Nanodeeltje-geïnduceerde modulatie van cellulaire mechanica: Vergelijkende analyse van SiO₂ en TiO₂ effecten op Caco-2 en A549 cellen

Samenvatting

De toenemende incorporatie van nanodeeltjes (NDs) in consumentenproducten heeft uitgebreide veiligheidsevaluaties overstegen. Deze studie onderzoekt hoe de fysicochemische attributen van SiO₂ en TiO₂ NDs de cellulaire opname, intracellulaire verkeersroutes en mechanische perturbaties beïnvloeden in twee klinisch relevante in-vitro modellen—Caco-2 (darmepitheel) en A549 (alveolaire epitheel). We kwantificeerden ND-internalisatie via ICP-AES, beoordeelden cytotoxiciteit met WST-8 en LDH-assays, maaten oxidatieve stress (ROS, SOD, MDA) en evalueerden actine-cytoskelet herstructurering door confocal microscopie. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) bepaalde veranderingen in Young's modulus binnen kern- en cytoplasmatische compartimenten. TiO₂ NDs vertoonden hogere cellulaire opname, uitgesproken ROS-generatie en significante actine-reorganisatie, leidend tot verhoogde stijfheid in A549 cellen en verminderde stijfheid in Caco-2 cellen. Deze biomechanische veranderingen correleren met ND-geïnduceerde cytotoxiciteit en benadrukken het belang van het integreren van mechanische eindpunten in nanotoxicologie-protocollen.

Achtergrond

Geingeneerde nanodeeltjes (ENPs) zijn alomtegenwoordig in farmaceutica, cosmetica, voedingsadditieven en industriële formuleringen, wat zorgen oproept over menselijke en milieu-blootstellingspaden (ingestie, inhalatie, dermaal). De toxiciteit van ENPs wordt sterk gemoduleerd door hun grootte, vorm, oppervlaktechemie en kristallijne toestand, doch gestandaardiseerde assesseringsmethoden blijven beperkt, wat bijdraagt aan conflicterende literatuur. Metaal-oxide NDs, met name amorfe SiO₂ en kristallijne TiO₂, worden breed toegepast vanwege hun optische en chemische stabiliteit, doch bewijzen suggereren dat ze cellulaire functies kunnen storen, waaronder cytokin-vrijgave, darmepitheel microvilli integriteit, ROS-productie, ATP-synthese remming en genotoxiciteit. Echter, hun impact op celmechanica—een cruciale determinant van migratie, differentiatie en weefselhomeostase—heeft beperkte aandacht gekregen. Deze studie overbrugt die kloof door systematisch de biomechanische effecten van 20-nm SiO₂ en TiO₂ NDs op Caco-2 en A549 cellen te evalueren.

Methoden

Synthese van SiO₂ en TiO₂ nanodeeltjes

SiO₂ NDs werden bereid via een W/O microemulsie met TEOS, Triton X-100, cyclohexaan en NH₄OH, wat sferische deeltjes van 20 ± 2 nm opleverde. TiO₂ NDs werden gesynthetiseerd via een gemodificeerde sol-gel route vanuit TTIP onder zuure omstandigheden, gecalcinereerd bij 430 °C om een gemengde anatase-rutil fase te produceren met een gemiddelde diameter van 25 ± 5 nm. Beide ND-typen werden gekarakteriseerd door TEM, DLS, ζ-potentiaal en XRD om morfologie, hydrodynamische grootte, oppervlaktelading en kristallijne structuur te bevestigen (Fig. 1).

Celkweek en blootstelling

Caco-2 en A549 cellen werden onderhouden in DMEM aangevuld met 10–20% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Voor opnamestudies werden cellen blootgesteld aan 15 of 45 µg/mL NDs gedurende 48–96 uur. Na blootstelling werden cellen gewassen, getrypsiniseerd, geteld en gelyst in HCl/HNO₃ voor ICP-AES analyse van Si- en Ti-inhoud.

