH₂ -) van 3,3-dithiodipropionzuur werd waargenomen bij 2,502 ppm in overeenstemming met TPP-oHA-S-S-Cur. Deze resultaten bevestigden de succesvolle synthese van TPP-oHA-S-S-Cur.

¹ HNMR-spectra van oHA, TPP-oHA, S-S-Cur en TPP-oHA-S-S-Cur

Voorbereiding en evaluatie van TPP-oHA-S-S-Cur Micellen

De deeltjesgrootte, polydispersiteitsindex, zeta-potentialen, DL en EE van de met geneesmiddel beladen micellen zijn te zien in tabel 1. De gemiddelde grootte van Cur / oHA-Cur-micellen en Cur / TPP-oHA-SS-Cur-micellen waren 145,5 ± 2,1 en 122,4 ± 4,6 nm, respectievelijk. Dit kan zijn omdat TPP de fysiochemische eigenschappen van het oppervlak van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen heeft veranderd, wat heeft geleid tot de verschillen van twee micellen. En de DL en EE van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen waren hoger dan de gewone micellen die bereid waren met TPP-oHA. Bovendien hadden de Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen een sterker negatief zeta-potentiaal (− 21,56 ± 1,46 mV) dan die van Cur/oHA-Cur-micellen (− 19,17 ± 0,55 mV), wat wijst op een verhoogde stabiliteit van TPP-oHA -SS-Cur door aggregatie van micel voornamelijk veroorzaakt door de aanwezigheid van TPP.

Bovendien werden het uiterlijk, de deeltjesgrootteverdeling, de zeta-potentiaal en de TEM-beeldkarakterisering van TPP-oHA-SS-Cur-micellen getoond in Fig. 4. De resultaten onthulden dat Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen ongeveer bolvormig waren ( Fig. 4d), homogeen verdeeld (Fig. 4b), en had een gemiddelde diameter van ongeveer 122,4 ± 4,6 nm. Bovendien was de polydispersiteitsindex van de Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen 0,132 kleiner dan 0,2, wat wijst op de uniforme grootte van de micellen, die consistent was met TEM (Fig. 4c).

Uiterlijk (a ), deeltjesgrootteverdeling (b ), zeta-potentiaal (c ), en TEM-afbeelding (d ) karakterisering van TPP-oHA-S-S-Cur micellen

Zoals weergegeven in tabel 1 was de deeltjesgrootte van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen kleiner in PBS dan in PBS met FBS. Van 2 tot 24 uur was de grootte veranderd van 133,45 ± 6.8 naar 160.27 ± 7.1 nm in PBS met FBS. Dit fenomeen gaf aan dat Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen een betere stabiliteit in vivo zouden kunnen behouden.

Onderzoek naar de afgifte van geneesmiddelen bij in vitro micellen

De redoxgevoeligheid van TPP-oHA-S-S-Cur werd bestudeerd door micellen in verschillende GSH-concentraties. Cur-afgifte uit Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen in de aanwezigheid of afwezigheid van GSH werd uitgevoerd om de tumoromgevingen te simuleren. Zoals getoond in Fig. 5, werd in het medium zonder GSH slechts 32,5% Cur vrijgemaakt uit de TPP-oHA-SS-Cur binnen 120 uur, en toevoeging van 10 μM GSH aan het medium resulteerde slechts in een lichte toename (37%) . Daarentegen was de geneesmiddelafgifte van groepen met 2 mM GSH en 10 mM GSH respectievelijk 57,5 en 75,3%. Dit werd geverifieerd dat de geneesmiddelafgifte werd verhoogd met de GSH-concentratie. Dit resultaat werd toegeschreven aan het verstoren van de disulfidebinding van TPP-oHA-S-S-Cur, wat aangaf dat de Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen reductiegevoeligheid hadden.

In vitro afgifte van Cur-geladen TPP-oHA-S-S-Cur-micellen bij verschillende GSH-concentraties (n = 3)

Cytotoxiciteitsonderzoeken

De cytotoxiciteit van verschillende curcumine-formuleringen in MDA-MB-231-cellen werd bestudeerd met MTT-assay. Zoals weergegeven in figuur 6, hadden verschillende concentraties curcumine-formuleringen een verschillende levensvatbaarheid van de cellen na 24 uur. De met Cur beladen micellen waren minder toxisch dan het vrije Cur, wat zou kunnen worden verklaard dat het polymere materiaal de celcytotoxiciteit sterk verminderde. Ondertussen toonde Fig. 6b een concentratie-afhankelijk levensvatbaarheidsprofiel van de cellen, terwijl Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen de laagste cellevensvatbaarheid hadden dan Cur/oHA-Cur-micellen en andere formuleringen, wat zou kunnen worden verklaard dat Cur/TPP- oHA-SS-Cur-micellen konden gemakkelijk de cellen binnendringen en het medicijn vrijgeven onder GSH-effect. De IC₅₀ waarden van vrije Cur-, Cur/oHA-Cur-micellen en Cur-TPP-oHA-SS-Cur-micellen in MDA-MB-231-cellen waren respectievelijk 6.534, 5.092 en 3.871 μg/ml, die een betere cellulaire cytotoxiciteit van Cur vertoonden -TPP-oHA-SS-Cur-micellen in MDA-MB-231-cellen.

een Cytotoxiciteit van curcumine-formuleringen na incubatie gedurende 24 uur. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD (n = 6). *p < 0,05, vergeleken met de vrije Cur. b Cytotoxiciteit van met Cur beladen micellen met verschillende concentraties Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 g/ml). De IC₅₀ waarden van vrije Cur-, Cur/oHA-Cur-micellen en Cur-TPP-oHA-SS-Cur-micellen waren respectievelijk 6.534, 5.092 en 3.871 μg/ml

Bovendien hadden de blanco micellen een bepaalde toxiciteit (Fig. 6) omdat de Cur door een chemische methode aan het polymeer was gekoppeld. Dit zou de medicijnlaadcapaciteit van micellen vergroten en vervolgens het antitumoreffect versterken.

Fluorescentiemicroscopiebeelden van de cellulaire opname

De cellulaire opname van vrije Cur, Cur/oHA-Cur-micellen en Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen werd bestudeerd met een fluorescentiemicroscoop. In dit werk was Cur zelf niet alleen een geneesmiddel tegen kanker, maar ook een groene fluorescentieprobe. Zoals te zien is in Fig. 7 vertoonden zowel Cur/oHA-Cur-micellen als Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen een goede cellulaire opname in cellijnen en was de fluorescentie-intensiteit recht evenredig met de tijd, terwijl de fluorescentie-intensiteit sterker was bij 4 uur Ondertussen was de fluorescentie-intensiteit van de groep behandeld met Cur/oHA-Cur-micellen sterker dan de vrije Cur-groep op dezelfde tijdstippen. Dit kan zijn omdat oHA-Cur met het vermogen om zich op de CD44-receptor te richten, het binnendringen van medicijnen in cellen bevorderde. Bovendien, misschien dankzij het redox-gevoelige vermogen van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen, waren de fluorescentiesignalen duidelijk hoger dan die van Cur/oHA-Cur-micellen. Door de Cur-accumulatie te versterken, zou deze worden geïnduceerd door de cytotoxiciteit en apoptotische werking van kankercellen, wat consistent was met de resultaten van cytotoxiciteitsonderzoeken.

Fluorescentiemicroscopiebeelden van de cellulaire opname van vrij Cur (a ), oHA-Cur/ Cur-micellen (b ), en TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micellen (c ) op een ander tijdstip. d Cellen behandeld met TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micellen in aanwezigheid van vrij HA (2 mg/ml), wat het voltooiingseffect van HA in MDA-MB-231-cellen laat zien

Bovendien was de fluorescentie-intensiteit van de Cur/TPP-oHA-SS-Cur micelgroep met HA lager dan die zonder HA-groep, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van het feit dat de vrije HA-moleculen de CD44-receptoren in beslag namen, wat verder aantoonde dat ze gericht kunnen zijn. van de TPP-oHA-SS-Cur tegen CD44.