Cytotoxiciteit, membraanintegriteit en oxidatieve stress

Levensvatbaarheid werd beoordeeld met de WST-8 assay; LDH-vrijgave kwantificeerde membraanschade. ROS-productie werd gemeten door DCF-DA fluorescentie, en antioxidante respons werd geëvalueerd via SOD-activiteit en MDA-niveaus (lipideperoxidatie). Alle assays werden in driploop uitgevoerd met passende controles.

Actine-cytoskelet en morfometrie

Cellen werden gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd met Phalloidine-ATTO 488 en DAPI. Confocal laser scanning microscopie (CLSM) ving corticinale actinedistributie. ImageJ kwantificeerde geïntegreerde dichtheid en coherentie (OrientationJ plugin) om actine-hoeveelheid en -uitlijning te beoordelen. Kern-tot-cytoplasmatische (K/C) oppervlakteverhoudingen werden berekend om morfologische veranderingen te detecteren.

Atoomkrachtmicroscopie

AFM in kracht-volume modus meet Young's modulus in kern- en cytoplasmatische regio's van cellen behandeld met 45 µg/mL NDs gedurende 72 uur. Kracht-afstand kurven werden gefit naar een gemodificeerd Sneddon-model om elastische moduli (E) te extraheren. Data van 20 cellen per conditie werden statistisch geanalyseerd.

Statistische analyse

Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Student's t-toets vergelijk behandelde versus controle groepen, met significantiedrempels bij p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) en p < 0,005 (***).

Resultaten

Nanodeeltjeskarakterisering

TEM-beelden bevestigen monodisperse, sferische SiO₂ NDs (~20 nm) en TiO₂ NDs (~25 nm) met gemengde anatase-rutil fasen (Fig. 1). DLS toont hydrodynamische diameters van 21 ± 7 nm (SiO₂) en 27 ± 12 nm (TiO₂) in water; groottes stijgen tot 29 ± 9 nm en 41 ± 14 nm, respectievelijk, in DMEM met 20% FBS na 96 uur, wat proteïne-corona vorming aangeeft. ζ-potentialen zijn −45 ± 3 mV (SiO₂) en −50 ± 3 mV (TiO₂) in water, worden negatiever in kweekmedia.

ND-opname

ICP-AES onthulde dosis- en tijdsafhankelijke internalisatie. TiO₂ NDs accumuleerden gemakkelijker, bereikend 8,2 ± 0,4 µg per 3,6 × 10⁵ cellen in Caco-2 na 72 uur en 9,7 ± 0,03 µg na 96 uur. In A549 was opname 5 ± 0,6 µg (72 uur) en 7,1 ± 0,1 µg (96 uur). SiO₂ NDs vertoonden lagere accumulatie, met name in A549 (2,6 ± 0,05 µg bij 72 uur). Over het algemeen tonen TiO₂ NDs hogere cellulaire opname over beide cellijnen.

Cellevensvatbaarheid, membraanschade en ROS

WST-8 assays toonden een bescheiden levensvatbaarheidsverlaging in beide cellijnen bij 45 µg/mL. Caco-2 levensvatbaarheid daalde ~40% na 72 uur en ~50% na 96 uur TiO₂-blootstelling; A549 vertoonde ~30% reductie alleen na 96 uur. LDH-vrijgave spiegelde deze trends, piekend bij ~160% van controle na 96 uur in Caco-2. ROS-generatie steeg dosis-afhankelijk, met TiO₂ NDs tot 165% DCF-DA fluorescentie in Caco-2 inducerend (Fig. 4).

Antioxidante respons en lipideperoxidatie

SOD-activiteit daalde dosis- en tijdsafhankelijk. In Caco-2 daalde SOD van 4,1 ± 0,2 U/mL (controle) tot 1,0 ± 0,3 U/mL na 96 uur 45 µg/mL TiO₂. SiO₂-blootstelling verlaagde SOD tot 1,4 ± 0,1 U/mL. MDA-niveaus stegen overeenkomstig in beide cellijnen, wat verhoogde lipideperoxidatie aangeeft.

Actine-cytoskelet herstructurering

Confocal imaging onthulde verstoring van strakke juncties en uitgerekte morfologie in Caco-2, en verminderde cel-cel contacten in A549 bij ND-behandeling. Kwantitatieve analyse toonde geen significante verandering in geïntegreerde dichtheid (actine-hoeveelheid) maar een uitgesproken afname in coherentie: Caco-2 coherentie daalde van 0,26 ± 0,03 (controle) tot 0,09 ± 0,02 (TiO₂). A549 coherentie daalde van 0,40 ± 0,03 tot 0,16 ± 0,04. K/C-verhoudingen stegen in Caco-2 (0,40 → 0,62) en daalden in A549 (0,55 → 0,23), wat uiteenlopende morfologische reacties reflecteert.

Mechanische eigenschappen (Young's modulus)

AFM-metingen gaven contrasterende stijfheidsveranderingen. In Caco-2 daalde Young's modulus van 105 ± 25 kPa (kern) tot 27 ± 4 kPa na TiO₂-blootstelling; cytoplasmatische modulus daalde van 47 ± 21 kPa tot 18 ± 4 kPa. Integenstelling, A549 stijfheid steeg dramatisch: kernmodulus steeg van 129 ± 24 kPa tot 372 ± 60 kPa, en cytoplasmatische modulus van 147 ± 26 kPa tot 549 ± 40 kPa onder TiO₂-behandeling.

Discussie

Onze bevindingen tonen aan dat TiO₂ NDs, door hun kristallijne structuur en oppervlaktereactiviteit, sterkere cellulaire reacties provoceren dan amorfe SiO₂ NDs. De verhoogde opname, ROS-generatie en actine-reorganisatie correleren met significante veranderingen in celeelasticiteit—verzachting van Caco-2 cellen en versteviging van A549 cellen—wat suggereert dat er distincte mechanistische paden in epitheliale versus alveolaire contexten spelen. Dergelijke biomechanische veranderingen kunnen celmigratie, barrière-integriteit en potentiële tumorprogressie beïnvloeden. Het integreren van mechanische eindpunten met conventionele cytotoxiciteitsassays biedt een meer complete nanotoxicologische assessering.

Conclusie

SiO₂ NDs vertonen lagere cytotoxiciteit vergeleken met TiO₂ NDs. TiO₂-blootstelling induceert actine-herstructurering, gewijzigde K/C-verhoudingen en uiteenlopende mechanische reacties: verhoogde stijfheid in A549 en verminderde stijfheid in Caco-2. Deze biomechanische perturbaties benadrukken het belang van het evalueren van cytoskeletdynamica en celmechanica in nanotoxicologiestudies om potentiële pathologische uitkomsten te voorspellen.

Afkortingen

A549

Humane adeno-carcinoom alveolaire basale epitheele cellen

AFM

Atoomkrachtmicroscopie

ATP

Adenosinetrifosfaat

Caco-2

Humane epitheele colorectale adeno-carcinoom

CLSM

Confocal laser scanning microscopie

DAPI

4′,6′-Diamidino-2-fenylindol

DCF-DA

2′,7′-Dichloorfluoresceïne diacetaat

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

ENPs

Geingeneerde nanodeeltjes

FBS

Fetaal kalverseerum

HCl/HNO₃

Zoutzuur/salpeterzuur

ICP-AES

Inductief gekoppelde plasma atoomspectroscopie

LDH

Lactaatdehydrogenase

MDA

Malondialdehyde

NH₄OH

Ammoniumhydroxide

NDs

Nanodeeltjes

PBS

Fosfaatgepufferde zoutoplossing

ROIs

Regio's van interesse

ROS

Reactieve zuurstofsoorten

SiO₂ NDs

Siliciumdioxide nanodeeltjes

SOD

Superoxidedismutase

TBA

Thiobarbituurzuur

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie

TEOS

Tetraethylorthosilicaat

TiO₂ NDs

Titandioxide nanodeeltjes

TTIP

Titaan(IV)isopropoxide

XRD

Röntgendiffractie