Verder werd de mitochondriale lokalisatie van TPP-oHA-S-S-Cur bevestigd in MDA-MB-231-cellijnen door kleuring met Mito-tracker Red CMXRos (Fig. 8). Uit de afbeeldingen bleek dat de groene fluorescentie van Cur/TPP-oHA-SS-Cur-micellen de rode fluorescentie van de mitochondriale tracker mooi overlapte, wat aangaf dat het medicijn zich kon ophopen in de mitochondriën van de kankercellen, en de TPP-oHA-SS -Cur had mitochondriale targeting.

Mitochondriale lokalisatie. Mitochondriale lokalisatie werd bepaald door kleuring met mitochondriale trackers in MCF-7-cellen met de behandeling van vrij Cur (a ), oHA-Cur (b ), en TPP-oHA-S-S-Cur (c ); schaalbalk:100 μm

Flowcytometrie

De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) werd gemeten met flowcytometrie. Zoals te zien is in Fig. 9 was de MFI van MDA-MB-231-cellen geïncubeerd met Cur / TPP-oHA-S-S-Cur-micellen en Cur / oHA-Cur-micellen recht evenredig met de toedieningstijd. In overeenstemming met confocale microscopische observatie was de MFI van cellen die werden behandeld met Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen significant hoger dan de Cur/oHA-Cur-micellengroep op dezelfde tijdstippen (p < 0.05).

Fluorescentie-intensiteit van MDA-MB-231-cellen geïncubeerd met verschillende Cur-formuleringen (20 μg Cur / ml). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). *p < 0,05, ANOVA in één richting

Conclusies

In deze studie, om de oplosbaarheid en het behandelingseffect van Cur te verbeteren, de bijwerkingen van traditionele therapie te verminderen en de tumortargeting van geneesmiddelen te vergroten, namen we redox-responsieve disulfidebond als verbindingsarm en bouwden een mitochondriale en CD44-receptor dual-targeting redox-responsieve polymeer-geneesmiddelconjugaten (TPP-oHA-SS-Cur). De TPP was gericht op de mitochondriën, het antitumorgeneesmiddel Cur diende als hydrofobe groep en de CD44-receptor die zich op oHA richtte, werkte als hydrofiele groepen. Cur, als modelgeneesmiddel, werd in het amfifiele blokcopolymeer geladen en vormde via zelfassemblage micellen.

Dit medicijnafgiftesysteem dat Cur inkapselt door een chemische methode en een fysieke methode, verbetert niet alleen de DL/EE, maar verhoogt ook de stabiliteit en de bloedcirculatietijd, en het zou een betere tumortargeting kunnen bereiken. In vitro-tests voor afgifte van geneesmiddelen toonden aan dat de disulfidebinding van TPP-oHA-SS-Cur brak door het effect van hoge GSH (2-10 mM) in de tumorcellen, gevolgd door de snelle afgifte van het geneesmiddel en toonden vervolgens de reductie ervan aan. gevoelig. De resultaten van cellulaire opname, mitochondriale lokalisatie en cytotoxiciteit toonden aan dat de Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen CD44-receptortargeting en mitochondriale targetingcapaciteit hadden. De volgende stap zullen we de antitumoractiviteit van Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-micellen in vivo evalueren.

Bovendien vertoonde dit slimme multifunctionele nanodragerplatform dat in deze studie werd ontwikkeld, potentieel om te worden gebruikt voor hydrofobe geneesmiddelen met een aanzienlijk verbeterde oplosbaarheid, stabiliteit en therapeutische werkzaamheid. Ondertussen zorgde deze methode voor een nieuw idee voor tumorbehandeling.

Afkortingen

oHA:: Oligomeer hyaluronzuur
S-S-Cur:: Dithiodipropionzuur-curcumine
TPP:: (5-carboxypentyl)trifenylfosfoniumbromide

PtNi-legering Cocatalyst-modificatie van eosine Y-gesensibiliseerde g-C3N4/GO-hybride voor efficiënte zichtbaar-licht fotokatalytische waterstofevolutie Verbeterde fotokatalytische waterstofevolutie door Cd0.5Zn0.5S QD's op Ni2P poreuze nanosheets te laden

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal